龟甲胶的快速制备工艺及其抗氧化活性研究

The Rapid Production Method and Antioxidant Activity of Turtle-Shell Glue

摘要: 以中华草龟为原料，探讨超高压技术对龟甲胶出胶率、提取时间、抗氧化活性的影响。采用300 MPa-15 min、300 MPa-30 min、500 MPa-15 min、500 MPa-30 min四种超高压条件对龟甲进行预处理制备龟甲胶，并测定其抗氧化活性。结果显示，与传统制备工艺相比，超高压技术可大大提高龟甲胶的生产效率，其中300 MPa-30 min超高压处理组的提取时间可缩短42%。此外，不同方法制备的龟甲胶皆具有抗氧化活性，四种超高压处理组对•OH的清除率均高于传统工艺组，最高达37.39%；500 MPa-15 min、300 MPa-15 min、500 MPa-30 min组对DPPH•的清除率高于传统工艺组，最高达76.76%；500 MPa-15 min、500 MPa-30 min组对ABTS+•的清除率高于传统工艺组，最高达97.33%。本研究可为龟甲胶的快速制备工艺提供理论依据。

Abstract: In this study, Chinese turtles were served as the experimental material to analyze the effect of ultra-high pressure on the yield, extraction time and antioxidant activity of turtle-shell glue. The turtle-shell were pretreated by four kinds of ultra-high pressure treatments: 300 MPa-15 min, 300 MPa-30 min, 500 MPa-15 min and 500 MPa-30 min, which were made into turtle-shell glue afterwards. The scavenging activity between turtle-shell glue made by ultra-high pressure and the traditional method was detected as well. The results showed that, in comparison with the traditional method, ultra-high pressure could greatly improve the production efficiency, and the extraction time of 300 MPa-30 min group could be reduced by 42%. Additionally, the turtle-shell glue made by different methods all had antioxidant activity. The clearance rates of •OH of four ultra-high pressure groups were higher than that of the traditional group, with a maximum of 37.39%; the clearance rates of DPPH• of 500 MPa-15 min, 300 MPa-15 min, and 500 MPa-30 min groups were higher than that of the traditional group, with a maximum of 76.76%; the clearance rates of ABTS+• of 500 MPa-15 min and 500 MPa-30 min groups were higher than that of the traditional group, with a maximum of 97.33%. This study can provide a theoretical basis for the rapid production method of turtle-shell glue.

1. 引言

龟甲胶(Colla Carapacis et Plastri Testudinis)是乌龟的背甲及腹甲经过熬煎浓缩制成的固体胶块，富含骨胶原、酶和多种氨基酸等 [1] ，具有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩的功效，临床上用于治疗阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、筋骨痿软、心虚健忘等症( [2] : pp. 187-188)。于冬梅 [3] 运用龟甲复方治疗阴虚血热型崩漏，有效率达96.3%。常茹等 [4] 利用龟甲胶联合塞来昔布胶囊治疗膝骨性关节炎，总有效率达93.33%。它的传统制法是将龟甲漂泡，洗净，分次水煎，滤过，合并滤液(或加入白钒细粉少许)，静置，滤取胶液，浓缩(可加适量的黄酒、冰糖及豆油)至稠膏状，冷凝，切块，晾干即得 [2] 。但由于龟甲胶的传统生产工艺工序复杂，且胶原蛋白的提取较为困难，出胶率低，很大程度上限制了企业的生产工作效率 [2] 。故如何改进生产工艺以简化生产步骤、提高龟甲胶的生产效率，一直是龟甲胶研发企业的重点研究方向。

超高压技术是一种在常温或低温条件下采用100 MPa以上的压力处理样品，在一定时间内影响样品结构、理化性质的一种技术手段 [5] 。研究表明，高压可通过破坏稳定许多蛋白质天然构象的非共价相互作用的平衡来诱导蛋白质变性，对骨胶原蛋白的溶解度有一定的影响 [6] ，从而提高胶原蛋白提取得率，缩短提取时间。Gomez-Guillen等 [7] 研究表明在热力处理之前，适当的超高压处理条件能够提高胶原蛋白得率。于小栋 [8] 采用超高压耦合酸酶法提取牦牛骨胶原蛋白，得率高达58.95%。超高压食品加工技术在提取胶原蛋白方面的优秀表现为龟甲胶制备技术的改进提供了可能性。本文探讨超高压技术对龟甲胶出胶率、提取时间、抗氧化活性的影响，为龟甲的进一步利用及龟甲胶的快速制备工艺提供一定的理论依据。

2. 材料与仪器

2.1. 实验原料

中华草龟龟甲(腹甲) (扬州茂达生态水产养殖有限公司)。

2.2. 实验试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) (上海如吉生物科技发展有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；硫酸亚铁(中国医药集团上海化学试剂公司)；水杨酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；过氧化氢(福州飞净生物科技有限公司)；2,2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) (上海源叶生物科技有限公司)；过硫酸钾(河南腾升商贸公司)；磷酸缓冲溶液(兰杰柯科技有限公司Biosharp品牌)；抗坏血酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为分析纯。

2.3. 实验仪器与设备

SHPP-10L超高压设备(山西力德福科技有限公司)；不锈钢锅(九阳Joyoung电器官网)；多功能电磁炉(广东美的生活电器制造有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BS224S电子天平(德国赛多利斯SARTOURIUS)；优普超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)；HH-8型数显恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；酶标仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)等。

3. 实验方法

3.1. 龟甲胶的制备

3.1.1. 传统方法制备龟甲胶

取出干燥龟甲，称重后放入不锈钢锅中，加水1200 mL浸没龟甲，电磁炉2200 W煮沸后调至1000 W保持锅内水微沸，每15 min加水300 mL，直至龟甲可轻松掰碎成15 mm × 15 mm小块(此即水煮提取终点)，并记录提取时长。将龟甲碎片捞出，趁热利用两层纱布将锅内胶液过滤至烧杯中，放入温度已预先设置为55℃的电热鼓风干燥箱中进行干燥浓缩。胶液约剩50 mL时，转移至24 mm 9格硅胶模具中，继续蒸干水分，每隔1 h取出，放入干燥器皿中冷却30 min后称重，直至恒重，记录龟甲胶质量并计算出胶率，计算公式如下：

$出胶率=\frac{龟甲胶质量}{龟甲质量}\times 100\%$

3.1.2. 超高压预处理制备龟甲胶

将干燥龟甲装袋密封后寄至山西力德福科技有限公司，选取300 MPa-15 min、300 MPa-30 min、500 MPa-15 min、500 MPa-30 min四种不同压力和保压时间组合条件对龟甲进行预处理，按照“3.1.1”项下方法制备龟甲胶，记录胶液提取时长、龟甲质量、龟甲胶质量，并计算出胶率。

3.2. 龟甲胶抗氧化活性的测定

3.2.1. 样品的处理

将“3.1.1”和“3.1.2”项下方法制备的龟甲胶样品分别配置成质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的龟甲胶溶液，并同样配置质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的Vc溶液作为阳性对照。

3.2.2. DPPH自由基清除能力测定

参照孙泽坤 [9] 的方法略有修改，取2 mL上述不同浓度龟甲胶样品溶液与2 mL 0.2 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液混匀室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值A₁；以无水乙醇代替DPPH-无水乙醇溶液作为空白组，测定吸光值A₀；以蒸馏水代替样品溶液作为对照组，测定吸光值A₂。每个样品做3组平行，并以Vc作为阳性对照。样品对DPPH自由基清除率计算公式如下：

$\text{DPPH}自由基清除率=\frac{1-\left(A_1-A_0\right)}{A_2}\times 100\%$

3.2.3. ABTS自由基清除能力测定

参照冯晓文等 [10] 的方法略有修改，将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等比例混合，室温避光反应12~16 h，制成ABTS储备液。用0.01 mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲溶液稀释，使其在波长734 nm处的吸光值为0.70 ± 0.02，制得ABTS工作液。

取0.1 mL上述不同浓度龟甲胶样品溶液与2.8 mL ABTS工作液混匀室温下避光反应10 min，于734 nm处测定吸光值A₁；以磷酸缓冲溶液代替ABTS工作液作为空白组，测定吸光值A₀；以蒸馏水代替样品溶液作为对照组，测定吸光值A₂。每个样品做3组平行，并以Vc作为阳性对照。样品对ABTS自由基清除率计算公式如下：

$\text{ABTS}自由基清除率=\frac{1-\left(A_1-A_0\right)}{A_2}\times 100\%$

3.2.4. 羟自由基清除能力测定

参照徐卉等 [11] 的方法略有修改，于试管中按顺序加入1 mL 4.5 mmol/L FeSO₄溶液，1 mL 9 mmol/L水杨酸–乙醇溶液及2 mL上述不同浓度龟甲胶样品溶液，混匀后加入1 mL 8.8 mmol/L H₂O₂溶液，37℃水浴30 min，于510 nm处测定吸光值A₁；以蒸馏水代替水杨酸–乙醇溶液作为空白组，测定吸光值A₀；以蒸馏水代替样品溶液作为对照组，测定吸光值A₂。每个样品做3组平行，并以Vc作为阳性对照。样品对羟自由基清除率计算公式如下：

$羟自由基清除率=\frac{1-\left(A_1-A_0\right)}{A_2}\times 100\%$

3.3. 数据统计分析

采用SPSS 27.0统计软件分析差异的显著性，P < 0.05，差异显著。使用Origin 2021软件绘制图像。使用Prism 9.5.1软件计算样品对自由基清除率的IC₅₀值。

4. 结果与分析

4.1. 超高压处理对龟甲胶出胶率和提取时间的影响

由图1可知，300 MPa-30 min处理组的出胶率达到14.21%，显著高于其他超高压处理组(P < 0.05)，但相比传统工艺组，此作用压力与时间组合对于出胶率变化无显著影响(P > 0.05)。当保压时间相同，随着作用压力从300 MPa向500 MPa增长，出胶率增长不显著(P > 0.05)或有所降低，这是由于超高压较大压力的处理使胶原蛋白内部结构改变形成新的稳定结构，继续增加压力对提高出胶率的贡献不大 [12] 。当作用压力相同，随着保压时间从15 min向30 min延长，出胶率均显著增加(P < 0.05)，这是由于保压时间较短时，胶原蛋白内部的非共价键未能被完全破坏，而随着时间的延长，胶原蛋白分子内部非共价键被破坏到位，大大有利于胶原蛋白的提取 [12] 。

由图2可知，相比传统工艺组，超高压处理可显著降低胶液提取时间(P < 0.05)，且300 MPa-30 min、500 MPa-30 min处理组的胶液提取时间均缩短了近50%，李圣桡等 [13] 的研究表明，采用超高压辅助提取蓝靛果花青素具有提取时间短、提取量多等优点。综合研究结果，确定较适超高压作用压力和时间组合为300 MPa-30 min。

Figure 1. Effect of ultra-high pressure on the yield of turtle-shell glue

图1. 超高压处理对龟甲胶出胶率的影响

Figure 2. Effect of ultra-high pressure on the extraction time of turtle-shell glue

图2. 超高压处理对龟甲胶提取时间的影响

4.2. 超高压处理对龟甲胶DPPH自由基清除率的影响

由图3可知，500 MPa-15 min处理制备的龟甲胶对DPPH自由基的清除率随浓度的增大一直呈持续增长的趋势，在浓度为0.5 mg/mL时，清除率为41.87%，在浓度为5 mg/mL时，清除率达到76.76%。300 MPa-15 min组对DPPH自由基的清除率从浓度0.5 mg/mL时的30.66%增加到浓度5 mg/mL时的63.78%。500 MPa-30 min组对DPPH自由基的清除率在浓度小于2 mg/mL时与传统工艺组相近，在浓度大于2 mg/mL时显著增大，但仍低于500 MPa-15 min组，在浓度大于4 mg/mL后增长幅度趋缓，在浓度5 mg/mL时，清除率达到61.55%。300 MPa-30 min组在浓度0.5~5 mg/mL范围内，清除率由15.02%上升到41.21%，传统工艺组由29.61%上升到47.86%。

为了更好地说明不同制备方法对DPPH自由基清除率的影响，本文计算样品半抑制浓度(IC₅₀值)，由表1可知，500 MPa-15 min组的IC₅₀值为1.375 mg/mL，均低于其他超高压处理组，结合说明在500 MPa-15 min条件下制备的龟甲胶对DPPH自由基的清除能力最强。这是由于龟甲中本身含有半胱氨酸 [14] ，其具有较好的DPPH自由基清除能力。超高压处理会破坏胶原蛋白三四级结构，其疏水及离子结合会因体积的缩小而被切断，导致蛋白质结构伸展，产生更多的游离半胱氨酸 [15] ，其可被转化为半胱氨酸。孟继坤等 [16] 的研究结果与本研究一致，相较于传统浸提法，超高压法提取的铁皮石斛多糖对DPPH自由基的清除率更高。

Figure 3. Effect of ultra-high pressure on DPPH• scavenging activity of turtle-shell glue

图3. 超高压处理对龟甲胶DPPH自由基清除率的影响

Table 1. The IC50 of DPPH• scavenging by different samples

表1. 不同样品清除DPPH自由基的IC₅₀值

4.3. 超高压处理对龟甲胶ABTS自由基清除率的影响

由图4可知，在浓度0.5~5 mg/mL范围内，不同方法制备的龟甲胶对ABTS自由基的清除率均随浓度的升高而持续增大，在20.76%~97.33%内增长。在浓度0.5~2 mg/mL范围内，5种样品对ABTS自由基清除率的增速相近，2 mg/mL后，500 MPa-15 min、500 MPa-30 min组较传统工艺、300 MPa-15 min和300 MPa-30 min组增速稍逊，3 mg/mL后反超，在浓度5 mg/mL时5种样品对ABTS自由基的清除率均相近，且接近同浓度Vc溶液，可见龟甲胶具有较强的ABTS自由基清除能力。由表2可知，不同样品IC₅₀值：300 MPa-30 min组 > 300 MPa-15 min组 > 传统工艺组 > 500 MPa-30 min组 > 500 MPa-15 min组，可得500 MPa-15 min条件下制备的龟甲胶对ABTS自由基的清除能力最强。不同方法制备的龟甲胶对ABTS自由基清除能力均较强是因为研究发现半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸这三种氨基酸具有较强的ABTS自由基清除活性，活性最强的氨基酸是酪氨酸 [17] ，而龟甲胶中已分离鉴定出17种氨基酸，包括半胱氨酸、酪氨酸等 [14] 。王鸥等 [18] 的研究结果与本研究一致，在一定的压力范围内，经超高压处理后的蓝莓对ABTS自由基的清除能力随着处理压力的增大而增大。

Figure 4. Effect of ultra-high pressure on ABTS+• scavenging activity of turtle-shell glue

图4. 超高压处理对龟甲胶ABTS自由基清除率的影响

Table 2. The IC50 of ABTS+• scavenging by different samples

表2. 不同样品清除ABTS自由基的IC₅₀值

4.4. 超高压处理对龟甲胶羟自由基清除率的影响

由图5可知，300 MPa-15 min组在浓度0.5~5 mg/mL范围内，对羟自由基的清除率从11.77%上升到37.39%，且在浓度0.5~3 mg/mL 范围内增加缓慢，后3~4 mg/mL较快。300 MPa-30 min组与300 MPa-15 min组清除率曲线相近，但从整体趋势来看还是略逊，对羟自由基的清除率从2.48%增长到35.87%，且在浓度0.5 mg/mL时清除率明显较低。500 MPa-15 min、500 MPa-30 min和传统工艺组对羟自由基的清除率整体上来看均低于300 MPa-15 min组，且上升趋势都较为缓慢。由表3可知，300 MPa-15 min组的IC₅₀值低于其他超高压处理组，结合说明在300 MPa-15 min条件下制备的龟甲胶对羟自由基的清除能力最强。羟自由基是已知活性氧对生物体毒性最强的一种自由基 [19] ，而蛋白序列中的甘氨酸、精氨酸、脯氨酸可能与羟自由基的清除能力有关 [11] ，郭尚伟等 [20] 的研究表明龟甲胶中本身含有这三种氨基酸，且甘氨酸和脯氨酸的含量较高，分别达17.96%和11.16%，因此其对羟自由基有一定的清除能力。徐树来等 [21] 的研究结果与本研究一致，较有机溶剂浸提法，超高压法提取的灵芝三萜对羟自由基的清除能力更强。

Figure 5. Effect of ultra-high pressure on •OH scavenging activity of turtle-shell glue

图5. 超高压处理对龟甲胶羟自由基清除率的影响

Table 3. The IC50 of •OH scavenging by different samples

表3. 不同样品清除羟自由基的IC₅₀值

5. 结论

传统工艺组龟甲胶的提取时间为24 h，300 MPa-15 min组为18.25 h，300 MPa-30 min组为13.875 h，500 MPa-15 min组为14.75 h，500 MPa-30 min组为12.5 h。随着超高压处理压力的增长及保压时间的延长，相比传统工艺组，龟甲胶的提取时间均显著降低(P < 0.05)，且300 MPa-30 min和500 MPa-15 min组的胶液提取时间皆缩短了近50%，其中300 MPa-30 min组的出胶率达到了14.21%，高于其他超高压处理组，大大提升了龟甲胶的生产效率。

四种超高压处理组对•OH的清除率均高于传统工艺组，最高达37.39%；500 MPa-15 min、300 MPa-15 min、500 MPa-30 min组对DPPH•的清除率高于传统工艺组，最高达76.76%；500 MPa-15 min、500 MPa-30 min组对ABTS+•的清除率高于传统工艺组，最高达97.33%。总体来说对龟甲胶自由基的清除效果，在相同处理压力下，保压15 min优于30 min，在相同保压时间下，500 MPa处理优于300 MPa，即在本研究探讨范围内，500 MPa-15 min处理制备的龟甲胶抗氧化活性最佳，这可能是由于不同超高压处理压力、保压时间对胶原蛋白内部非共价键的破坏程度不同，导致龟甲胶中抗氧化氨基酸的游离程度不同，从而使得龟甲胶的抗氧化活性有所差异。

基金项目

扬州大学大学生科技创新基金项目(X20220910)。

NOTES

^*通讯作者。