结核病可能在增加FHIT甲基化率的同时会阻碍EGFR突变

Tuberculosis May Hinder EGFR Mutations While Increasing the Rate of FHIT Methylation

摘要: 背景：流行病学研究表明肺癌与结核病之间存在因果关系，尤其患有结核病的患者往往更容易患上肺腺癌，但其中的作用机制尚不清楚。前期研究发现，肺结核患者中EGFR突变和FHIT甲基化水平较高，本研究旨在查明肺腺癌和结核病患者中EGFR突变和FHIT甲基化的遗传相关性。方法：在肺腺癌和肺结核患者中，分析了表皮生长因子受体(EGFR)突变及FHIT基因的甲基化状态，并检查了结核病状态与遗传/表观遗传变异之间的关系。结果：结核患病状态与EGFR突变频率有很强的相关性，而结核患病状态与FHIT甲基化之间的关系较弱。EGFR突变与FHIT甲基化之间呈反相关关系。结论：结核病可能在增加FHIT甲基化率的同时会阻碍EGFR突变，导致患结核病后发展肺腺癌的患者对EGFR抑制剂治疗疗效不佳。

Abstract: Background: Epidemiological studies have shown a causal relationship between lung cancer and tuberculosis, especially in patients with tuberculosis, who are more likely to develop lung adenocar-cinoma, but the mechanism of action is not clear. Previous studies have found that EGFR mutation and FHIT methylation levels are higher in pulmonary tuberculosis patients, and this study aims to identify the genetic association of EGFR mutation and FHIT methylation in lung adenocarcinoma and tuberculosis patients. Methods: In patients with lung adenocarcinoma and tuberculosis, epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations and methylation status of FHIT gene were analyzed, and the relationship between tuberculosis status and genetic/epigenetic variants was examined. Results: There was a strong correlation between tuberculosis prevalence and EGFR mutation frequency, while the relationship between tuberculosis prevalence and FHIT methylation was weak. There was an inverse correlation between EGFR mutations and FHIT methylation. Conclusion: Tuberculosis may hinder EGFR mutations while increasing the methylation rate of FHIT, resulting in poor response to EGFR inhibitor therapy in patients with lung adenocarcinoma after tuberculosis.

1. 引言

肺癌是与癌症相关的主要死亡原因。尽管在肺癌检测和治疗方面已经取得了进展，五年生存率仍然低于15%。中国是受肺癌影响最严重的国家之一，每年由肺癌导致的死亡患者超过80万例[1] [2]。肺癌主要分为两大组织学类型，即小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者包括肺腺癌(AC)、鳞状细胞癌(SCC)、大细胞癌等。肺腺癌在NSCLC中占主导地位，而且肺腺癌患者数量在不断增加。根据世界卫生组织的数据，2016年全球报告了1040万例结核病病例，导致了167万人死亡，其中60万人被确认为多药耐药结核病[3]。在中国，每10万人中有68例结核病，每年导致38,000人死亡。中国多药耐药结核病的发生率为6.6% [4]。新疆的发病率全国最高，估计每10万人中有181.42例。大约2~8%的结核病病例并发有肺癌[5]-[7]。结核病是肺癌的一个高风险因素。新兴的分子流行病学研究将肺结核与癌症进展中的特定基因突变联系起来[8] [9]。关于结核病和甲基化，各种报告建议在动物研究中存在DNA甲基化与致癌物之间的联系[10]-[12]。癌症通常涉及遗传和表观遗传变化。先前的研究报告显示，患有肺腺癌的患者通常表现出EGFR突变的迹象[13]，而与结核病相关的某些基因通过表观遗传修饰表现出甲基化。然而，基于结核病状态的肺腺癌中独特的甲基化模式数据信息不足。带有突变表皮生长因子受体的肺腺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)显示出显著的反应，这表明存在显著的生存优势。酪氨酸激酶抑制剂治疗肿瘤的效果主要取决于EGFR突变和基因扩增的状态。该研究旨在阐明有无肺结核的肺腺癌患者的EGFR突变以及结核病特异性FHIT抑癌基因的甲基化状态，研究了结核病状态与遗传突变和表观遗传改变之间的关联。

2. 研究方法

本研究涉及研究群体的检查和DNA提取。通过手术切除获得了60个肺部标本，经医院病理诊断后，参与者提供书面知情同意书。样品在−80℃冷冻保存，直到进一步分析。所有患者在手术前均未接受任何化疗或放疗，以防止因DNA损伤导致的细胞周期蛋白变化。

2.1. 患者分组

2.1.1. 肺结核组(组A)

在2018至2020年期间，我们收集了20例经病理确诊的肺结核组织。纳入的患者在新疆自治区胸科医院接受了手术切除或支气管镜检查，均为中老年肺结核患者。20例患者中，12例为男性，8例为女性，年龄在435至76岁之间，平均年龄为60.4岁。在20例患者中，3例为新诊断的结核病例，17例为已接受过治疗的病例。抗酸染色涂片结果显示，6例为阳性，14例为阴性。

2.1.2. 腺癌组(组B)

在2018至2020年期间，我们从在新疆自治区胸科医院接受手术切除或支气管镜检查并经病理确诊的患者中获得了20例肺癌组织。我们的样本包括13名男性和7名女性，平均年龄为60.4岁(年龄范围为46至78岁)。根据2015年WHO肺癌分类标准，参与者根据2017年第八版UICC肺癌分期指南被分为6例I + II期和14例III + IV期。肿瘤直径 ≤ 3 cm的病例有7例，≥3 cm的病例有13例。

2.1.3. 结核与肺腺癌组(组C)

在2018至2020年期间，我们收集了20例肺结核和肺腺癌经病理确认的组织，这些患者在新疆自治区胸科医院接受了手术切除或支气管镜检查。纳入标准包括中老年患者，须符合肺结核和肺癌的诊断标准，或有结核病史。该组在组织学类型、分级和病理分期方面具有多样性。研究包括8名男性和12名女性，平均年龄为61.3岁(年龄范围为47至81岁)。在16例病例中，结核和肿瘤位于同一侧肺部，4例病例的结核和肿瘤位于对侧肺部。

排除标准包括：近期心肌梗塞，不稳定性心绞痛，严重器官并发症或衰竭，阿尔茨海默病或医学证明的精神疾病。无法支持支气管镜检查或手术的患者也被排除在外。最终，过去或疑似HIV感染的患者未被纳入。

2.2. 基因组DNA提取

使用SepaGene试剂盒进行基因组DNA提取。通过PCR-单链构象多态性(SSCP)和直接测序分析EGFR第19，20和21外显子的突变。直接测序涉及使用SSCP检测到的移位带的小凝胶片段。使用遗传分析仪(PE Applied Biosystems, CA, USA)进行凝胶电泳、数据收集和分析[14]。

使用甲基化特异性PCR (MSP)确定FHIT的甲基化状态。在进行MSP之前，DNA样品经过重亚硫酸盐处理。MSP引物序列存档可查[15]。使用未甲基化的DAPK引物集验证所有DNA样品的重亚硫酸盐修饰。

2.3. 统计分析

使用卡方检验或Fisher确切概率法进行统计分析。使用IBMSPSS24.0软件程序(芝加哥，IL，USA)分析所有数据。p值小于0.05被用作确定统计显著性的阈值。

3. 结果

本次实验是qRT-PCR检测各组中EGFR-C-G2361A基因表达水平。每个样本三重复，如图1所示为EGFR-C-G2361A基因扩增曲线和基因熔解曲线，可以看出样本均进行了良好的扩增过程，大多数曲线均为单峰，不存在非特异性扩增。

结果显示，在所有患者中，有25例表现出EGFR突变(其中10例为结核病患者，15例为非结核病患者)，占病例的42%，而20例患者展示了FHIT甲基化(其中17例为结核病患者，7例为非结核病患者)。同时，EGFR和FHIT的蛋白质表达在肺腺癌患者中显著高于肺腺癌加结核病患者。在表现出EGFR突变的患者中，16例显示出第19外显子的突变，10例显示出第20外显子的突变，12例显示出第21外显子的突变。在肺腺癌患者中，第21和第19外显子的EGFR突变频率显著高于肺腺癌加结核病患者，而在第20外显子的EGFR突变频率在肺腺癌患者与肺腺癌加结核病患者间没有显著差异。FHIT基因表现出甲基化，发现结核病状态与EGFR突变频率之间存在显著的负相关关系(p < 0.001)，而结核病状态与FHIT甲基化之间存在显著正相关关系(p < 0.01)。此外，FHIT甲基化频率随着结核病状态的增加而增加，而EGFR突变频率随着结核病状态的增加而减少。EGFR突变与FHIT甲基化之间表现出相反的相关性。

Figure 1. EGFR-C-G2361A gene amplification curve and melting curve

图1. EGFR-C-G2361A基因扩增曲线和熔解曲线

RT-PCR结果实验结果显示，与A组相比，EGFR蛋白在B组中表达量明显升高，差异有统计学意义(p < 0.05)；在C组中表达量差异不明显。与B组相比，EGFR在C组中表达量降低，但差异不具有统计学意义(p > 0.05)，见表1。

Table 1. Gray value (x ± SD) of EGFR and Fhit protein bands in each group

表1. 各组中EGFR、Fhit蛋白条带灰度值(x ± SD)

分组	EGFR	Fhit
A组	2.496 ± 0.910	1.415 ± 0.701
B组	3.236 ± 0.950	2.129 ± 0.809
C组	2.615 ± 1.026	1.576 ± 0.800
F	3.068	4.246
p	0.0552	0.0197

Table 2. Expression levels of EGFR and FHIT proteins (x ± SD)

表2. EGFR和FHIT蛋白表达量(x ± SD)

分组	EGFR	FHIT
A组	281.9 ± 157.0	215.4 ± 68.79
B组	393.3 ± 139.7	381.6 ± 117.1
C组	315.1 ± 44.82	329.3 ± 113.6
F	3.829	12.44
p	0.0282	0.0001

本实验通过免疫组化实验方法对A组、B组、C组样本中EGFR和FHIT蛋白的表达水平进行评价。实验结果显示，与A组相比，EGFR和FHIT蛋白在B组和C组中的表达量上升；与B组相比，EGFR和FHIT蛋白在C组中的表达量下降(见表2)。

4. 讨论

近来我们对细胞信号通路的理解取得了重大进展，这些进展揭示了抑制细胞死亡、促进细胞分裂并导致肿瘤形成的遗传和调控异常。一个重要的发现是表皮生长因子受体(EGFR)，这是一种在正常上皮组织、间叶组织和神经组织中表达的跨膜受体酪氨酸激酶蛋白。EGFR的过表达已被报告并与多种人类恶性肿瘤的发展有关，包括非小细胞肺癌(NSCLC)。具有突变表皮生长因子受体的肺腺癌对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)表现出显著的反应，表明存在显著的生存优势。EGFR突变和基因扩增的状态可能在决定哪些肿瘤将有效响应酪氨酸激酶抑制剂方面起着关键作用[16] [17]。

在确定哪些肿瘤将受到酪氨酸激酶抑制剂的影响时，考虑EGFR突变和基因扩增状态非常重要。EGFR过表达与包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多种人类恶性肿瘤的发展有关[18]。研究表明，具有EGFR表达的NSCLC患者具有较低的生存率、频繁的淋巴结转移以及对化疗的反应不佳。具有突变表皮生长因子受体的肺腺癌对酪氨酸激酶抑制剂反应良好[19]-[21]。然而，对于不吸烟的亚洲女性肺腺癌患者，尤其是那些患有细支气管肺泡癌的患者，存在显著的生存优势[22]。最近有两种口服抗癌药物，吉非替尼和厄洛替尼被批准用于晚期非小细胞肺癌的治疗，并且在一些肺癌中发现了EGFR突变[23]。从那时起，人们就开始努力寻找能够预测这些药物反应率的临床、形态和分子因素。在非小细胞肺癌病例中，43~89%的病例观察到EGFR的过表达或EGFR的细胞内突变。其他研究报告称，四分之一的NSCLC病例在EGFR酪氨酸激酶域中存在突变，并且这些突变与75%的病例中受体的增加表达有关[24]。已知的大多数EGFR酪氨酸激酶域突变涉及第19外显子中的短缺失或第21外显子中的点突变[25]。我们研究的结果表明，在继发于结核病的肺腺癌患者中，EGFR突变显著更频繁，这表明在继发于结核病的肺腺癌患者中，可能对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂反应不佳，导致较低的生存率、频繁的淋巴结转移和对化疗的反应不佳。

本研究中关于结核病与突变和甲基化的模式观察到，FHIT甲基化的频率与结核病状态呈正相关，而EGFR突变频率随着结核病状态的增加而呈反比例减少。在结核病和非结核病肺腺癌患者中观察到的EGFR独特甲基化和突变模式可能与结核病患者对致癌物暴露的易感性有关。我们的假设是，根据这些发现，结核病可能在增加FHIT甲基化率的同时会阻碍EGFR突变的发展。

关于肺腺癌和EGFR突变对有结核病史患者的发病率和预后的影响的报告有限。一项在台湾进行的研究发现，在显示有既往结核病肺部病变影像学证据的肺腺癌患者中，EGFR突变的发生率较高(OR: 1.83 [0.92~3.62]) [26]。另一项回顾性研究分析了台湾地区“国民健康保险研究数据库”，包含1996年至2000年期间接受EGFR-TKIs治疗的8265名肺癌患者。该研究报告称，结核病史与男性患者对EGFR-TKIs治疗的临床反应较差有关，但与女性患者的临床反应较好有关[27]。

在本研究中，结核病患者的FHIT甲基化具有较高的趋势，而非结核病患者则在EGFR突变的发展中表现出较低的趋势。因此，FHIT甲基化可能会抑制EGFR突变。研究报告称，结核病患者的甲基化率和平均甲基化指数均高于非结核病患者，这表明异常甲基化与结核病状态有关[28]-[31]。因此，结核病的总体甲基化率的降低表明甲基化是一种完全可逆的表观遗传变化，不影响DNA编码序列[32]。从这个角度来看，可以推断出EGFR突变的抑制可能是由于FHIT的甲基化，这解释了结核病后EGFR突变的增加。

然而，需要注意的是，本研究受制于样本量较小，约25%的病例未显示任何EGFR突变或FHIT甲基化的证据。需要进一步的研究来确认这些发现。总而言之，在结核病患者的肺腺癌发展中存在两个不同的通路，即EGFR突变和KRAS突变/FHIT甲基化。

5. 结论

结核病可能在增加FHIT甲基化率的同时会阻碍EGFR突变，导致患结核病后发展肺腺癌的患者对EGFR抑制剂治疗疗效不佳。

伦理批准

本研究已获得新疆维吾尔自治区胸科医院伦理委员会(乌鲁木齐，中国)的批准。本研究中使用的方法符合相关指南和规定。所有参与者或16岁以下参与者的监护人均签署了书面同意书。

基金项目

本研究得到了新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2020D01A107)的资助。

致 谢

本研究得到了中华人民共和国国家科技计划的支持。我们感谢新疆维吾尔自治区第六人民医院的当地工作人员在数据收集过程中的辛勤工作。

NOTES

^*通讯作者。