基于网络药理学和分子对接探讨桂枝茯苓丸治疗慢性心力衰竭的作用机制

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking, the Mechanism of Action of Guizhi Fuling Pill in the Treatment of Chronic Heart Failure Being Explored

摘要: 目的：运用网络药理学和分子对接技术探究桂枝茯苓丸治疗慢性心力衰竭的作用机制。方法：通过TCMSP数据库筛选桂枝茯苓丸的活性成分及靶点；使用GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD及DrugBank数据库获取慢性心力衰竭相关靶点；采用Cytoscape3.8.0软件绘制“药物–疾病–成分–靶点”网络；通过STRING数据库构建蛋白互作网络关系，并使用Cytoscape及R软件筛选核心靶点；利用R软件进行GO和KEGG富集分析；运用AutoDock Vina软件进行分子对接。结果：桂枝茯苓丸治疗慢性心力衰竭的核心化学成分为槲皮素、山柰酚、黄芩素等；核心靶点为AKT1、TP53、MYC、MAPK1等；主要通路为脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、NF-κB信号通路等；分子对接显示核心活性成分与核心靶点之间结合稳定。结论：桂枝茯苓丸通过多成分、多靶点、多通路治疗慢性心力衰竭。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of action of Guizhi Fuling Pill in the treatment of chronic heart failure by using network pharmacology and molecular docking technology. Methods: The active ingredients and targets of Guizhi Fuling Pill were screened through the TCMSP database. GeneCards, OMIM, PharmGKB, TTD and DrugBank databases were used to obtain targets related to chronic heart failure. Cytoscape 3.8.0 software was used to draw the “drug-disease-component-target” network. The protein-protein interaction network was constructed through the STRING database, and the core targets were screened by Cytoscape and R software. R software was used for GO and KEGG enrichment analysis; molecular docking was performed using AutoDock Vina software. Results: The core chemical components of Guizhi Fuling Pill in the treatment of chronic heart failure were quercetin, kaempferol, baicalein, etc. The core targets are AKT1, TP53, MYC, MAPK1, etc.; the main pathways are lipid and atherosclerosis, fluid shear stress and atherosclerosis, AGE-RAGE, IL-17, TNF, HIF-1, NF-κB signaling pathway, etc. Molecular docking shows stable binding between the core active ingredient and the core target. Conclusion: Guizhi Fuling Pill is used to treat chronic heart failure through multi-component, multi-target and multi-pathway.

1. 引言

心力衰竭(Heart Failure, HF)简称心衰，是由于心脏的结构和(或)功能异常改变，影响心室的收缩和(或)舒张功能，以呼吸困难、乏力和肢体水肿为主要症状的临床综合征[1]，是各种心血管疾病进展至终末期的表现。多数新发心力衰竭会发展为慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure, CHF)，经过治疗后症状可能会稳定数月至数年，即便在症状稳定的慢性阶段，患者仍面临显著的临床恶化和死亡风险[2]。心衰已成为全球性公共卫生问题，据统计发达国家心衰患病率为1.0%~2.0% [3]。目前我国心衰患病人数890万人，心血管病现患病人数3.3亿万[4]。肾素–血管紧张素系统抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂、钠–葡萄糖协同转运蛋-2抑制剂作为CHF药物治疗的“新四联”[5]，然而，这些药物联合治疗的总体疗效仍不尽如人意，亟需探索更多有效且安全的治疗策略和新药。

CHF属于中医“心衰”范畴，其基本病机是本虚标实，气血阴阳虚衰为本，水饮、瘀血为标[6]。心主血脉，如环无端，心气、心阳亏虚鼓动无力则血行不畅，血脉瘀滞，故在CHF发生发展过程中，血瘀贯穿始终[7]。桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁五味药组成，为治疗瘀血证经方。临床上桂枝茯苓丸治疗CHF取得显著的疗效。现代研究表明，桂枝茯苓胶囊可以抑制NF-κB及MMP-2转录及蛋白表达，改善心肌微小血管异常改变[8]。有研究发现，桂枝茯苓丸通过降低TGF-β和Ang Ⅱ的表达，从而减轻慢性心衰大鼠的心肌损伤[9]。关于桂枝茯苓丸治疗心血管疾病的作用机制研究较少，故本研究旨在通过网络药理学和分子对接技术，筛选桂枝茯苓丸治疗CHF的有效活性成分及其作用靶点，构建活性成分–靶点–疾病网络，预测核心靶点和信号通路，探讨桂枝茯苓丸治疗CHF过程中的作用机制。

2. 材料与方法

2.1. 桂枝茯苓丸活性成分与靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TSCMSP)以“桂枝”“茯苓”“牡丹皮”“赤芍”“桃仁”为关键词进行检索。以OB (Oral Bioavailability) ≥ 30%，DL (Drug Like) ≥ 0.18为筛选标准，得到药物的有效成分及其相关靶点。在uniprot数据库(http://www.uniprot.org)获得标准化基因名。

2.2. 慢性心力衰竭疾病靶点与“疾病–药物”交集基因

在GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://omim.org/)、PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)、TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank (http://go.drugbank.com/)数据库检索“chronic heart failure”，GeneCards数据库设置relevance score ≥ 1.0。运用R4.0.2软件剔除重复数据并整合疾病靶点，再利用R软件获取药物–疾病交集基因并绘制Venn图。

2.3. 构建“药物–成分–靶点”网络关系图

将药物活性成分、药物与疾病交集基因导入Cytoscape3.8.0软件，构建桂枝茯苓丸治疗CHF的“药物–成分–靶点”网络。

2.4. 构建蛋白互作网络及筛选核心基因

通过STRING (https://cn.string-db.org/)导入药物与疾病交集基因，Score设置为0.9，隐藏游离节点，构建PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape3.8.0软件利用CytoNVA插件及R软件筛选核心靶点。

2.5. GO功能和KEGG通路富集分析

将药物与疾病交集基因的symbol转换为基因ID，并使用R软件对GO功能、KEGG通路和涉及的相关信号通路进行可视化分析。

2.6. 分子对接

在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载药物有效成分的2D结构；在uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)以及PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获得核心靶点3D结构，将核心靶点导入Pymol软件进行去除水分子和小分子配体的修饰。利用AutoDock Vina完成分子对接，运用Pymol进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 桂枝茯苓丸活性成分与靶点

经过检索，获得桂枝茯苓丸的活性成分共85个，其中桂枝7个，茯苓15个，牡丹皮11个，赤芍29个，桃仁23个。并筛选出638个有效成分对应靶点，其中桂枝74个，茯苓30个，牡丹皮237个，赤芍158个，桃仁139个。

3.2. 慢性心力衰竭疾病靶点与“疾病–药物”交集靶点

通过GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank数据库检索，分别得到11,892个、331个、16个、15个、13个慢性心力衰竭相关基因，去重整合得到11,918个疾病靶点。通过R软件获得188个药物有效成分与疾病交集靶点(图1)。

3.3. 构建“药物–成分–靶点”网络

使用Cytoscape软件绘制“药物–疾病–成分–靶点”网络关系图(图2)。该网络共有230个节点，422条边。右边矩形代表药物和疾病的交集基因，左边圆圈代表药物成分，其中绿色代表桂枝、蓝色代表茯苓、红色代表牡丹皮、紫色代表赤芍、黄色代表桃仁。结果显示，该方主要成分为槲皮素、山柰酚、黄芩素、豆甾醇、β-谷甾醇等。

Figure 1. Targets at the intersection of drugs and diseases

图1. 药物与疾病交集靶点

Figure 2. Drugs-components-targets diagram

图2. 药物–成分–靶点图

3.4. 构建蛋白互作网络及筛选核心靶点

构建PPI的网络关系图(图3)共有159个节点，964条边，平均节点度为12.13。利用CytoNCA对核心基因进行筛选，在R软件中选择Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC中位值作为筛选标准，从而确定核心基因，见图4。两轮筛选后获得10个核心基因，其中度值最高的四个基因分别是AKT1、TP53、MYC、MAPK1。

Figure 3. Protein-protein Interaction (PPI) network map

图3. PPI网络关系

(a)

(b)

(c)

Figure 4. Core genes

图4. 核心基因

3.5. 生物功能富集分析

GO富集分析共筛选出2450个条目。其中包括生物过程(BP)条目共2169条，主要与脂多糖反应(Response to Lipopolysaccharide)、活性氧反应(Response to Reactive Oxygen Species)、氧化应激反应(Response to Oxidative Stress)等相关；细胞组分(CC)条目共70条，主要与脂筏(Membrane Raft)、膜微区(Membrane Microdomain)、神经元细胞体(Neuronal Cell Body)等相关；分子功能(MF)条目共211条，主要与DNA结合转录因子结合(DNA-Binding Transcription Factor Binding)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA Polymerase II-Specific DNA-Binding Transcription Factor Binding)、类泛素蛋白连接酶结合(Ubiquitin-Like Protein Ligase Binding)等相关。见图5。

KEGG富集分析涉及181条通路，其中信号通路集中靶点居前30主要富集在脂质和动脉粥样硬化(Lipid and Atherosclerosis)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid Shear Stress and Atherosclerosis)、AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、NF-κB等通路。详见图6。每条通路富集多个基因，体现桂枝茯苓丸治疗CHF多靶点、多通路的特点。

根据KEGG富集分析结果选择HIF-1信号通路进行可视化分析。见图7。

Figure 5. Gene Ontology

图5. GO富集分析

Figure 6. Kyoto encyclopedia of genes and genomes

图6. KEGG富集分析

Figure 7. HIF-1 signaling pathway diagram

图7. HIF-1信号通路图

3.6. 分子对接

将核心成分槲皮素、山柰酚、黄芩素与核心靶点AKT1、TP53、MYC、MAPK1进行分子对接。受体与配体间自由能<−5 kcal/mol表明两者结合稳定[10]，自由能越低则结合越稳定。结果表明，靶点蛋白与药物活性成分之间自由能均<−5 kcal/mol (见表1)，其中与AKT1自由能最低的化合物为黄芩素(−9.55 kcal/mol)，与TP53自由能最低的化合物为黄芩素(−7.5 kcal/mol)，与MYC自由能最低的化合物为槲皮素(−8.6 kcal/mol)，与MAPK1自由能最低的化合物为槲皮素(−7.0 kcal/mol)、黄芩素(−7.0 kcal/mol)。通过Pymol软件对AKT1与黄芩素、TP53与黄芩素、MYC与槲皮素、MAPK1与槲皮素及黄芩素进行分子对接可视化处理，详见图8。说明靶点蛋白与药物活性成分之间具有良好的结合能力。

Table 1. Receptor binding energies of ligands and core target proteins of the active ingredients of Guizhi Fuling Pill (unit: kcal/mol)

表1. 桂枝茯苓丸有效成分配体与核心靶点蛋白受体的结合能(单位：kcal/mol)

化合物	AKT1	TP53	MYC	MAPK1
槲皮素	−9.3	−7.3	−8.6	−7.0
山柰酚	−9.3	−7.2	−8.2	−6.9
黄芩素	−9.5	−7.5	−8.1	−7.0

A：AKT1与黄芩素；B：TP53与黄芩素；C：MYC与槲皮素；D：MAPK1与黄芩素；E：MAPK1与槲皮素。

Figure 8. Molecular docking

图8. 分子对接

4. 讨论

CHF是各种心脏疾病的终末期阶段，其病因可分为两大类，即原发性心肌损害和心脏负荷过重[11]。中医认为心衰以“虚”“瘀”“水”为患，《素问·五藏生成篇》言：“诸血者，皆属于心。”桂枝茯苓丸出自《金匮要略》，为活血化瘀的经典方剂。桂枝茯苓丸的五味药均归心经，可治疗心脉瘀阻之症，其中桂枝辛温，通经散寒，化瘀通络；芍药酸凉，调和营血，养血化瘀；牡丹皮苦凉，清热凉血，化瘀泄热；桃仁苦温，通泄活血，化瘀散瘀；茯苓甘淡，利水渗湿，宁心定悸。诸药共奏活血化瘀之功。

本研究构建的“药物–疾病–成分–靶点”网络关系显示，槲皮素、山柰酚、黄芩素是桂枝茯苓丸治疗CHF的核心活性成分。槲皮素具有保护心血管的显著作用，在氧化应激条件下可促进一氧化氮的抗氧化作用、增强内皮非依赖性血管扩张、抑制粘附分子及其他炎症标志物的表达[12]。山奈酚是一种黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化活性[13]。有研究表明，山柰酚通过抑制NF-κB/MAPK的激活减轻心脏成纤维细胞中Ang II诱导的炎症以及通过激活AMPK/Nrf2途径减轻心脏成纤维细胞中Ang II诱导的氧化应激[14]。黄芩素是黄芩根茎的天然黄酮类提取物，可预防左心室心肌重塑[15]。现代药理研究结果表明，黄芩素能调节JAK-STAT1/4信号通路，在体内外均显著抑制CD4⁺T细胞分化为Th1细胞及IFN-γ的分泌，进而导致心脏组织中TNF-α和IFN-γ水平显著下降，并降低心肌细胞的凋亡率[16]。以上多项研究支持本研究分析结果，表明槲皮素、山柰酚、黄芩素可作为桂枝茯苓丸治疗CHF的核心活性成分。

本研究通过构建PPI蛋白互作网络筛选出桂枝茯苓丸治疗CHF排名居前4的核心靶点为AKT1、TP53、MYC、MAPK1。AKT又被称为蛋白激酶B，作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调节心肌细胞增生、心肌血管生成、葡萄糖代谢及细胞凋亡[17]。在哺乳动物中，存在三种蛋白激酶B亚型，分别是AKT1、AKT2和AKT3。研究表明，在心脏组织中，AKT1的激活能够抑制细胞凋亡，因此被认为对HF具有潜在的益处[18]。TP53是一种肿瘤抑制基因，它能在应激条件下对细胞凋亡进行调控[19]。研究表明，TP53诱导的糖酵解和细胞凋亡调节因子在心脏代谢和细胞命运的调控中发挥着重要作用[20]。Myc是一个高度多功能的转录因子，属于原癌基因家族，能够调节支持正常细胞的复制、分化、代谢以及凋亡过程的多个转录程序[21]。有研究发现，Myc驱动的转录通过上调阳性转录延伸因子的水平，重新激活成熟心肌细胞，进而引发显著的增殖反应，促进成人心肌细胞的再生，为心肌病的治疗提供新途径[22]。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可将细胞外信号转导至细胞内并诱导细胞生物反应，MAPK1属于MAPK家族[23]。MAPK1能够通过PI3K/AKT信号通路上调MALAT1的表达来增加心肌细胞的增殖[24]。桂枝茯苓丸通过以上核心靶点参与细胞的增值、分化及凋亡，减少对心肌细胞的损伤，从多个途径干预CHF。

GO富集分析发现桂枝茯苓丸治疗CHF的作用机制可能涉及脂多糖反应、活性氧反应、氧化应激反应、脂筏、膜微区、转录因子、蛋白连接酶结合等。KEGG富集分析主要富集在AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、NF-κB等信号通路。晚期糖基化终末产物(AGE)参与调节糖尿病中高血糖的影响，AGE最重要的受体是晚期糖基化终末产物(RAGE)受体[25]。RAGE与AGE结合后，会触发细胞内活性氧的生成，进而激活MAPK和NF-κB信号通路，最终诱导多种炎症和促纤维化因子的产生，推动动脉粥样硬化的进展[26]。IL-17主要由辅助性T细胞17 (Th17)产生，一种促炎细胞因子[27]。IL-17可通过p38 MAPK、MAPK1、NF-κB、C/EBPβ激活促进成纤维细胞释放细胞炎症因子，在心肌重塑中发挥着关键作用[28]。TNF (也称为TNF-α)是一种内毒素诱导的糖蛋白，为炎症反应的关键调节因子[29]。TNF-α代表两种TNF-α受体(TNFR)的配体，即TNFR1和TNFR2。TNF-α主要通过长期或过度激活TNFR1来引发心肌细胞肥大和凋亡，而TNFR2则通过抑制致病性TNFR1下游通路的激活来发挥对心脏的保护作用[30]。HIF-1是一种DNA结合蛋白，在缺氧信号传导和转录调控过程发挥关键作用[31]。在缺氧条件下，HIF可以通过调节其下游靶标和心血管系统中的相关信号通路来启动对低氧可用性的适应过程并介导保护性反应[32]。本研究表明，桂枝茯苓丸治疗CHF主要是通过抑制心肌细胞凋亡、减少炎症反应、参与转录及氧化应激反应等途径。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接技术对桂枝茯苓丸治疗CHF过程中所涉及的核心成分、作用靶点进行了初步阐述。发现桂枝茯苓丸中槲皮素、山柰酚、黄芩素等活性成分可作用于AKT1、TP53、MYC、MAPK1等靶点，调控AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、NF-κB等信号通路治疗CHF。但也存在一定局限性，缺少动物、细胞、分子等多层次、多维度的实验验证。因此，未来还需进一步的实验研究及临床应用，为桂枝茯苓丸治疗CHF的机制研究提供更可靠的证据。