1. 引言
慢加急性肝衰竭(ACLF)是一种常见的终末期肝病，其特征是基础慢性肝病迅速恶化，伴有器官衰竭和高死亡率[1]。乙型肝炎病毒(HBV)是一种引起急性和慢性肝炎和肝细胞的人类嗜肝病毒癌症。ACLF发生在大约30%的急性失代偿的HBV相关肝硬化患者中[2]。HBV相关ACLF (HBV-ACLF)的短期预后很差，28天死亡率为40%~50% [3]。肠道微生物群是栖息在胃肠道中的微生物的集合[4]，估计肠道微生物的数量超过1014种[5]。肠道微生物群与宿主有着复杂且相互关系[6]，在宿主的代谢、营养、病理过程和免疫功能中发挥着重要作用[7]。人类肠道微生物群的组成受到多种因素的影响，如年龄、营养、种族、疾病和药物摄入。肠道微生物群组成的变化与几种临床疾病有关，如肥胖、非酒精性脂肪性肝病、过敏性疾病、胃肠疾病、自身免疫性疾病和癌症[8]。越来越多的证据表明，肠道微生物群在肝病的诱发和发展中起着至关重要的作用[9] [10]。肠道微生物或其微生物产物移位可诱导肝细胞凋亡和肝衰竭进展、慢性肝病和肝硬化中的肠功能障碍。在临床实践中，肠道微生态调节剂常用于乙肝疫苗的治疗，尤其适用于腹痛、腹泻、肝性脑病和可疑腹腔感染的患者。近年来大量的研究通过宏基因组学和16rDNA等技术揭示出肠道菌群在肝脏疾病中的变化，揭示了肠道菌群的多样性和丰富度显著降低，与疾病进展及预后有显著的关系；分析肠道菌群的结构变化特征，试图探索肠道菌群在HBV-ACLF重症化机制中的作用。本研究通过16rDNA技术分析HBV-ACLF、肝硬化、肝衰竭、慢乙肝及慢丙肝患者粪便中肠道菌群的多样性，选取健康人群为对照组，提取粪便样本的DNA，运用16rDNA的V3-V4区高通量测序方法分析研究肠道菌群的结构、丰度及多样性等特点，通过对HBV-ACLF患者肠道菌群与健康人群的肠道菌群进行对比，以寻找出与HBV-ACLF发生发展相关的菌群，并研究其在HBV-ACLF重症化过程中的机制及作用，为寻找新的治疗策略提供依据。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
本研究所纳入的研究对象均来自于2017年2月至2017年10月在新疆医科大学第一附属医院住院的患者。实验分为3组，第一组肝硬化组40人，第二组慢加急性肝衰竭9人，健康对照20人。
2.2. 纳入标准
HBV-ACLF及肝硬化的纳入标准：根据2014年亚太肝脏病学会(APASL)的共识[11]，慢性肝病基础的乙型肝炎患者，短期内出现黄疸，血清总胆红素TBIL ≥ 5 mg/dL (85 mmol/L)和凝血功能障碍(INR ≥ 1.5, PTA ≤ 40%)，发病4周内合并腹水和/或肝性脑病。肝硬化入组标准：符合慢性乙型肝炎防治指南(2015年版) [12]。
健康对照(HC)纳入标准：在新疆医科大学第一附属医院实习的医学硕士生，经过入学体检无肝脏和胃肠道疾病，既往无高血压、糖尿病及自身免疫相关疾病，6个月内无手术史。病毒性肝炎血液标志物阴性，肝肾功能未见异常。
2.3. 排除标准
本研究所纳入的所有研究者均排除其他肝炎病毒，如HAV、HCV、HDV，排除HIV感染，排除酒精性肝病、肠炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎以及不明原因的肝炎；排除肝细胞肝癌、排除伴有心血管、呼吸、内分泌、血液、消化等系统的严重并发症及可能影响到肠道菌群的系统性疾病的患者。
2.4. 实验具体步骤
1) 标本的收集及粪便DNA的提取
收集研究对象的新鲜粪便，10分钟内送到工作台进行分装，每位研究者3份标本，并统一明确标记，迅速转移至-80摄氏度冰箱冻存，并逐步完成DNA的提取。
2) PCR扩增
a) 使用试剂及仪器
PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。
PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型。
b) PCR扩增的步骤
细菌多样性鉴定对应区域：16S V3-V4区(引物343F和798R)，V4-V5区(引物515F和907R)，按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。
3. 统计分析
采用SPSS 19.0软件分析，计量资料采用t检验用均数 ± 标准差表示，计数资料用%表示，行χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
4. 结果
4.1. 测序数据结果
本研究共收集69例患者的粪便，结果如表1所示，获得了4,619,638条高质量序列，其中有4,619,346条序列集中在351~400 bp区域。数据排除了丙肝以及慢乙肝患者的标本，最终共分析69份粪便标本，最终分为肝硬化组(40份标本)、慢加急性肝衰竭组(9份标本)及健康对照组(20份标本)。肝硬化组共获得1,728,553条序列，平均每个标本序列为43213.8，平均长度为375.16；慢加急性肝衰竭组共获得435,303条序列，平均每个标本的序列为48,367，平均长度为375.26。
Table 1. Results of sequencing data
表1. 测序数据结果
Length (bp) |
Sequences |
Percent |
1~250 |
7 |
0 |
251~300 |
127 |
0 |
301~350 |
139 |
0 |
351~400 |
4619346 |
0.9999 |
401~450 |
19 |
0 |
4.2. 多样性分析
为了比较慢加急性肝衰竭组、肝硬化组与健康组的肠道菌群结构和组成的差异，我们使用a多样性和β多样性分析了三组之间的物种多样性差异。结果如表2所示，与a多样性分析结果相似，a多样性分析和β多样性分析(图1)的结果均表明，与肝硬化组、健康组相比，慢加急性肝衰竭组的肠道微生物群落的丰度逐渐降低，但是肠道微生物的多样性差异不显著。
Table 2. Analysis of intestinal microbiota diversity in acute-on-chronic liver failure group, cirrhosis group and healthy group
表2. 慢加急性肝衰竭组、肝硬化组与健康组的肠道菌群多样性分析
组别 |
Ace |
Chao |
Shannon index |
simpson |
健康组 |
268 ± 46 |
252 ± 65 |
2.68 ± 0.76 |
0.27 ± 0.06 |
肝硬化组 |
225 ± 39 |
224 ± 45 |
2.56 ± 0.63 |
0.24 ± 0.08 |
慢加急性肝衰竭组 |
179 ± 32 |
212 ± 37 |
2.42 ± 0.37 |
0.20 ± 0.05 |
F值 |
2.492 |
4.284 |
2.46 |
1.47 |
P值 |
0.037 |
0.006 |
0.079 |
0.34 |
Figure 1. Analysis of β diversity
图1. β多样性分析
4.3. OUT聚类分析
1) 组间物种组成
本研究所有标本共获得29,350个OUT，ACLF组获得432,260条reads，3232个OUT，肝硬化组获得1,714,800条reads，17,339个OUT，健康对照组获得940,241条reads，8779个OUT。将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列。经过优化我们得到了472个OUT，HC与实验组多为共有OTU，三组共有OTU有371个。LC和HC共有OTU有415个，与ACLF共有OTU有18个，LC特有OTU有37个。ACLF和HC共有OTU有372个，特有OTU有1个(见图2)。
Figure 2. Species composition between groups
图2. 组间物种组成
2) 群落结构组分
根据分类的结果，我们得到了主要肠道菌群序列分为9个菌门，包括广古菌门(Euryarchaeota)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)比例普遍下降，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、柔膜菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。
结果如图3，在门水平上，实验组相较于对照组比例普遍增加；其对应纲水平上拟杆菌纲和γ-变形菌趋势一致；乳杆菌目也有增多趋势。
Figure 3. Community structure components
图3. 群落结构组分
3) 组间OUT丰度
经过对各组件的OUT丰度进行分析，使用统计算法Bray-Curtis计算两两样本间距离，获得距离矩阵，各组件的OUT丰度没有差异，样本间的差异不能按照分组很好地聚类。通过多变量统计学方法PCoA分析，直观显示不同环境样本中微生物进化上的相似性及差异性。组间聚类较明显组间存在差异，尤其是各实验组与对照组之间，P < 0.05实验组间有差异，P < 0.05 (见图4)。
Figure 4. Abundance of OUT between groups
图4. 组间OUT丰度
4) 组间差异OTU
ACLF组与对照组相比较，FDR检验控制假阳性率 < 5%，得到69个差异OUT。16个OTU在LC低表达，其他OTU高表达有1个与K. pneumoniae同源的OUT (813217)高表达(见图5(A))。肝硬化组与对照组相比较，FDR检验控制假阳性率 < 5%，得到93个差异OUT。17个OTU在LC低表达，其他OTU高表达，有3个与K. pneumoniae同源的OUT (813217, 1104936, 814952)高表达(见图5(B))。
Figure 5. OTU differences between groups
图5. 组间差异OUT
5. 讨论
ACLF病情危急，病程进展快，致死率极高，目前临床上对此病治疗手段尚不明确。HBV-ACLF为其主要类型，有研究表明其患病是由肠道内细菌发生易位，导致菌群失调引起。因此研究肠道菌群的机制机理及与HBV-ACLF之间的传导通路至关重要。一项针对129例ACLF患者的研究发现，患者肠道菌群的一大特征是泪腺螺科减少，而巴氏杆菌科的相对丰度能够预测患者病死率。为了揭示HBV-ACLF患者中肠道菌群与疾病的关系，中山大学学者采用相同方法分析了HBV-ACLF患者(N = 212)和健康人(N = 877)的肠道菌群特点，发现HBV-ACLF组球菌/杆菌比值明显升高(P < 0.05)；元基因组测序也验证了该结果：在HBV-ACLF进展过程中，粪球菌迅速增加。另有学者[12] [13]采用高通量16S rDNA测序技术，对91例HBV-ACLF患者的粪便微生物群进行了检测，结果显示随着疾病进展，肠道菌群的多样性和丰富度显著降低(P < 0.05)。
本研究通过收集107例患者的粪便，获得了4,619,638条高质量序列，其中在351~400 bp区域有4,619,346条序列集中。通过分析得出肝硬化组共获得1,728,553条序列，慢加急性肝衰竭共获得435,303条序列，由此得出慢性加急性肝衰竭患者肠道菌群整体结构与肝硬化患者不同。
肠道菌群是多种细菌按照一定比例构成的小型生态系统，在正常情况下，菌群之间相互协调，平衡发展，肠道微生态是否平衡的衡量指标除了菌群多样性，丰度也是一大因素。当患者机体出现生理、病理结构紊乱时，细菌借机迅速增殖分化，如此一来多样性及丰度均会降低。本研究通过分析肝硬化组、HBV-ACLF组及健康对照组的OUT发现，本研究所有标本共获得29,350个OUT，ACLF组获得432,260条reads，3232个OUT，肝硬化组获得1,714,800条reads，17,339个OUT，健康对照组获得940,241条reads，8779个OUT，这说明OUT数目会随着病情严重程度而加重。有研究显示细菌感染会对机体全身器官造成严重威胁，使得机体全身炎症反应，加重肝性脑病及肝肾功能衰竭，足以导致HBV-ACLF患者发生死亡。生物学者按照分类学原理对生物的各种类群进行划分，便于弄清楚不同类群之间的亲缘关系和进化关系，分为域、界、门、纲、目、科、属、种。肠道菌群中占比最大的为拟杆菌门和厚壁菌门，厚壁菌门大多为有益菌群，占比55%~65%，乳杆菌属为其中一种；拟杆菌门中大多数为条件致病菌，约占10%~48%。变形菌门、放线菌门虽较多见，但其含量不多，其中变形菌门大部分为厌氧菌，多为致病菌群；放线菌门数量不多，为有益菌群。本研究进一步分析肠道菌门，根据分类结果本研究得出了主要肠道菌群序列分为9个菌门，在门水平上，实验组相较于对照组比例普遍增加，同时乳杆菌目也增多，这说明与健康患者相比，发生肝疾病患者肠道菌群有显著变化，同时与肝硬化患者比较，HBV-ACLF患者菌群落发生了显著改变，存在大量潜在致病菌如变形菌、拟杆菌，而有益菌减少。本研究将ACLF组与对照组对比，FDR检验控制假阳性率 < 5%，得到69个差异OUT，在LC呈低表达的有16个，其他OUT高表达有1个与K. pneumoniae同源的OUT高表达；将肝硬化组与对照组比较，FDR检验控制假阳性率 < 5%，得到93个差异OUT，在LC呈低表达的有17个，其他OUT高表达有3个与K. pneumoniae同源的OUT高表达。
综上所述，HBV-ACLF患者与肝硬化患者肠道菌群显著区别于健康患者，致病菌丰度存在显著异常增高，有益菌丰度降低；肠道菌群失调可能会通过细菌易位而导致病情加重。本研究分析了肝硬化患者与HBV-ACLF疾病不同阶段的肠道菌群紊乱特征，以为肠道菌群为靶点为临床治疗HBV-ACLF提供新的参考依据。尽管当前对肠道菌群与肝衰竭之间的相互已经有很多的研究，但受到许多因素(如：地域、性别、生活习惯、药物、酒精等)影响，尤其是在前期治疗阶段使用抗生素等，相关研究仍处于起步阶段，未来应该在考虑酒精、药物等混杂因素的前提下探索肠道菌群变化影响肝病进展的动力学和机制；此外，针对不同水平的菌群与机体之间的相互作用可能会改善患者的预后进行深入研究；在治疗方面，可将粪便菌群移植作为研究重点，进行大规模、多中心的随机对照试验来证明粪便菌群移植在ACLF患者中的疗效及安全性，并阐明其作用机制，开发出既能使患者受益，又不会对肠道微生态系统产生负面影响的治疗策略。
基金项目
国家自然科学基金(82060115)、“天山英才”科技创新领军人才项目(2022TSYCLJ0024)、新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(2022D01D19)、自治区重点研发计划项目(2022B03014)。
NOTES
*通讯作者。