环状RNA参与骨关节炎的机制研究进展

Research Progress on the Mechanisms of Circular RNA Involvement in Osteoarthritis

摘要: 骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是老年人常见的关节疾病，主要临床表现为慢性疼痛、僵硬和功能障碍，其发病机制尚未完全明确。环状RNA (circRNA)是广泛存在于真核细胞中的一种非编码RNA，具有独特的共价闭合环状结构。近年来，研究发现circRNA在OA进展中起着重要作用，主要通过调节细胞外基质的代谢稳态、炎症反应以及软骨细胞的稳态来参与OA。此外，circRNA还通过细胞间外泌体机制、在软骨细胞中作为蛋白质支架以及甲基化修饰等方式影响OA的发生与发展。本文综述了circRNA的生物发生、特性和功能，探讨了circRNA在OA中的重要作用，并探索其在OA发病机制中的潜在应用。circRNA的发现及其在OA中的潜在作用为OA的早期诊断和病因治疗带来了新的希望。

Abstract: Osteoarthritis (OA) is a common joint disease in the elderly, primarily characterized by chronic pain, stiffness, and functional impairment, with its pathogenesis still not fully understood. Circular RNA (circRNA), a type of non-coding RNA widely present in eukaryotic cells, has a unique covalently closed circular structure. In recent years, studies have found that circRNA plays an important role in the progression of OA, mainly by regulating extracellular matrix metabolic homeostasis, inflammatory responses, and chondrocyte homeostasis. Additionally, circRNA influences the occurrence and development of OA through mechanisms such as intercellular exosome communication, serving as protein scaffolds in chondrocytes, and methylation modifications. This article reviews the biogenesis, characteristics, and functions of circRNA, discusses its significant role in OA, and explores its potential application in the pathogenesis of OA. The discovery of circRNA and its potential role in OA offers new hope for the early diagnosis and etiological treatment of OA.

1. 前言

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是最常见的关节疾病之一，是老年人慢性疼痛和活动受限的主要原因，OA以关节软骨退化、软骨下骨硬化、骨赘形成和慢性滑膜炎为主要临床特征，临床表现为关节缓慢进行性疼痛、僵硬和功能障碍，严重影响患者的生活质量[1]。OA的发病机制复杂，其病因尚未完全阐明。现有研究认为，代谢异常、遗传因素和生物力学改变可能是其主要病因，其中年龄、性别、肥胖和骨密度等许多因素都会增加OA的风险[1]。目前OA的治疗旨在减轻或控制疼痛、延缓或阻止病情进展、改善或重建关节功能、矫正畸形和维持患者的生活质量[2]。一些临床指南推荐早期骨关节炎采用药物和非药物治疗，例如体力活动、口服和外用NSAID以及关节内注射治疗[3]。OA早期诊断生物标志物仍未被探索。因此，有必要探索OA的发生机制，寻找新的生物标志物，为临床和转化研究提供理论基础。

环状RNA(circRNA)是真核细胞中普遍存在的一类非编码RNA。与标准线性RNA不同，circRNA形成共价闭合的连续环，无5'或3'极性[4]。随着高通量测序技术的快速发展，许多与OA相关的circRNA已被鉴定。circRNA在OA相关组织和细胞中的表达不同，进一步表明circRNA可能是OA的潜在标志物和靶点[2]。本文从OA的发病机制角度总结了circRNA的最新研究，旨在为OA的预防、诊断和治疗提供新的方向。

2. 环状RNA的生物发生、特点和生物学功能

2.1. 环状RNA的生物发生

根据circRNA的基因组来源和结构特点，circRNA分为外显子circRNA (exonic circRNAs, ecircRNA)、内含子circRNA (intronic circRNAs, ciRNA)和外显子–内含子circRNA (Exon-Intron circRNAs, EIciRNA)三类。circRNA的产生过程非常复杂，涉及不同的环化机制。circRNA的形成涉及多种高度复杂的环化机制。目前外显子circRNA生物发生的三种模型分别为：1) 剪接体介导的反向剪接和连接，高度依赖于外显子内的典型剪接位点。位于5'供体位点的剪接体切割3'位点，使下游和上游片段紧密接近，从而形成环[5]。2) circRNA的生物发生可与顺式元件一起发生。许多circRNA是由内部外显子和侧翼内含子加工而成的，这需要位于外显子侧翼的环化内含子调控元件[6]。3) 也可以形成RNA结合蛋白(RBP)调控的circRNA。RBP结合外显子侧翼的内含子并干扰正常剪接，从而形成二聚体，使下游剪接供体位点靠近上游剪接受体位点，从而形成circRNA [7]。

2.2. 环状RNA的特点

circRNA在自然界中普遍存在，数量丰富，在人类细胞中已鉴定出超过10,000个circRNA。circRNA非常稳定，这种相对于线性RNA的高稳定性可能部分归因于它们的闭环结构，不易被外切酶降解。然而，我们对circRNA降解机制的理解还很表浅。含M6A的circRNA可以依赖于含YTH结构域的家族蛋白2 (YTHDF2)和热敏蛋白12 (HRSP12)的方式被核糖核酸酶P复合物降解，而circRNA几乎只被RNasL降解[8]。circRNA具有细胞和组织特异性。ecircRNA往往集中在细胞质中，而ciRNA、EIciRNA则集中在细胞核中[9]。不同类型的circRNA在不同的组织中表达并发挥作用，因此，circRNA有望作为多种疾病的生物标志物和治疗靶点。

2.3. 环状RNA的生物学功能

2.3.1. circRNA充当miRNA海绵

微小RNA (miRNA)是一类典型的普遍存在的非编码RNA，它通过直接结合目标信使RNA (mRNA)，进而影响亲本基因表达，在转录后调控基因表达。目前，两种著名的环状RNA，ciRS-7/CDR1as [10] [11]和SryRNA [10]，已被明确证实具有miRNA海绵的功能。反义小脑变性相关蛋白1 (CDR1as)首次证明环状转录本可以为特定miRNA提供靶结合位点，并揭示了一种全新的调控机制，导致环状RNA和其相关mRNA之间存在正相关[11]。CDR1as含有70多个miR-7保守的miRNA结合位点。CDR1as和miR-7在小鼠脑中共同表达，并共定位于不同的胞体中。CDR1as过表达提供更多的miR-7结合位点，同时游离miR-7分子数量减少，miR-7活性受到强烈抑制，导致miR-7靶基因上调。相反，CDR1as敲低或miR-671过表达则下调miR-7靶基因表达。这些结果表明，CDR1as可以作为miR-7海绵，且CDR1as与靶神经基因表达呈正相关。小鼠睾丸特异性基因性别决定区Y (Sry)衍生的环状转录本含有16个miRNA结合位点，可作为miR-138海绵发挥作用[10]。circSry过表达减弱了miR-138介导的对相关mRNA的作用，间接调节靶基因的表达[10]。综上所述，这些发现表明，circRNA充当miRNA海绵是一种普遍现象，这种机制可能有助于我们进一步阐明某些疾病的发病机制，并开发新的诊断和治疗方法。

2.3.2. 转录调控

circRNA也对亲本基因的表达起调控作用。例如，ci-ankrd52是一个细胞核中丰富的内含子circRNA。ci-ankrd52被证明通过调节RNA聚合酶(Pol II)的转录活性对其亲本基因的表达水平起调控作用[12]。此外，EIciRNA也能调控基因表达，例如circ-EIF3J和circ-PAIP2 [9]。保留在外显子之间的内含子可以促进外显子–内含子circRNA-U1 RNP复合物的形成，该复合物可以进一步与RNA pol II相互作用，从而增加亲代基因的表达水平[13]。上述实验结果证明，ciRNA和EIciRNA等细胞核中富集的circRNA可以作为转录调控因子发挥作用。

2.3.3. 蛋白质结合功能

除miRNA外，circRNA也能与蛋白质结合调控相应的功能。ciRNA和EIcircRNA主要位于细胞核中，并不发挥ceRNA的功能，而是通过直接与RBPs相互作用调控基因转录[9]。例如，ci-ankrd52被发现大量分布在相关基因的转录起始位点，它能与Pol II结合，促进亲代基因的转录[12]。敲低ci-ankrd52会抑制线性mRNA ankrd52的表达，但不会影响其上游或下游基因的表达。两种EIciRNA (EIciEIF3J和EIciPAIP2)能与U1 snRNP和Pol II相互作用，促进宿主基因的转录[9]。与ceRNA机制相比，circRNA的独特的蛋白质结合功能或将成为circRNA研究领域的一个新的方向。

2.3.4. 独立翻译功能

近年来，人们发现，尽管缺乏5′帽结构，circRNA仍可通过两种机制独立翻译。其中一种翻译机制涉及内部核糖体进入位点(IRES)，这是一个相对较短的RNA序列片段，可介导核糖体与RNA结合，而不依赖于5'帽。例如，circFBXW7包含由IRES启动的开放阅读框(ORF)，可允许翻译起始，而不依赖于5'帽结构。这种翻译增加了F-box和WD重复结构域包含7 (FBXW7)的表达，并诱导三阴性乳腺癌中的c-Myc泛素化降解[14]。第二种机制涉及N6-甲基腺苷(m6A)依赖形式的circRNA，即使没有IRES序列也可以翻译。m6A甲基化位于RNA腺苷酸的第6个N位，是一种动态、可逆的修饰。Yang等人的研究[15]，鉴定了499个与m6A相关的circRNA，其中25个通过circRNA-m6A-seq进行了验证。观察到m6A驱动的circRNA翻译被甲基转移酶样3和甲基转移酶样4复合物增强，并被脂肪质量和肥胖相关蛋白去甲基化。许多研究表明circRNA的翻译功能可能在人类转录组中很常见。然而，基于circRNA的环状特异性结构，这种新的circRNA翻译模式是IRES还是m6A介导的，仍需进一步研究。

3. 环状RNA参与OA的机制

3.1. 环状RNA调节细胞外基质中的代谢稳态

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)主要由II型胶原蛋白(Col II)、糖胺聚糖和聚集蛋白聚糖组成。ECM中分解代谢和合成代谢的平衡对于维持ECM稳态尤为重要。ECM降解是OA中软骨进行性丢失的一个关键特征。基质降解酶(包括基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)和具有1型血小板解整合素样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTs))是负责ECM降解的主要酶。circRNA作为miRNA海绵调控下游靶标的表达，促进MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5的表达，抑制ECM成分Col II和聚集蛋白聚糖，导致ECM降解增加。circNFKB1促进ECM降解，敲低circNFKB1可显著增加ECM合成代谢基因ACAN和COL2A1的表达，降低ECM降解酶基因MMP3和MMP13的表达。免疫荧光染色显示，cicNFKB1过表达可显著降低ECM的聚集蛋白聚糖和Col II的表达水平[16]。但是，circRNA还具有ECM保护作用。在IL-1β刺激的软骨细胞中，circHYBID表达显著下调，并降低对ECM代谢很重要的透明质酸(hyaluronic acid, HA)水平。实验表明，在软骨细胞中过表达的circHYBID可通过调节HA合成酶2和HYBID的表达来增加HA的积累，从而减轻ECM降解[17]。这些实验说明circRNA可以双重调节ECM，来促进控制OA的发展。

3.2. 环状RNA调控软骨细胞炎症状态

骨关节炎是一种炎症性疾病，软骨细胞的炎症状态自然也被纳入研究范围，而circRNA介导的炎症过程也起着至关重要的作用。circRNA在多种炎症过程中起调控作用。在骨关节炎模型中，也观察到上调或下调的circRNA影响炎症因子的产生和降解。circRNA调控的主要炎症因子为IL-6/IL-8/TNF-α/IL-17，IL-1β和TNF-α也在体外细胞模型中诱导了大多数骨关节炎[18]。此外，关节环境中的巨噬细胞也与OA软骨的炎症有关，研究还发现circRNA在诱导巨噬细胞极化方面起着调控作用，一项研究表明，OA滑膜中hsa_circ_0005567的表达下调。hsa_circ_0005567过表达抑制M1型巨噬细胞极化，促进M2型巨噬细胞极化。用LPS诱导的THP-1巨噬细胞上清液处理后，软骨细胞增殖明显减少，而凋亡率明显增加。hsa_circ_0005567的过表达则逆转了这一现象。机制上，hsa_circ_0005567通过miR-492/SOCS2轴作用，抑制M1型巨噬细胞极化，从而减轻OA软骨中软骨细胞凋亡[19]。这些研究表明，circRNA可以通过miRNA参与调节炎症因子来影响软骨细胞及其细胞外基质的命运。

3.3. circRNA调节软骨细胞稳态

OA的发展和进展涉及关节中的多种细胞类型，包括软骨细胞、滑膜细胞、成骨细胞和破骨细胞。软骨细胞在OA的发病机制中起着重要作用。OA软骨组织中circCDH13过表达会促进软骨细胞凋亡，而高表达的miR-296-3p则发挥保护作用circCDH13海绵吸附miR-296-3p抑制其表达，调控circCDH13/miR-296-3p/PTEN轴，促进内侧半月板(destabilization of the medial meniscus, DMM)诱导的OA小鼠软骨细胞凋亡[20]。circ_SEC24A主要在细胞质中表达，通过吸附miR-26b-5p对IL-1β诱导的OA软骨细胞发挥促凋亡作用[21]。氧化应激具有细胞毒性，在许多疾病和衰老中都会发生，它也与OA的发展有关。部分circRNA靶向抑制氧化应激并改善OA进展。一项研究显示circFNDC3B/miR-525-5p/HO-1轴抑制活性氧的产生，从而减轻氧化应激并调节软骨形成[22]。同样，另一个ceRNA circ-LRP1B通过诱导氧化应激促进LPS诱导的人类C28/I2软骨细胞凋亡[23]。因此，一些circRNA依附于miRNA，通过ceRNA轴调控多个下游靶基因，促进软骨细胞凋亡并抑制其增殖，进而破坏软骨稳态并促进OA进展。然而，也有一些circRNA在OA中表现出重要的软骨细胞凋亡抑制作用。Jc-1染色、线粒体膜电位测定和蛋白质印迹表明，circHIPK3的上调通过circHIPK3/miR-30a-3p/PON2轴减少了IL-1β处理的HC-a软骨细胞的线粒体介导凋亡[24]。自噬是一种溶酶体中细胞质成分降解的机制，通过抑制细胞凋亡来防止软骨细胞退化和OA。circRNA通过调节自噬和凋亡之间的平衡来延缓OA进展。在IL-1β处理的软骨细胞中，circ_0005567的丰度显著降低；其敲低促进了细胞凋亡。这种效应被circ_0005567过表达诱导的自噬增强所逆转。circ_0005567的高表达上调了自噬相关标志物LC3、Beclin-1和LC3-II/LC3-I。此外，circ_0005567充当miR-495海绵来抑制ATG14的表达[25]。因此，circ_0005567通过miR-495/ATG14轴促进软骨细胞自噬从而减轻OA。上述研究证明，circRNA对软骨细胞自噬的调控是通过自噬和凋亡之间的串扰及其对ECM代谢的影响来介导的。软骨细胞凋亡会诱导软骨损伤，其产物会促进细胞凋亡并激活OA中的炎症，加剧ECM和软骨降解。靶向circRNA来控制软骨细胞死亡和增殖之间的平衡，或调节细胞凋亡和自噬，可能具有治疗OA的潜力，为OA的治疗提供新的方向。

3.4. 外泌体的circRNA

外泌体具有从细胞膜脱落或由细胞分泌的双层膜结构，是细胞主动释放的纳米级膜囊泡，具有强大的细胞间运输能力，介导细胞间的信息交换。干细胞来源的外泌体往往含有较高水平的生长因子，对组织修复有良好的作用。在鉴定干细胞外泌体中的miRNA和lncRNA用于治疗OA的方向上已经取得了许多进展，例如脐带间充质干细胞(UMSC)外泌体含有miR-148a和miR-29b，可促进大鼠软骨再生并抑制炎症反应[26]。UMSC外泌体还含有lncRNAH19，它通过miR-29b-3p/FOXO3轴促进软骨细胞迁移和基质合成，从而抑制细胞凋亡[27]。这些外泌体主要通过细胞间ceRNA机制改善软骨细胞活力和各种表型，从而减轻OA。这些研究更好地了解circRNA在OA中的细胞间作用，可为开发OA的新疗法提供可能。此外，进入损伤阶段的软骨细胞也能产生外泌体，从而引起其他邻近的正常软骨细胞的病理过程。炎症因素诱导正常CHON-001软骨细胞产生外泌体circ_BRWD1，通过miR-1277/TNF受体相关因子6轴引起炎症反应以及其他软骨细胞异常增殖和凋亡[28]。进一步的例子说明了外泌体的作用取决于供体细胞的性质。MSC衍生的circRNA外泌体在治疗上可用于恢复关节的结构和功能完整性。然而，受损的软骨细胞也能产生circRNAs外泌体来刺激周围OA细胞的发育缺陷。外泌体虽然在组织再生方面具有优势，但仍存在产量低、功能弱、特异性低等缺点，无法满足临床定量和定性需求。从这个意义上说，具体的临床应用还需要进一步的研究和转化工作。

3.5. circRNA在OA软骨细胞中充当蛋白质支架

近年来circRNA丰富的作用机制被越来越多地认识到，例如翻译功能、与蛋白的相互作用等。在最近的研究中，Shen等发现OA患者软骨中circPDE4B的减少受上游FUS (一种RNA结合蛋白)调控，circPDE4B的下调导致细胞外基质的降解，软骨细胞活力下降。同时发现AGO2 RIP并不通过ceRNA机制发挥作用，克隆扩增其ORF序列后，未鉴定出circPDE4B翻译的蛋白。因此，经过RPD-MS和qRT-PCR验证，发现RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A (RIC8A)与circPDE4B发生相互作用。质谱鉴定出MID1为与circPDE4B相互作用的E3连接酶。在确定下游通路后，筛选出了p38/MAPK通路。在DMM模型小鼠中，过表达的circPDE4B也被证明可以抑制激活RIC8A和p38/MAPK通路并逆转小鼠的OA表型，这表明circPDE4B可以作为OA有效的分子靶向药物[29]。近期研究表明，circNFKB1通过与ENO1蛋白相互作用来调控其宿主基因NFKB1的表达[16]。未来可能会揭示更多circRNA在OA中的功能和作用机制，这也提示了circRNA作为分子靶向药物的可能性。

3.6. circRNA的甲基化修饰

核酸甲基化修饰是核酸的重要修饰，调控基因表达，甲基化修饰参与circRNA在OA中的作用，特异性调控circRNA甲基化水平可延缓或阻止OA的发生发展。与健康组相比，在OA中circ_0136474上调，circ_0136474通过竞争性结合miR-140-6p来调控甲基化CpG结合蛋白-2 (methylated CpG-binding protein-2, MECP2)的表达，从而影响ECM降解、细胞凋亡和炎症。这说明MECP2可以通过降低circ_0136474的表达来减缓OA的进程[30]。甲基化主要由DNA甲基转移酶家族催化，DNMT3A是参与表观遗传修饰和DNA甲基化修饰的重要基因之一。进一步研究表明，circ_0136474与circSEC24A调控DNMT3A的表达，且二者呈正相关。circSEC24A和DNMT3A在OA软骨组织和IL-1β诱导的软骨细胞中的表达水平高于正常软骨组织。circSEC24A靶向miR-26B-5P影响软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和ECM降解，从而影响OA的发展。抑制miR-26b-5p可以沉默circSEC24A，从而减轻OA [21]。有研究表明，给小鼠模型注射N6-甲基腺苷修饰的circRNARERE，可以对软骨起到保护作用，有效缓解OA [31]。circRNA的甲基化为OA治疗提供了新的方向。

4. 结论

总之，circRNA在OA的发生发展过程中具有重要作用。它们通过调节细胞外基质代谢稳态、炎症反应、软骨细胞的稳态、细胞间外泌体机制、RBP、甲基化修饰等方式影响OA的病理进程。此外，circRNA的独特特性使其成为OA潜在的早期诊断标志物和治疗靶点。然而，目前的研究仍处于初步阶段，未来还需进一步探索circRNA在OA发病机制中的具体作用，并开发针对circRNA的治疗方法，以期为OA的临床诊治带来更多可能性。

基金项目

广州市市校联合资助基础研究项目(202201020566)。

NOTES

^*通讯作者。