1. 前言
淀粉和蛋白质作为烟叶的重要成分，其含量直接影响烟叶的整体品质[1]。淀粉和蛋白质含量过高会影响烟草的燃烧效果，产生有害气体，降低烟叶的品质和安全性[2] [3]。与国外优质烟叶相比，我国烟叶中淀粉和蛋白质的含量偏高[4]，因此，优化烟叶中这两种成分的含量，使之达到适宜水平，对提升卷烟的整体品质至关重要。
近年来，有学者在烟叶烘烤工艺方面做了许多探索，如中温中湿[5] [6]、高温诱导[7] [8]、两炖一停[9]-[11]等，但这些方法对烟叶淀粉和蛋白质含量降低的效果有限，且适应性不强[12]。还有的学者通过外源添加淀粉酶和蛋白酶来降低烟叶淀粉和蛋白质的含量，效果较好，但存在成本高，难以规模化应用等问题[13] [14]。相比之下，利用微生物来降解烟叶淀粉和蛋白质的方法操作简便，普适性强，能更有效地调控烟叶中的大分子物质含量，具有极大的应用潜力[15]-[18]。前期我们从烟叶及烟株根际土壤中筛选出了两株芽孢杆菌BS1和BS3，分别可以显著降解烟叶的蛋白质和淀粉。本研究拟对这两株降解菌进行发酵条件的优化，然后制备成复合菌剂，并评价复合菌剂在生产上的实际应用效果，为微生物法降解烟叶淀粉和蛋白质的产业化应用奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 供试菌株
芽孢杆菌BS1和BS3是从湖北省恩施州利川市柏杨坝烟站试验基地云烟87品种的烟叶及其根际土壤中分离得到的，并由实验室进行保藏。
2.1.2. 试剂
硅藻土、水合硅酸、膨润土、滑石粉、六偏磷酸钠、焦磷酸钠(买自赛兰博科技有限公司)；甲壳素、烷基糖苷、PEG8000、甘油(买自国药集团)；短杆菌肽、鼠李糖脂、丁基萘磺酸钠，木质素磺酸钠(买自阿拉丁生化科技股份有限公司)。
2.1.3. 培养基
LB培养基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。
LB固体培养基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，琼脂粉15 g/L在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。
BS1发酵培养基：麦芽浸粉1 g/L，黄豆粉15 g/L，碳酸钙6.68 g/L，硫酸锰0.4 g/L，氯化镁2 g/L，pH值7.0。
BS3发酵培养基：葡萄糖50 g/L、甘油50 g/L、大豆蛋白胨50 g/L、磷酸二氢钾0.06 g/L，115℃灭菌20 min。(发酵培养基中的微生物接种量均为最佳培养基上微生物生长量的2%。)
2.2. 方法
2.2.1. 菌株之间的拮抗性检测
分别将菌株BS1和BS3从甘油管中活化后挑选菌落接种于LB培养液中获得菌悬液。采用平板对峙的方法，在涂布有BS1的LB固体平板中心打孔，孔中置入20 μL的BS3菌液，然后将平板置于37℃培养箱中24 h，观察BS1与BS3之间的拮抗性。
2.2.2. 菌株BS1、BS3生长曲线的测定
按2%的接种量把BS1与BS3菌株种子液分别接入到LB培养基中，于37℃、230 rpm/min条件下培养，每隔3 h取样。空白对照为相同条件下未接种菌株的液体培养基，测定OD600值。
2.2.3. 菌株发酵方法的优化
1) 不同碳源对菌株BS1、BS3产酶的影响
以10 g/L可溶性淀粉、蔗糖或葡萄糖作为碳源，其他条件不变，37℃、230 rpm/min条件下培养24 h，取样测其生长量、淀粉酶[19] [20]、蛋白酶活力[19]，确定最适碳源。
2) 不同氮源对菌株BS1、BS3产酶的影响
以质量浓度为10 g/L的蛋白胨、硝酸铵或酵母粉作为氮源，其他条件与测定指标同上，确定最适氮源。
3) 不同无机盐对菌株BS1、BS3产酶的影响
添加质量浓度为5 g/L的氯化钙(CaCl2)、硝酸钾(KNO3)或硫酸镁(MgSO4)作为无机盐，其他条件与测定指标同上，确定最适无机盐。
4) 不同pH值对菌株BS1、BS3生长及产酶能力的影响
在最佳培养基的基础上，将培养基的初始pH值调整为5、6、7、8、9，其他条件与测定指标同上，确定最佳初始pH值。
5) 不同发酵时间对菌株BS1、BS3生长及产酶能力的影响
在最佳培养基的基础上，每隔6 h测BS1和BS3的OD600值及淀粉酶、蛋白酶酶活，确定最适发酵时间。
6) 不同发酵温度对菌株BS1、BS3生长及产酶能力的影响
在最佳培养基的基础上，发酵温度设置为20℃、25℃、30℃、37℃、45℃，其他条件与测定指标同上，确定最适发酵温度。
7) 不同摇床转速对菌株BS1、BS3生长及产酶能力的影响
在最佳培养基的基础上，设定摇床转速为110 rpm/min、150 rpm/min、190 rpm/min、230 rpm/min，其他条件与测定指标同上，确定最佳摇床转速。
2.2.4. 复合菌剂载体的选择
将两株降解菌在最佳发酵条件培养下得到发酵液等体积混合，然后与不同的载体(硅藻土、水合硅酸、膨润土和滑石粉)按体积比5:1的比例进行混合，而后通过60℃烘箱干燥后研磨成粉末得到制剂母粉。参照GB/T 5451-2001 [21]测定制剂的润湿性，采用平板菌落计数法测定各制剂室温存放15 d后的芽孢含量，选择最优的载体。
2.2.5. 复合菌剂湿润剂与分散剂的优化
选择甲壳素、短杆菌肽、鼠李糖脂、丁基萘磺酸钠、烷基糖苷为湿润剂，选择六偏磷酸钠、焦磷酸钠、木质素磺酸钠、PEG 8000为分散剂。参照GB/T 14825-2006 [22]测定制剂的悬浮率，根据润湿时间和悬浮率选定最佳湿润剂和分散剂。然后将最佳分散剂和湿润剂的质量比按5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5的比例粉碎混合均匀，与母粉混合后经烘干制成粉剂，测定其悬浮率、润湿时间，选出复配助剂的最佳质量配比。同时，将分散剂和湿润剂的总用量按1%、2%、3%、4%、5%的比例粉碎混合均匀，烘干制成粉剂后测定悬浮率和润湿时间，得到润湿剂与湿润剂的最佳用量。
2.2.6. 稳定剂的优化
选择甘油作为稳定剂，按0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%的用量比与母粉混合后烘干制成粉剂，测定65℃下存放一周后菌的存活率，得到稳定剂的最佳用量比。
2.2.7. 复合菌剂的应用效果评价
烟叶主要化学成分的测定：将复合菌剂稀释100倍(w/v)后喷施新采鲜烟叶的正反面，均匀沾满叶片但不滴落，喷施蒸馏水作为对照。室温放置48 h后进行密集式烘烤(三段式烘烤) [23]，烤后粉碎样品，测定烤后烟叶常规化学成分。淀粉、烟碱、总糖和还原糖、总氮、钾和氯的含量按照YC/T216-2007 [24]、YC/T160-2002 [25]、YC/T161-2002 [26]、YC/T173-2003 [27]和YC/T162-2011 [28]标准进行测定。
2.2.8. 烟叶外观质量和感官质量评定
按照烤烟国家标准(GB2635-92) [29]和烟草在制品感官评价方法(YC/T415-2011) [30]进行评价。
2.3. 数据处理
本研究所有数据的统计和分析利用Origin 9.0和Excel 2010等软件进行。用ANOVA单因素方差分析法进行方差分析，邓肯(Duncan)多重检验法检验处理间的差异显著性(P < 0.05)。
3. 结果与分析
3.1. 菌株间拮抗性检测
菌株间拮抗性检测结果如图1所示，BS1与BS3之间不具有拮抗性。故可以进行复配使用。
Figure 1. The antagonistic effect between strain BS1 and BS3
图1. 菌株BS1、BS3之间的拮抗性检测
3.2. 发酵培养基和培养条件对菌株BS1、BS3产酶的影响
通过生长曲线的测定，我们发现菌株BS1和BS3的对数生长期为接种后12 h~24 h之间(图2)，24 h之后进入平台期，因此确定菌株BS1和BS3种子液的培养时间为24 h (图4)。在此基础上，我们对菌株BS1和BS3的发酵培养基进行了优化。如图3所示，菌株BS1的最适碳源、氮源和无机盐分别为可溶性淀粉、蛋白胨和氯化钙，BS1的最适起始pH值为8；菌株BS3的最适碳源、氮源和无机盐分别为可溶性淀粉、酵母粉和硝酸钾，BS3的最适pH值为7。然后，我们对菌株BS1和BS3的培养条件进行了优化，发现两株菌的最佳培养条件均为培养温度37℃、转速230 rpm/min，发酵时间24 h。在最优条件下经3次发酵验证，得到BS1菌株平均蛋白酶活为78.18 U/mL，BS3菌株平均淀粉酶活为133.93 U/mL (图5)，分别较优化前提高了10.04% (71.05 U/mL)和5.49% (126.96 U/mL)。
Figure 2. Growth curves of strains BS1 and BS3
图2. 菌株BS1、BS3生长曲线
Figure 3. Effects of different nitrogen sources, carbon sources, inorganic salts, and pH value on the enzyme production and growth of strains BS1 and BS3
图3. 不同氮源、碳源、无机盐、pH对菌株BS1、BS3产酶及生长的影响
Figure 4. Effects of different times, temperature, and rotational speed on enzyme production and growth of strain BS1、BS3
图4. 不同发酵时间/温度和摇床转速对于菌株BS1、BS3产酶及生长的影响
3.3. 复合菌剂的制备
将菌株BS1、BS3分别通过其最优发酵方法培养24 h后，等体积混合两者发酵液，按照5:1的比例与不同载体混合，烘干粉碎，测定润湿时间、初始芽孢含量及15 d后芽孢含量。实验结果如表1所示，水合硅酸的润湿时间最短，为19 s，初始芽孢含量及15 d后芽孢含量也最多，分别为2.29 × 1010 cfu/g和1.63 × 1010 cfu/g。所以，最终选择水合硅酸为复合菌剂的载体材料。
通过润湿时间和悬浮率的测定，发现最佳的润湿剂和分散剂分别为烷基糖苷和六偏磷酸钠，其润湿时间分别为3 s和6 s (表2和表3)，悬浮率分别达到61.84%和64.77% (表2和表3)，最佳配比为1:2 (表4)，最佳用量分别为1%和2% (表5)。
Figure 5. Starch enzyme activity and protease activity before and after optimization using BS1 and BS3
图5. 使用BS1、BS3优化前后淀粉酶活和蛋白酶活
将稳定剂甘油按照不同比例与母粉混合后，测定75℃时菌的存活率。结果显示，当甘油含量在1.00%时，菌的存活率最高为91.06%以上(表6)，因此选择甘油的用量为1.00%作为最佳用量。
Table 1. Selection of the carriers
表1. 载体的选择
载体 Vector |
润湿时间 Wetting time |
初始芽孢含量1010 cfu/g Initial spore content |
15 d后芽孢含量1010 cfu/g Spore content after 15 days |
膨润土Bentonite |
50s |
1.14 |
0.61 |
硅藻土Diatomite |
32s |
1.43 |
0.75 |
滑石粉Talc |
66s |
0.79 |
0.26 |
水合硅酸Hydrated silica |
19s |
2.29 |
1.63 |
Table 2. Selection of surfactants
表2. 湿润剂的选择
湿润剂 Surfactant |
润湿时间 Wetting time |
悬浮率 Suspensibility |
甲壳素Chitin |
5 s |
37.47% |
短杆菌肽Gramicidin |
4 s |
40.22% |
鼠李糖脂Rhamnolipids |
4 s |
60.93% |
丁基萘磺酸钠Sodium butyl naphthalene sulfonate |
3 s |
58.26% |
烷基糖苷Alkyl glycoside |
3 s |
61.84% |
Table 3. Selection of dispersants
表3. 分散剂的选择
分散剂 Dispersant |
润湿时间 Wetting time |
悬浮率 Suspensibility |
焦磷酸钠Sodium Pyrophosphate |
6 s |
39.14% |
PEG8000 |
7 s |
50.62% |
木质素磺酸钠SLS |
8 s |
39.86% |
六偏磷酸钠Sodium hexametaphosphate |
6 s |
64.77% |
Table 4. Mass ratio optimization of dispersant and wetting agents
表4. 分散剂和润湿剂的质量比优化
分散剂和湿润剂的质量比 Dispersant:wetting agent |
润湿时间 Wetting time |
悬浮率 Suspensibility |
5:1 |
7 s |
50.90% |
4:1 |
7 s |
60.42% |
3:1 |
6 s |
63.46% |
2:1 |
5 s |
70.93% |
1:1 |
6 s |
65.31% |
1:2 |
6 s |
64.58% |
1:3 |
7 s |
60.36% |
1:4 |
8 s |
55.28% |
1:5 |
9 s |
52.41% |
Table 5. Optimization of the dosage ratio of dispersant and wetting agent
表5. 分散剂和润湿剂的用量比优化
分散剂和润湿剂的用量 The dosage of dispersant and wetting agent |
润湿时间 Wetting time |
悬浮率 Suspensibility |
1% |
12s |
61.53% |
2% |
9 s |
67.12% |
3% |
10 s |
69.90% |
4% |
9 s |
66.78% |
5% |
11 s |
62.22% |
6% |
14 s |
51.55% |
Table 6. Optimization ratio of stabilizers
表6. 稳定剂的用量优化
稳定剂 Stabilizer |
用量比 Dosage ratio |
75℃时菌的存活率% Survival rate of bacteria at 75℃ |
甘油 |
0.00% |
76.66% |
甘油 |
0.20% |
82.71% |
甘油 |
0.40% |
86.32% |
甘油 |
0.60% |
87.68% |
甘油 |
0.80% |
90.12% |
甘油 |
1.00% |
91.06% |
甘油 |
1.20% |
90.25% |
3.4. 复合菌剂使用效果分析
3.4.1. 复合菌剂处理对烤后烟叶常规化学成分的影响
喷施复合菌剂的烤后烟叶淀粉、总氮含量显著降低，分别降低了26.41%与17.14%。还原糖含量明显升高，烟碱和总糖含量降低，钾离子含量、糖碱比、钾氯比均升高，但均无显著差异(表7)。
Table 7. Comparison of the chemical composition of the roasted tobacco leaves
表7. 烤后烟叶化学成分比较
处理 Treatment |
烟碱(%) Nicotine |
还原糖(%) Reducing sugar |
总糖(%) Total sugar |
总氮(%) Total
nitrogen |
淀粉(%) Starch |
钾(%) Potassium |
氯(%) Chlorine |
糖碱比 Sugar
alkali
ratio |
氮碱比 Nitrogen alkali
ratio |
两糖比 Two
sugar
ratio |
钾氯比 Potassium chloride ratio |
CK |
3.06 |
23.98 |
38.63 |
2.45* |
6.02* |
1.24 |
0.36 |
12.62 |
0.80 |
0.62 |
3.44 |
复合菌剂 Microbial agent |
2.90 |
25.27* |
37.99 |
2.03 |
4.43 |
1.36 |
0.34 |
13.10 |
0.97 |
0.67 |
4.00 |
注：**表示差异极显著(P < 0.01)，*表示差异显著(P < 0.05)。
Note: **indicates a significant difference (P < 0.01), and *indicates a significant difference (P < 0.05).
3.4.2. 复合菌剂处理对烤后烟叶外观质量的影响
与对照相比，施加复合菌剂的烟叶烤后颜色、色度及成熟度更好，叶片油润感强，韧性、弹性更佳，色泽趋于饱和，光泽较为鲜亮，指数和高于CK组1.5分，表现出较好的外观质量，说明喷施复合菌剂的处理能有效提高烤后烟叶外观质量(表8)。
Table 8. Comparison of appearance quality of roasted tobacco leaves
表8. 烤后烟叶外观质量比较
处理 Treatment |
颜色 Color |
成熟度 Maturity |
叶片结构 Blade structure |
身份 Identity |
油分 Oil content |
色度 Chrominance |
指数和 Index and |
CK |
8.2 |
6.9 |
8 |
7.8 |
6.7 |
5.9 |
43.5 |
复合菌剂 Microbial agent |
8.5 |
7.8 |
7.8 |
7.8 |
6.9 |
6.2 |
45.0 |
3.4.3. 复合菌剂处理对烤后烟叶感官质量的影响
通过感官质量评价对比(表9)发现，烟叶施加复合菌剂处理后，烟叶香气质变好，杂气和刺激性减少，劲头适中，余味、燃烧性和灰色无明显差异。综合烤后烟叶感官质量特征和风格特征，发现复合菌剂处理后的烟叶感官质量有所升高。
Table 9. Comparison of the sensory quality of the roasted tobacco leaves
表9. 烤后烟叶感官质量比较
处理 Treatment |
质量特征 Quality characteristics |
风格特征
Characteristics |
香气值 18 Aroma value |
香气量 16 Volume of aroma |
燃烧性 4 combustibility |
刺激性 20 Thrill |
余味
22 Aftertaste |
杂气
16 Impure gas |
灰色 4 Grey |
合计 100 Sum |
浓度 Concentration |
劲头 Energy |
CK |
14 |
13.5 |
4 |
16.5 |
17 |
13.5 |
4 |
82.5 |
3.5 |
3.5 |
复合菌剂 Microbial agent |
14.5 |
13.5 |
4 |
17 |
17 |
13 |
4 |
83.0 |
3.5 |
3.5 |
4. 讨论
微生物在烟草调制过程中发挥关键作用，它们能够促进烟叶内含物质的转化，从而提高烟叶品质。通过筛选具有同时降解蛋白质和淀粉能力的菌株，可以实现对低等级烟叶的品质改良，对于提高烟叶可用性和经济价值具有重要的意义[31]-[34]。
本研究制备的复合菌剂，由BS1和BS3菌株共同组成，经优化后处理烟叶，结果显示蛋白质和淀粉的降解率分别达到26.14%和17.41%。其中蛋白质的降解率优于李梅云[35]、马玲玲[19]和王勇[1]的报道(蛋白质降解率分别为24.46%、20.00%和15.42%)，但不及杨宗灿[36] (29.66%)的结果。其原因可能是他们的烟叶处理温度较高(37℃)和发酵时间较长(84 h)，更加有利于烟叶蛋白质的降解。本研究制备的复合菌剂对烟叶淀粉的降解效果一般，不如马玲玲[19]和王勇[1]的报道(淀粉降解率分别为33.87%和43.89%)，其原因一方面是BS3的淀粉酶活性较低，经优化后为133.93 U/mL，仅提升了5.49%，而马玲玲报道菌株的淀粉酶活性则达到了190.06 U/mL；另一方面是王勇在发酵烟叶的过程中额外添加了淀粉酶，使得淀粉的降解效率显著提升。值得注意的是，除了降解效率外，本研究制备的复合菌剂还具有提高烤烟香气和改善口感的功效，这与窦琴[37]的研究结果一致，表明复合菌剂在烟草品质提升方面的多重作用。
综上所述，本研究中的复合菌剂对烟叶蛋白质的降解率更高，而对淀粉的降解率则相对较低，我们将进一步探索优化复合菌剂的发酵条件，增加其产胞外蛋白酶和淀粉酶的活力，提高其对烟叶蛋白质和淀粉的降解效率，并深入探究其对烟草品质的具体影响机制，为微生物法提高烟叶品质的工业化应用奠定基础。
5. 结论
1) 菌株BS1的最适发酵条件为：10 g/L可溶性淀粉作为碳源、10 g/L蛋白胨作为氮源、CaCl2作为无机盐，在37℃、pH7、转速为230 rpm/min的条件下发酵24 h，优化后蛋白酶活性为78.18 U/mL。
2) 菌株BS3的最适发酵条件为：10 g/L可溶性淀粉作为碳源、10 g/L酵母粉作为氮源及5 g/L的KNO3作为无机盐，在37℃、pH7、转速为230 rpm/min的条件下发酵24 h，优化后淀粉酶活为133.93 U/mL。
3) 复合菌剂的最佳配方为：载体为水合硅酸，与发酵液比例为1:5；分散剂为2.00%的六偏磷酸钠；湿润剂为1.00%的烷基糖苷；稳定剂为1.00%的甘油。
4) 复合菌剂处理烟叶48 h并烘烤后，烟叶淀粉和蛋白质含量分别降低了26.41%和17.14%，其中蛋白质降解率优于大部分文献报道，但淀粉降解率相对较低。另外，复合菌剂处理后烟叶还原糖和钾离子含量明显升高，糖碱比、钾氯比升高，烟碱含量降低；烟叶颜色、色度及成熟度更好，叶片油润感强，香气质增加，杂气和刺激性减少，表明复合菌剂还具有提高烤烟香气和改善口感的功效。
基金项目
中国烟草总公司重点科技项目“基于图像精准识别的烟叶智能烘烤关键技术研究与应用”(110202102007)；湖北省烟草公司重点科技项目“烟叶调制过程中淀粉、蛋白质降解调控技术研究与应用”(027Y2021-005)。