摘要: 目的：通过网络药理学的方法，探究柴胡疏肝散治疗乳腺增生症的潜在靶点和作用机制。方法：使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选柴胡疏肝散的有效活性成分及其作用靶点，利用GeneCards数据库检索乳腺增生症的相关靶点。映射疾病靶点与药物靶点，通过String数据库预测两者间关键靶点的相互作用，构建“药物–有效成分–作用靶点”网络图，并对关键靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析，分析柴胡疏肝散治疗乳腺增生症的潜在作用机制。结果：共获得50个活性成分，对应作用靶点681个，乳腺增生疾病对应靶点1970个，交集靶点187个，核心靶点37个，并得出排名前10位的GO富集结果和排名前30位的KEGG富集结果。结论：柴胡疏肝散中，槲皮素、山柰酚、柚皮素等多种成分，通过作用于STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1、JAK2等靶点，从而调控PI3K/Akt/mTOR、JAK-STAT、TP53-MAPK等通路的信号表达，以发挥治疗乳腺增生的作用。
Abstract: Objective: To explore the potential targets and mechanisms of Chaihu Shugan Powder in the treatment of breast hyperplasia through network pharmacology. Methods: The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) was used to screen the effective active components and their targets of Chaihu Shugan Powder. The GeneCards database was utilized to retrieve the related targets of breast hyperplasia. Disease targets and drug targets were mapped, and the interactions between key targets were predicted using the STRING database. A “drug-active component-target” network diagram was constructed, and Gene Ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis were performed on the key targets to analyze the potential mechanisms of Chaihu Shugan Powder in treating breast hyperplasia. Results: A total of 50 active components were identified, corresponding to 681 targets. There were 1970 targets associated with breast hyperplasia, with 187 intersection targets and 37 core targets. The top 10 GO enrichment results and top 30 KEGG enrichment results were obtained. Conclusion: Multiple components in Chaihu Shugan Powder, such as quercetin, kaempferol, and naringenin, act on targets like STAT3, AKT1, MAPK3, ESR1, and JAK2, regulating the signal expression of pathways such as PI3K/Akt/mTOR, JAK-STAT, and TP53-MAPK, thereby exerting a therapeutic effect on breast hyperplasia.
1. 引言
乳腺增生(breast hyperplasia)是乳腺组织的一种非肿瘤、非炎性的良性增生性疾病，由于对本病的认识不同，因而对其有多种命名，如乳腺小叶增生症、乳腺结构不良、纤维囊性病等。增生可发生于乳腺实质任何部位，其病理形态多种多样，如腺管周围囊肿形成、腺管内乳头状增生、乳管囊性扩张、小叶实质上皮增生等[1] [2]。其主要症状表现为一侧或双侧乳房胀痛和肿块，常有周期性表现，于月经前明显加重。现代医学研究认为本病病因系雌、孕激素比例失调，致使乳房各部不同程度增生，且有一定的癌变倾向[3]。乳腺囊性增生病的癌变率为1%~5%，有活检证实为非典型增生时其发生乳腺癌的危险性更是会明显增加。中医学中称此病为“乳癖”，认为情志不遂、气机阻滞，或冲任失调常为本病病因病机所在。
柴胡疏肝散原方出自张介宾《景岳全书》，原方由柴胡、香附、川芎、陈皮、白芍、枳壳、炙甘草等7味药组成，主疏肝行气，活血止痛。当前应用柴胡疏肝散及其化裁方治疗乳腺增生的临床报道众多，但其具体作用靶点及机制尚不明确。本研究通过网络药理学方法初步揭示柴胡疏肝散治疗乳腺增生的靶点及作用机制，旨在为临床治疗提供理论支持。
2. 方法
2.1. 柴胡舒肝散药物成分及靶点筛选收集
分别将柴胡疏肝散组成药物(柴胡、香附、川芎、陈皮、白芍、枳壳、炙甘草)于TCMSP在线数据库中检索，设置生物利用度OB ≥ 30%，类药性DL ≥ 0.18，得到柴胡疏肝散所含活性化合物。
2.2. 柴胡疏肝散活性成分–作用靶点网络的构建
应用Uniprot数据库获取作用靶点标准名称。通过Excel构建网络文件，将其导入Cytoscape 3.9.1软件构建活性成分–靶点网络。
2.3. 乳腺增生疾病基因靶点获取
在Gene Cards数据库和OMIM数据库中，以“hyperplasia”为关键词，检索乳腺增生的相关基因，筛选合并去重后得到疾病对应靶点。
2.4. 柴胡疏肝散–乳腺增生共同靶点的获取及蛋白相互作用(PPI)网络的构建
将药物作用靶点与乳腺增生疾病靶点通过韦恩图交集映射得到柴胡疏肝散–乳腺增生共同靶点，将共同靶点导入String 12.0数据库(https://cn.string-db.org/)，物种选择“人类(homo sapiens)”，最低相互作用域值 ≥ 0.9，获得靶点相互作用网络图，将该图导入Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络。并通过“network analyzer”插件将网络结构进行拓扑分析，根据介数中心性(BC)、紧密度(CC)、节点连接度(degree)筛选得到核心靶点。
2.5. 基因本体论(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析
将柴胡疏肝散–乳腺增生共同靶点以Gene Symbol的格式导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO功能富集分析以及KEGG基因通路富集分析。通过微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn)进行可视化处理，以解释柴胡疏肝散治疗乳腺增生的生物功能及相关信号通路过程。
3. 结果
3.1. 柴胡疏肝散活性成分及其靶点
以OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18为条件，筛选得到柴胡疏肝散组成药物所含活性化合物数量分别是柴胡17个，香附17个，川芎7个，陈皮5个，白芍12个，枳壳5个，甘草0个，去除重复项后共得到活性化合物58个，其中8个无对应靶点，剩余50个活性成分对应作用靶点去重后共681个。
3.2. 柴胡疏肝散–乳腺增生共同靶点及PPI网络图
通过OMIM数据库和Gene Cards数据库检索筛选去重后得到乳腺增生疾病对应靶点1970个。二者通过韦恩图交集映射共得到交集靶点187个(见图1)。通过string数据库对此187个靶点进行分析，获得靶点相互作用网络图(见图2)。将该图导入Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络，共得到187个节点，3939条边。通过插件“network analyzer”将网络结构进行拓扑分析，介数中心性(BC)大于中位数164.545454545452、紧密度(CC)大于中位数0.00291068985130662、节点连接度(degree)大于中位数42.1283422459893，筛选后得到37个节点，558条边。由此可得到信号转导及转录激活因子3 (STAT3)、蛋白激酶(AKT1)、蛋白激酶(SRC)、Jun原癌基金(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)、缺氧诱导因子(HIF1A)、雌激素受体(ESR1)、B淋巴细胞瘤-2 (BCL2)、凋亡调控因子(CASP3)、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞周期素(CCND1)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)、基质金属蛋白酶2 (MMP2)、核激素受体(PPARG)等37个核心靶点(见图3)。
3.3. GO生物过程和KEGG通路富集分析
将187个交集基因通过DAVID数据库进行富集分析，获得包括生物过程(BP)819个，细胞组成(CC)84个，
Figure 1. Common targets of Chaihu Shugan Powder and mammary hyperplasia
图1. 柴胡疏肝散–乳腺增生共同靶点
Figure 2. Target’s PPI of Chaihu Shugan Powder on mammary hyperplasia
图2. 柴胡疏肝散治疗乳腺增生症靶点PPI网络图
Figure 3. Core targets of Chaihu Shugan Powder on mammary hyperplasia
图3. 柴胡疏肝散治疗乳腺增生症核心靶点
Figure 4. GO enrichment results of the core targets of Chaihu Shugan Powder on mammary hyperplasia
图4. 柴胡疏肝散治疗乳腺增生症关键靶点的GO功能富集图
Figure 5. KEGG enrichment results of the core targets of Chaihu Shugan Powder on mammary hyperplasia
图5. 柴胡疏肝散治疗乳腺增生症关键靶点的KEGG富集分析
分子功能(MF)159个在内的GO分析条目共1062个，分别选择各项中排名前10的条目(见图4)进行可视化处理(P < 0.05)。结果表明，在生物过程中，其主要与磷酸化、信号传导等相关；在细胞组分上，其主要与细胞膜、细胞质、细胞核等相关；在分子功能方面，其主要与蛋白结合、ATP结合等相关。
通过KEGG富集分析共获得163条通路，取排名前30的通路(见图5)进行可视化处理(P < 0.01)，横轴表示富集指数，纵轴表示富集通路名称，气泡的颜色表示P值，颜色越深，P值越小；气泡的大小表示基因个数，气泡越大，数量越多。主要包括癌症通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K-AKT)信号通路、癌症蛋白聚糖等。
4. 讨论
乳腺增生是近年来困扰女性健康问题的一大疾病，也是临床上最常见的乳房疾病，虽然乳腺增生症本身为乳房的良性疾病，但该病又是乳腺癌致病的重要危险因素[4] [5]，因此早期发现早期治疗对其有重要意义。研究认为，单纯西医治疗乳腺增生存在局限性和复发的可能性，与之相比，中西医治疗方法联合使用能发挥更好的治疗效果。
柴胡疏肝散是治疗乳腺增生的常用方，常用于治疗肝郁气滞，失于疏泄所致的乳癖。方中柴胡善于疏解肝经瘀滞，为君药；香附为疏肝解郁、行气止痛之要药，可助柴胡以解肝郁；川芎力能行气活血止痛，与香附同为气中之血药，二者相合可增解郁行血之功，共为臣药；白芍养血柔肝，善调血中之气，与柴胡相伍，收散兼施，为疏肝解郁要药；枳壳、陈皮理气行滞，与白芍共为佐药；甘草兼调诸药，亦为使药。
现代医学研究认为，乳腺增生症的发病机制主要在于雌、孕激素受体紊乱，以及性激素受体异常。雌、孕激素水平在乳腺增生发病过程中起到重要影响作用[6]。本研究通过网络药理学的方法对药物有效成分及靶点进行筛选，发现柴胡疏肝散组成药物中度值较高的有效成分中，多为黄酮类化合物，如槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、异鼠李素(isorhamnetin)、橙皮素(Hesperetin)等，天然黄酮类化合物也被称作为植物界的天然雌激素。早有研究表明，槲皮素可对雌激素受体产生直接作用，影响细胞增殖的过程[7]，还可以作用于儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)表达从而影响雌激素灭活[8]。另外，乳腺增生产生的疼痛症状常因血清饱和与不饱和脂肪酸增加致雌激素和孕激素受体异常敏感而加重，槲皮素可通过促进胆固醇与胆汁酸之间的转化来降低血清脂肪酸水平，以缓解疼痛症状[9] [10]。另有研究认为，山柰酚是一种选择性雌激素受体调节剂，可作为孕激素补充剂，与其受体结合并激活，从而发挥孕激素样作用[11]。
从KEGG信号通路及PPI网络筛选获取的核心靶点来看，STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1、JAK2等靶点可能为柴胡疏肝散发挥其治疗作用所刺激的通路。PI3K/Akt/mTOR信号通路是癌症发生发展的传统途径，在维持细胞正常功能中起着重要作用。蛋白激酶1 (AKT1)属于AKT家族，研究表明，当小鼠体内的该基因激活后，其乳腺组织即会出现增生[12]，本方中，槲皮素、山柰酚、异鼠李素、木犀草素、柚皮素等多种成分均与该信号通路的调控有关[13] [14]。JAK-STAT通路是影响细胞凋亡的重要节点，槲皮素和柚皮素可通过影响炎症因子的表达来达到抑制JAK-STAT通路的目的。研究表明，槲皮素、柚皮素、香叶木素均可作用于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达，抑制肿瘤细胞增殖[15] [16]。ESR1是雌激素受体编码基因之一，主要与Erα合成相关，可诱导乳腺细胞的增殖。有研究表明，山柰酚和槲皮素可通过抑制ESR1基因表达，从而降低乳腺组织对雌激素的敏感性，抑制雌激素水平升高所引起的乳腺异常增生[7] [17] [18]。另外，PI3K/Akt/mTOR信号通路、JAK-STAT通路、TP53-MAPK信号通路参与了生物体内细胞分裂、分化等多种生理过程，且参与了多种疾病的发生，如肿瘤、自身免疫疾病及心血管疾病等，柴胡疏肝散有效成分对其作用明显也可证明该方可在一定程度上预防乳腺增生向乳腺癌的进展过程。
总之，本研究基于网络药理学的方法探究柴胡疏肝散治疗乳腺增生的机制，可知柴胡疏肝散中，槲皮素、山柰酚、柚皮素等多种成分，通过作用于STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1、JAK2等靶点，从而调控PI3K/Akt/mTOR、JAK-STAT、TP53-MAPK等通路的信号表达，以发挥治疗乳腺增生的作用，这表明柴胡疏肝散治疗乳腺增生症为多有效成分、多作用靶点、多信号通路协同配合，从而达到治疗目的。本研究是在分子层面上探究乳腺增生的治疗方法，而仅通过数据分析和文献查阅得出结论存在局限性，虽为探索柴胡疏肝散治疗乳腺增生的分子机制打下基础，但其明确的作用机制仍需实验的进一步验证。
NOTES
*通讯作者。