1. 引言
柱芳烃作为一种新兴的超分子主体化合物，自2008年首次被合成以来，柱芳烃以其独特的刚性柱状结构和易于修饰的特点，迅速引起了科研人员的高度关注[1]。在合成方法上，最初的合成方法相对复杂，产率较低，但随着研究的深入，各种高效的合成路线被开发出来，使得柱芳烃的产率和纯度大大提高[2] [3]。同时，对柱芳烃结构的研究也在不断深入。通过对其周边取代基的修饰，可以调控柱芳烃的物理化学性质，如溶解性、空腔大小、电子亲和力等[4] [5]。这为其在不同领域的应用提供了更多的可能性。此外，科研人员还对柱芳烃的自组装行为进行了广泛研究，发现它们可以通过多种相互作用形成有序的超分子结构，如纳米管、胶束、薄膜等[6]-[8]。
柱芳烃具有特定的空腔结构，可以选择性地结合各种客体分子，如阳离子、阴离子和中性分子等[9]。基于这一特性，柱芳烃在化学传感器领域有着广泛的应用前景。例如，可以设计基于柱芳烃的荧光传感器，用于检测环境中的有害物质，如重金属离子、有机污染物等[10] [11]。当客体分子与柱芳烃结合时，会引起荧光信号的变化，从而实现对目标分子的检测。此外，柱芳烃还可以用于构建电化学传感器，通过与客体分子的相互作用改变电极的电化学性质，实现对目标分子的检测[12]。在药物输送领域，柱芳烃也显示出了巨大的潜力。由于其可以与药物分子形成包合物，柱芳烃可以作为药物载体，提高药物的稳定性和溶解性，延长药物的作用时间[13]。同时，通过对柱芳烃进行适当的修饰，可以实现药物的靶向输送，提高药物的疗效并降低副作用[14]。柱芳烃还可以作为催化剂的载体，通过与催化剂的相互作用提高催化剂的活性和选择性。此外，柱芳烃还可以与金属离子形成配合物，作为金属催化剂的前驱体，在一定条件下转化为具有催化活性的金属纳米粒子[15]。在材料科学领域柱芳烃还可以用于制备智能材料，如响应性凝胶、自修复材料等。这些材料在电子器件、光学材料、生物医学材料等方面具有潜在的应用价值[16]-[20]。
本文总体思路如图1所示，首先设计合成两种A1/B1型柱芳烃，分别为羧基修饰的柱[5]芳烃(AP)和氨基修饰的柱[5]芳烃(CAP)，利用胺基和羧基之间形成氢键的性质，AP与CAP在DMSO/水的混合溶剂中可形成稳定的凝胶结构。利用SEM、IR、流变、MTT等对凝胶的形貌、结构和细胞毒性进行了详细的表征。此外，由于所制备的凝胶具有疏松多孔结构，可以有效地用于抗癌药物DOX的负载从而用于杀死肿瘤细胞。
Figure 1. Schematic illustration of the design, synthesis and application of supra-molecular gel based on A1/B1 type pillar[5]arene
图1. 基于柱[5]芳烃AP和CAP制备凝胶及其应用示意图
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
扫描电子显微镜(Gemini SEM 300，德国ZEISS公司)；紫外可见近红外光谱仪(UV-3600，日本Shimadzu公司)；红外光谱仪(Nexus 670，美国Nicolet公司)；天平(YP1002-20002，青岛聚创环保设备有限公司)；核磁共振仪(Bruker AVANCE III，德国)；高分辨质谱仪(Brucker solariX 70，德国)。
对苯二酚、溴乙酸甲酯、乙腈、对苯二乙醚、二氯甲烷、三氟化硼乙醚、乙二胺、氢氧化钠均为分析纯，购于上海阿拉丁生化科技有限公司。
2.2. A1/B1型柱芳烃的合成
2.2.1. 双羧基修饰的柱[5]芳烃(AP)的合成
双羧基修饰的柱[5]芳烃(AP)的合成路线如图2所示，首先取1 g对苯二酚和2 g的碳酸钾固体加入到250 mL三口烧瓶中，通入氮气至少10分钟，氮气充盈整个内环境后将5 ml的溴乙酸甲酯和100 ml的乙腈注射进三口烧瓶中加热到60℃反应48小时，反应结束后抽滤取液体旋干，最后通过少量的二氯甲烷和大量的乙醇在低温下进行重结晶得到单体M1。取10 mmol单体M1，略微过量的对二乙氧基苯醚60 mmol和5 mmol的三聚甲醛加入到圆底烧瓶中并加入100 mL的二氯甲烷，最后通过常压滴液漏斗将500微升的三氟化硼乙醚缓慢滴入烧瓶中反应4 h。通过乙酸乙酯与石油醚体积比为1比5的展开剂进行TCL点板监测反应进程，反应结束后加入等体积的饱和碳酸氢钠水溶液搅拌半小时，用水与二氯甲烷进行分液取有机相。最后选择有机相通过旋转蒸发仪旋干二氯甲烷，用乙酸乙酯比石油醚体积比为1比20的洗脱剂通过柱层析得柱芳烃P5-1，产率40%。最后取P5-1 10 mmol和稍微过量的NaOH 30 mmol加入到100 mL的圆底烧瓶中，加入40 mL的水并加热到100℃，反应24小时后取出静止到室温，最后加入稍过量的稀盐酸直到固体完全产生，抽滤取固体得对二羧基柱[5]芳烃AP。
Figure 2. Synthetic route to pillar[5]arene AP
图2. 柱[5]芳烃AP的合成路线
2.2.2. 双胺基修饰的柱[5]芳烃(CAP)的合成
双胺基修饰的柱[5]芳烃(CAP)的合成路线如图3所示，首先10 mmol的柱芳烃P5-1和过量的乙二胺加入到乙醇中反应加热24小时后通过旋转蒸发仪器旋干掉乙醇并用水和DCM分液处理，用水清洗3次以上后取有机相再次旋干以90%的产率得到固体对二胺基柱[5]芳烃CAP。
Figure 3. Synthetic route to pillar[5]arene CAP
图3. 柱[5]芳烃CAP的合成路线
2.2.3. 超分子凝胶的制备
将总质量36 mg柱芳烃CAP和柱芳烃AP以不同质量比(CAP:AP分别为3:1；2:1；1:1；1:2；1:3)溶解于2 mL DMSO/H2O (1:1)混合溶剂中，超声分散后水浴加热80℃维持半小时，待溶液澄清后冷却到室温得到淡黄色超分子凝胶。
3. 结果与讨论
3.1. A1/B1型柱芳烃的1H NMR
Figure 4. 1H NMR spectra of (a) P5-1 (CDCl3), (b) AP (DMSO-d6), and (c) CAP (DMSO-d6)
图4. 核磁氢谱图：(a) P5-1 (CDCl3)，(b) AP (DMSO-d6)，以及(c) CAP (DMSO-d6)
对二酯基柱[5]芳烃P5-1的核磁氢谱如图4(a)所示。其中比较具有代表性的出氢位置在低场环境下化学位移在6.8位置出现了2种峰形，证明了酯基单元的成功合成，而其与后面的中场化学位移在4.5和3.1位置的峰分别为酯基单元的亚甲基上的H和端基C上H的化学位移，其面积比分别为10:4和10:6也证明了成功合成了一种带有一个单元是对二酯基的柱芳烃。而化学位移在3.8附近的H为柱芳烃其他单元的亚甲基碳上的H出峰位置，而在3.7附近的峰是柱芳烃桥连C上的H的出峰位置，最后高场为柱[5]芳烃其他单元上的端基C上的H的出峰位置。
对氨基柱[5]芳烃CAP的核磁氢谱如图4(c)所示，其中比较具有代表性的峰形为在低场化学位移在6.8附近的H依旧是柱[5]芳烃的苯环上的H的出峰位置，而在中场位置中的原本在化学位移为3.1附近的峰面积消失，伴随着在中场化学位移为3.7附近的新峰出现，这是乙二胺C上的H的出峰位置，二者都证明了对氨基柱[5]芳烃被成功合成出来。
对羧基柱[5]芳烃AP的核磁氢谱如图4(b)所示，其中比较具有代表性的峰形为在低场化学位移在6.8附近依旧为柱芳烃苯环上H的出峰位置，而比较突出的特定是在中场位置，化学位移在4.25左右的峰原本是酯基与O相连C上的H，由于酯基反应成为羧基具有更高的吸电子能力因此化学位移向低场附近偏移，而同样的在中场化学位移为3.1附近的峰的消失也证明了酯基被成功脱去，进一步证明形成了对羧基柱[5]芳烃AP。
3.2. 凝胶的流变性能测试
Figure 5. (a) The storage (G′, black) and loss (G′′, red) moduli of the gels as a function of oscillation strain; (b) The rheological property of this gels as a function of the angular frequency (ω)
图5. (a) 凝胶的储能模量(G′，黑色)和损耗模量(G″，红色)随振荡应变的变化情况；(b) 凝胶的流变特性随角频率(ω)的变化情况
为了证明柱芳烃AP与CAP之间确实形成了凝胶，我们通过固定频率振幅测试来对其进行表征。如图5(a)所示，每个数据Gels后括号代表比例均为AP:CAP，当弹性模量(G')大于粘性模量(G′′)时，证明了凝胶化已经开始，通过不同比例的原料摩尔量进一步证明了AP:CAP = 1:1的超分子凝胶最为稳定。随后当应变力为0.1%时，对各组凝胶样品进行震荡应变扫描测试，这样才能保证是在线性粘弹区完成，而后我们又测试了其固定应变力角频率测试，结果如图5(b)所示。根据固定应变力角频率的测试发现，角频率从0.1到100 rad/s时，随着扫描频率的提高，增长的振幅逐渐保持不变，这体现了凝胶的软组织性(延展性)，其结果也说明了AP:CAP = 1:1时具有最大的稳定性。
为了研究超分子凝胶在被外力损伤后的恢复能力，我们进行了稳态剪切扫描曲线测定，如图6(a)所示。通过对不同比例的AP和CAP含量的凝胶测试，发现这些不同比例的凝胶均具备类固体流体剪切变稀的性质，而当AP:CAP = 1:1的凝胶显示出其对变稀的速度是最为缓慢的，这也说明其比其他比例的凝胶更稳定。此外，我们又对超分子凝胶进行了动态阶梯应变扫描测试来研究在外力作用下，其自修复的能力，也佐证了凝胶的稳定性。如图6(b)所示，5组不同比例的凝胶在0.1%应变力下所表现的粘弹性，通过外部应变力达到100%的应变后粘弹性降低，但在停止施力后在100秒内均可最大程度地恢复到至少80%，而可承受的施力大小也同样说明稳定性。
Figure 6. (a) Steady-state shear scanning curves of the supramolecular gels; (b) Dynamic step strain scanning curve of the supramolecular gels
图6. (a) 超分子凝胶的稳态剪切扫描曲线示意图；(b) 超分子凝胶的动态阶梯应变扫描测试示意图
3.3. 超分子凝胶的形貌
Figure 7. SEM image of supramolecular gel constructed from AP and CAP (AP:CAP = 1:1)
图7. 通过AP和CAP构筑的超分子凝胶的SEM图(AP:CAP = 1:1)
通过流变学性质的测试，我们发现当AP:CAP = 1:1时所形成的超分子凝胶性质最好，因此我们选择此比例下的凝胶进一步研究性能。首先我们通过SEM对超分子凝胶的微观形貌进行了表征，结果如图7所示，通过观察该凝胶的微观形貌可以看到该凝胶具备很多的孔洞结构，这种形貌证明了该凝胶具有优秀的载药能力，因其具备的孔洞可以极大可能地吸附药物分子。此外，通过柱芳烃空腔主客体相互作用力达到识别靶向客体分子进而实现搭载抗癌药物，对癌细胞进行靶向的治疗提供了必要的前提，而凝胶大多因为pH值，温度等外界刺激而发生结构的变化，进而实现药物的释放这一目的。
3.4. 超分子凝胶的生物相容性
良好的生物相容性是材料能够应用于生物体的前提，我们通过MTT实验来研究超分子凝胶的生物相容性。如图8(a)所示，当不同浓度的凝胶和HeLa细胞一起培养后，发现随着凝胶浓度的增加，细胞活性略有降低，但即使凝胶浓度高达80 μg时，细胞活性依然保持在80%以上，这展现了超分子凝胶对于细胞具有很好的生物相容性。而后的细胞死活荧光染色也进一步说明了超分子凝胶具有良好的生物相容性。如图8(b)和图8(c)所示，其中红色代表凋亡的细胞，绿色代表存活细胞。即便将所测的最大浓度(80 μg) MTT测试的凝胶检测其细胞死活染色的情况下，依旧显现了具有较多的绿色细胞(活)和极少量的红色细胞(死)。
Figure 8. (a) Cell viabilities of HeLa cells cultivated with AP-CAP-based supramolecular gel under different concentrations; (b) and (c) Fluorescence images of Calcein AM (live cells, green) and PI (dead cells, red) contained HeLa cells after treating with 5 μg and 80 μg supramolecular gel, respectively
图8. (a) 在不同浓度下，用基于AP-CAP 的超分子凝胶培养的海拉细胞(HeLa细胞)的细胞活性；(b)和(c)分别在用5微克和80微克超分子凝胶处理后，含有HeLa细胞的钙黄绿素AM (活细胞，呈绿色)和碘化丙啶(死细胞，呈红色)的荧光图像
3.5. 超分子凝胶的药物负载及抗肿瘤活性分析
Figure 9. (a) UV-vis spectra of different concentrations of DOX in water; (b) Standard curve made according to the maximum absorbance of different concentrations; (c) UV-vis spectra of 2 mg gel before and after adsorption in 20 mL DOX aqueous solution
图9. (a) 不同浓度DOX在水中的紫外吸收图谱；(b) 根据不同浓度的最大吸光度所做的标准曲线图；(c) 2 mg的凝胶在20 mL的DOX水溶液中吸附前后紫外吸收光谱
随后我们进行了超分子凝胶的载药能力测试，我们通过抗癌药物盐酸阿霉素DOX在不同浓度下的紫外吸收光谱图作出其浓度-最大吸收峰的标准曲线图，结果如图9(a)和图9(b)所示。在此基础上，我们对凝胶负载DOX的载药效率进行测试。由于凝胶的多孔结构可以有效负载DOX，通过紫外光度吸收仪对于上清液的紫外吸收峰测试，进而通过DOX的浓度变化而计算出凝胶的载药效率。图9(c)为2 mg的凝胶在20 mL的DOX水溶液下的上清液紫外吸收，可以推算出凝胶的载药量是35%，载药量的高低对后续的抗癌应用影响很大，而35%的高度载药量为抗癌应用提供了很好的基础。
我们进一步地研究了载药后的凝胶的抗肿瘤活性，MTT实验表明(图10(a))，即使浓度低至5 μg/mL，HeLa细胞的活性也会降至50%，随着浓度的增加，细胞活性显著降低，当浓度达到80 μg/mL时，细胞活性小于10%，这说明了凝胶载药后对HeLa癌细胞具有优秀的杀伤力。为了更清晰地研究凝胶载药后的抗肿瘤作用，我们对细胞进行了死活荧光染色，如图10(b)和图10(c)所示，其中红色代表凋亡的细胞，绿色代表存活细胞。当浓度为5 μg/mL时，出现相当多的红色细胞，而当浓度达到40 μg/mL时，所有细胞基本都呈红色，证明了其优异的肿瘤杀伤能力。
Figure 10. (a) Cell viabilities of HeLa cells cultivated with drug-loaded supramolecular gel under different concentrations; (b) and (c) Fluorescence images of Calcein AM (live cells, green) and PI (dead cells, red) contained HeLa cells after treating with 5 μg and 40 μg supramolecular gel, respectively
图10. (a) HeLa细胞在不同浓度的载药凝胶存在下的活性图；(b)和(c)分别是用5微克和40微克超分子凝胶处理后，含有HeLa细胞的钙黄绿素AM (标记活细胞，呈绿色)和碘化丙啶(标记死细胞，呈红色)的荧光图像
4. 结论
本文合成两种分别带有胺基和羧基官能团的A1/B1型柱芳烃，通过氢键将其在溶剂中进行分子间自组装，成功形成了超分子凝胶，然后通过流变学对该凝胶进行稳定性测试，最终找到了两者的最佳成胶比例为1:1，为后续载药做铺垫。接着通过MTT研究发现超分子凝胶具备了很好的生物相容性，同时还具备很好的载药能力，然后将载药后的凝胶对HeLa细胞同样进行MTT测试，发现即使在浓度较低的情况下，其对肿瘤细胞仍然具备很好的杀伤力，证明了其优异的抗肿瘤潜力。将柱芳烃修饰后应用于凝胶载药领域是一种十分新颖的思路，这为后续超分子化学领域下基于氢键来合成水凝胶开拓了前景。
基金项目
本课题由国家级大学生创新创业项目(202410304102Y)和南通大学高层次人才培育计划支持。
NOTES
*通讯作者。