1. 引言
随着化妆品行业的不断推陈出新，小分子肽类添加物越来越多地参与到化妆品研发和应用中，并且由于氨基酸组成不同，在化妆品中发挥的作用也多种多样，主要的功能有保湿、修复、抗过敏、抗氧化、紧致抗皱、抑制黑色素生成等[1]。小分子肽种类繁多，化妆品行业中常用的有肌肽、谷胱甘肽、铜肽、乙酰基六肽-8等[2] [3]，这些物质通过调节酶的活性、清除自由基、螯合重金属等原理而发挥作用，以安全、稳定、易吸收、效果好等优点引得人们关注，但国内和国外的法规中均没有明确规定化妆品中小分子肽的评价测试方法，不利于行业发展和市场监督。
目前国内外关于肽的检测方法研究主要集中于食品、生物医药等领域，分析方法主要有高效液相色谱法、液相色谱–串联质谱法、基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱、毛细管电泳法、分光光度法[4]-[9]。黄颖等[10]建立了一种利用毛细管电泳(HPCE)法同时测定脑脊液等生物体液中肌肽、鹅肌肽和高肌肽的检测方法。王宝平等[11]采用高效毛细管电泳法测定原料药肌肽的含量。化妆品中小分子肽的检测方法也偶有报道，如GOTTI等[12]通过衍生前处理后采用HPLC-FLD测定化妆品中的谷胱甘肽，毛善巧等[13]采用HPLC-UV测定化妆品中乙酰基六肽-8，陈意光等[14]采用液相色谱–串联质谱法测定化妆品中5种棕榈酰多肽的含量，测定下限均为2 μg/L。许勇[15]等通过高效液相色谱法测定化妆品中L-肌肽、乙酰基四肽-5、谷胱甘肽和乙酰基六肽-8的含量，检出限为30 mg/kg。上述方法存在检测种类少、覆盖范围小、检出限高等问题，本文拟建立采用液相色谱–串联质谱法同时测定化妆品中使用频率较高的7种小分子肽(主要包括肌肽、谷胱甘肽、铜肽、乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-7)的方法，弥补现有方法的不足，以期为企业提供有利的产品证明，让消费者使用的更加放心，并为政府实施监督管理提供技术支持。
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
甲醇、乙腈，HPLC，TEDIA公司，三氟乙酸，分析纯，麦克林公司，肌肽、谷胱甘肽等7种小分子肽，纯度 ≥ 95%，上海安谱实验科技有限公司和源叶生物。
超高效液相色谱串联四极杆质谱联用仪，5500+，SCIEX，纯水仪，Milli-Q，Millipore公司，离心机，2-16P，Sigma公司。
2.2. 实验方法
2.2.1. 液相色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18 3 mm × 100 mm，1.7 μm；
进样量：5 μL；
流速：0.3 mL/min；
柱温：40℃；
流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液，B相：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，梯度洗脱比例详见表1。
Table 1. Gradient elution ratio table
表1. 梯度洗脱比例表
时间/min |
A相/% |
B相/% |
0 |
98 |
2 |
1 |
98 |
2 |
4 |
35 |
65 |
5.5 |
5 |
95 |
7 |
5 |
95 |
7.1 |
98 |
2 |
10 |
98 |
2 |
2.2.2. 质谱条件
电离方式：ESI+；
离子源温度：500℃；
毛细管电压：ESI+：5500 V；
气帘气：30 psi；
雾化气：55 psi；
辅助气：55 psi；
监测模式：多反应监测(MRM)模式；
其他质谱参数见表2。
Table 2. Mass spectrometry parameters of 7 small molecule peptides
表2. 7种小分子肽质谱参数
检测物质 |
母离子 |
子离子 |
保留时间/min |
DP电压/V |
碰撞能/eV |
肌肽 |
227.1 |
210 |
1.76 |
85 |
18 |
227.1 |
110.1 |
1.76 |
85 |
32 |
227.1 |
156.2 |
1.76 |
85 |
20 |
铜肽 |
308.1 |
179.1 |
2.81 |
82 |
18 |
308.1 |
162.2 |
2.81 |
82 |
24 |
308.1 |
76.1 |
2.81 |
82 |
35 |
谷胱甘肽 |
341.2 |
195.1 |
1.89 |
100 |
24 |
341.2 |
178.1 |
1.89 |
100 |
33 |
341.2 |
110.2 |
1.89 |
100 |
45 |
续表
乙酰基六肽-8 |
307 |
129.1 |
6.44 |
100 |
25 |
307 |
246.2 |
6.44 |
100 |
19 |
307 |
306.6 |
6.44 |
100 |
10 |
棕榈酰五肽-4 |
402 |
129.3 |
6.17 |
100 |
27 |
402 |
436.3 |
6.17 |
100 |
22 |
402 |
234.1 |
6.17 |
100 |
27 |
棕榈酰三肽-5 |
695.5 |
255.3 |
6.85 |
120 |
50 |
695.5 |
296.4 |
6.85 |
120 |
55 |
695.5 |
158.2 |
6.85 |
120 |
55 |
棕榈酰四肽-7 |
445.4 |
359.6 |
3.96 |
100 |
28 |
445.4 |
172.1 |
3.96 |
100 |
32 |
445.4 |
295.2 |
3.96 |
100 |
31 |
2.3. 标准溶液的配制
分别准确称取肌肽、铜肽、谷胱甘肽、乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-7约10.0 mg于10 mL容量瓶中，用混合溶剂(水:甲醇:乙酸 = 60:30:10，体积比)溶解并定容至刻度，配成浓度约为1000 mg/L的标准储备溶液。
分别准确吸取适量各单一标准储备液至100 mL容量瓶中，用混合溶剂定容，配制成浓度为1.0 mg/L的混合标准中间溶液。分别移取适量混合标准中间溶液至10 mL容量瓶中，用混合溶剂定容，得到0.5、1、10、20、50、100 μg/L的混合标准工作溶液。
2.4. 供试品溶液的制备
准确称取样品0.2 g，精确至0.001 g，置于具塞比色管中，用水(1% NaCl)：甲醇:乙酸 = 6:3:1混合溶液定容至10 mL，摇匀，涡旋振荡60 s，以10,000 r/min离心5 min，经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。
3. 结果与讨论
3.1. 色质谱条件的优化
3.1.1. 色谱柱的选择
不同的色谱柱对多肽的吸附能力不同，从而使得各多肽的出峰时间不同，分离效果不同。实验考察了Waters BEH C18柱、Waters CSH C18柱、Waters HSS C18柱等色谱柱对7种多肽的分离效果，Waters CSH C18柱、Waters HSS C18柱均存在峰分离度差，出峰不完全，峰型不佳等情况，而BEH C18柱能够很好的将7种多肽分离开来，且各目标化合物的峰形良好，能通过对液相条件的优化调整可实现这7种多肽的完全分离，因此选择Waters BEH C18色谱柱作为适宜色谱柱。
3.1.2. 流动相比例选择
多肽测定文献大多选择水、乙腈、乙酸水溶液、甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液作为流动相。本实验为得到较好的分离度以及较快的分析时间，试验了不同的流动相组合对7种肽混合标准溶液进行分离，从实验结果来看，当采用梯度洗脱程序：0~1 min，0.1%三氟乙酸水溶液98%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液2%；1~4 min，0.1%三氟乙酸水溶液98%~35%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液2%~65%；4~5.5 min，0.1%三氟乙酸水溶液35%~5%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液65%~95%；5.5~7 min，0.1%三氟乙酸水溶液5%~5%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液95%~95%；7~7.1 min，0.1%三氟乙酸水溶液5%~98%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液95%~2%；7.1~10 min，5.5~7 min，0.1%三氟乙酸水溶液98%~98%，0.1%三氟乙酸乙腈溶液2%~2%时，混合标准溶液中7种多肽能够被完全分离，峰形良好，且分离混标溶液所需的时间较短，因此选择该程序为最优的梯度洗脱程序。在该条件下所得的谱图如图1所示。
1、肌肽：1.834 min；2、谷胱甘肽：2.891 min；3、铜肽：1.915min；4、棕榈酰三肽-5：6.460 min；5、棕榈酰五肽-4：6.181 min；6、棕榈酰四肽-7：6.869min；7、乙酰基六肽-8：4.013 min。
Figure 1. Standard spectra of 7 small molecule peptides
图1. 7种小分子肽标准谱图
3.2. 前处理方法优化
在25℃水浴中超声提取30 min的条件下，考察了水、0.1%三氟乙酸水溶液、30%乙腈水溶液、三氟乙酸水溶液、水:甲醇:乙酸 = 6:3:1、水(1% NaCl):甲醇:乙酸 = 6:3:1等5种不同提取溶剂对小分子肽的提取效率，结果如表3所示。实验发现，加入1% NaCl有助于化妆品中小分子肽的提取，因此适宜提取条件为：1%氯化钠水溶液:甲醇:乙酸 = 6:3:1，25℃下提取30 min。
Table 3. Extraction efficiency under different extraction solvents
表3. 不同提取溶剂下的提取效果
各目标化合物 |
不同提取溶剂下的提取效果/% |
水 |
0.1%三氟乙酸水溶液 |
30%乙腈水溶液 |
水:甲醇:乙酸=6:3:1 |
水(1% NaCl):甲醇:乙酸 = 6:3:1 |
肌肽 |
68 |
82 |
90 |
94 |
98 |
谷胱甘肽 |
77 |
95 |
88 |
95 |
102 |
铜肽 |
75 |
98 |
70 |
93 |
105 |
棕榈酰三肽-5 |
80 |
78 |
66 |
85 |
92 |
棕榈酰五肽-4 |
77 |
75 |
75 |
90 |
94 |
棕榈酰四肽-7 |
87 |
88 |
78 |
97 |
100 |
乙酰基六肽-8 |
82 |
86 |
71 |
95 |
101 |
3.3. 方法学考察
3.3.1. 标准曲线和检出限
将配制好的一系列标准工作溶液，在最优的仪器条件下进行分析，得到7种多肽的标准曲线。再分别以3倍信噪比(S/N = 3)来计算检出限，所得结果见表4。结果表明，7种小分子肽在对应线性范围内线性良好，各相关系数在0.99以上。
Table 4. Linear regression equations and detection limits for 7 peptides
表4. 7种多肽的线性回归方程和检出限
目标化合物 |
检出限/(μg/L) |
线性范围/(μg/L) |
线性回归方程 |
相关系数 |
肌肽 |
0.05 |
0.2~100 |
y = 19960x + 141 |
0.99976 |
谷胱甘肽 |
0.1 |
0.5~100 |
y = 2901x + 357 |
0.99614 |
铜肽 |
0.2 |
0.5~100 |
y = 3868x + 663 |
0.99744 |
棕榈酰三肽-5 |
0.05 |
0.2~100 |
y = 64549x + 101 |
0.99856 |
棕榈酰五肽-4 |
0.05 |
0.2~100 |
y = 26510x + 254 |
0.99987 |
棕榈酰四肽-7 |
0.05 |
0.2~100 |
y = 6350x + 230 |
0.99992 |
乙酰基六肽-8 |
0.05 |
0.2~100 |
y = 259x + 37 |
0.99724 |
3.3.2. 方法回收率及精密度
按试验方法对空白样品中加入7种小分子肽的标准溶液进行加标回收实验，在优化条件下平行测定6次，计算回收率与相对标准偏差，结果见表5。由表5可知，7种小分子肽的加标回收率在82.7%~109.5%之间，RSD在1.1%~6.7%之间，符合化妆品中7种小分子肽含量测定的要求。
Table 5. Recovery rate and precision of spiked blank samples
表5. 空白样品的加标回收率和精密度表
种类 |
加标量/(µg/L) |
平均回收率/% |
RSD/% (n = 6) |
肌肽 |
0.2 |
96.4 |
3.2 |
10 |
99.5 |
4.7 |
100 |
94.0 |
3.7 |
谷胱甘肽 |
1 |
85.8 |
5.1 |
10 |
91.1 |
6.0 |
50 |
95.5 |
1.5 |
铜肽 |
0.5 |
88.7 |
3.0 |
10 |
93.4 |
2.7 |
100 |
95.4 |
2.4 |
棕榈酰三肽-5 |
0.2 |
86.0 |
5.4 |
10 |
88.7 |
3.6 |
100 |
101.8 |
2.7 |
棕榈酰五肽-4 |
0.2 |
101.5 |
2.6 |
10 |
91.4 |
4.4 |
100 |
92.0 |
1.2 |
棕榈酰四肽-7 |
0.2 |
88.0 |
5.2 |
10 |
88.7 |
3.5 |
100 |
94.7 |
1.0 |
乙酰基六肽-8 |
0.2 |
87.4 |
5.8 |
10 |
90.9 |
3.9 |
50 |
104.7 |
2.2 |
3.4. 实际样品测试
按建立的实验方法对从市场上采购的不同品牌的20批次化妆品进行分析，结果表明，有5批次化妆品中检出铜肽，含量为0.10%~0.8%，有6批次化妆品中检出乙酰基六肽-8，含量为0. 01%~0.014%，5批次检出肌肽，含量为0.1%~0.3%，与标识相符，4批次未检出标识的小分子肽，说明有概念性添加或者未实际添加的情况。
4. 结论
本文通过优化设备参数和样品前处理条件，建立了采用液相色谱质谱法测定化妆品中7种小分子肽的定性定量方法，将该方法应用于20批次实际样品的测试，结果有4批次检测结果与标签标识不一致。所建立的方法涵盖种类多，前处理简单快速，方法选择性好，灵敏度高，精密度好，可用于化妆品中7种小分子肽的测定，有助于研发质量监控以及为政府监督提供技术依据。
基金项目
浙江省市场监督管理局科技计划项目(ZC2023047)。