结直肠癌组织中COL1A1、miR-143的表达水平和临床意义以及两者的相关性

The Expression Levels, Clinical Significance, and Correlation of COL1A1 and miR-143 in Colorectal Cancer Tissues

摘要: 目的：探讨COL1A1和miR-143在结直肠癌中的表达水平和临床意义以及两者的相关性。方法：收集80例结直肠癌患者的组织蜡块和50例结直肠癌患者的新鲜标本，分别用IHC和qRT-PCR检测COL1A1和miR-143的表达水平，并利用统计学方法分析两者表达水平的相关性及与患者临床病理参数的关系。结果：在结直肠癌组织中，COL1A1的表达高于癌旁组织(P < 0.001)，miR-143的表达低于癌旁组织(P < 0.001)，两者的相对表达量呈显著负相关且都与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P值 < 0.05)；结论：1) 在结直肠癌组织中，COL1A1的表达升高，miR-143的表达降低，且miR-143表达低时，COL1A1mRNA表达高，反之亦然；2) 两者表达水平都与肿瘤的直径、分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关。

Abstract: Objective: To investigate the expression level and clinical significance of COL1A1 and miR-143 in colorectal cancer and their correlation. Methods: Collect tissue wax blocks from 80 patients with colorectal cancer and fresh specimens from 50 patients with colorectal cancer. The expression levels of COL1A1 and miR-143 were detected by IHC and qRT-PCR, respectively, and the correlation between the expression levels of the two genes and their relationship with clinical pathological parameters were analyzed using statistical methods. Results: In colorectal cancer tissues, the expression of COL1A1 was higher than that of adjacent tissues (P < 0.001), and the expression of miR-143 was lower than that of adjacent tissues (P < 0.001). The relative expression levels of the two were significantly negatively correlated. All are related to tumor diameter, degree of differentiation, lymph node metastasis, TNM staging (P value < 0.05); Conclusion: 1) In colorectal cancer tissues, the expression of COL1A1 increases, the expression of miR-143 decreases, and when the expression of miR-143 is low, COL1A1mRNA expression is high, and vice versa; 2) Both expression levels are related to tumor diameter, degree of differentiation, lymph node metastasis and TNM stage.

1. 引言

结直肠癌(colorectal)是结肠癌、直肠癌和肛门癌的统称，是世界上最常见的恶性肿瘤之一。根据国外一份报告估计[1]，在2018年，全球新患结直肠癌的人数将会超过180万，而因这一疾病死亡的人数将超过88万。而结合相关数据分析[2]-[4]，最近几年来，我国的结直肠癌发病及死亡率仍在持续增长。结直肠癌给社会带来了巨大的负担，而越早进行诊断和治疗，患者的生存率越高，探寻相关的生物学标志物可提高结直肠癌的诊断水平并通过早期治疗降低患者的死亡风险[5]。microRNA-143 (miR-143)是miRNA家族成员之一，其编码基因位于人类第5号染色体上。2003年，miR-143被发现在结直肠癌中表达下调[6]；之后的研究[7] [8]表明miR-143可作为结直肠癌的生物学标志物并可对结直肠癌患者的病情进行评估；并且相关研究表明miR-143可通过调控其中某些基因的表达影响结直肠癌细胞的生物学行为[9] [10]。COL1A1 (胶原蛋白I型α1)与COL1A2 (胶原蛋白I型α2)共同组成I型胶原蛋白从而参与构成细胞外基质[11]；研究表明COL1A1可加快肿瘤细胞的增殖速度并促进其侵袭和转移[12]-[14]。通过targetscan数据库进行搜索发现COL1A1 (胶原蛋白I型α1)与miR-143存在结合位点(图1)，但COL1A1是否受到miR-143调控以及其在结直肠癌中的作用仍不明确。因此本研究先通过IHC (免疫组织化学染色)检测COL1A1蛋白在结直肠癌中的表达是否失调并分析其表达与相关临床参数是否存在关联性，并通过PCR检测COL1A1mRNA和miR-143在结直肠癌中的表达水平并分析两者的临床意义及相关性。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

收集80例2019年1月至2020年12月期间在大理大学第一附属医院进行结直肠癌根治术患者的组

Figure 1. The targetscan database shows that COL1A1 has binding sites to miR-143

图1. targetscan数据库显示COL1A1与miR-143有结合位点

织蜡块和其中50例患者的新鲜标本进行研究(我院伦理委员会已审核通过，并获得患者知情同意)，年龄范围34~81岁(中位数61)，≥60岁53例，<60岁27例；男性50例，女性30例；未分化、低分化肿瘤17例，中分化、高分化63例；肿瘤直径 ≥ 5 cm 41例，<5 cm 39例；有淋巴结转移37例，无淋巴结转移43例；TNM分期(以第8版AJCC TNM分期为标准)：I、II期41例，III、IV期39例；结肠癌29例，直肠癌51例。患者病检结果均确诊为结直肠癌，患者未患结直肠癌以外的癌症疾病且术前未接受过放疗、化疗和靶向治疗。

2.2. IHC检测结直肠癌中COL1A1的表达

将结直肠癌组织和癌旁组织进行切片，60℃烘烤切片1 h，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，通透封闭液(40 ml PBS + 120 μl Triton-100 + 400 μl 30% H₂HO₂)中孵育30 min，浸入pH 6.0柠檬酸钠加热以修复抗原，山羊血清封闭抗原，滴加COL1A1兔抗人多克隆抗体(成都正能生物) 4℃过夜，滴加羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育1 h，DAB显色液显色，根据颜色发展掌握终止染色的时间，苏木精染色、盐酸酒精分化，用梯度乙醇、二甲苯使切片脱水和透明，最后用中性树胶封片。实验结果评分由两名病理科医师共同进行，评分结果不一致时由第三名病理科医师进行评分，每个标本随机选取5个视野进行观察(10 × 40倍镜下)，评分标准如下：染色面积：<10%，0分；10%~25%，1分；25%~50%，2分；50%~75%，3分；>75%，4分；染色强度：无染色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分；总分 = 面积 × 强度。

2.3. qRT-PCR术检测miR-143、COL1A1mRNA的表达

TRIzol裂解液提取总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生物)合成cDNA，定量PCR仪(ABI7500)进行qRT-PCR实验。COL1A1上游引物：5'-AAGAAGGGTGGAGTTAGTGGG-3'，下游引物：5'-TTCAAAGTGGACATTGGGATT-3'；miR-143上游引物：5'-ACACTC-CAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3'，下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；反应程序设置如下：95℃预变性10 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 30 min，72℃延伸10 min，共40个循环。将actin作为内参基因，以3次实验的平均CT值作为为实验结果，计算miR-143、COL1A1mRNA的相对表达量。

2.4. 统计学方法

用统计学软件SPSS 24.0进行分析，COL1A1蛋白在癌组织与癌旁组织表达差异分析采用wilcoxon符号秩和检验，miR-143、COL1A1mRNA的表达差异分析采用t检验，三者与临床病理参数的关系采用χ²检验(当存在T < 5时，采用Fisher精确检验)，Pearson相关性分析miR-143、COL1A1mRNA的相关性，所有统计学结果均以P小于0.05代表有意义。

3. 结果

1) 免疫组化结果显示在结直肠癌标本、癌旁标本中都能观察到组织染色(图2)，wilcoxon符号秩和检验结果显示，相比与癌旁组织，癌组织中的COL1A1蛋白表达更高(P < 0.001) (图3)；将癌组织中COL1A1蛋白的表达水平根据其评分均数分为低表达组(评分 < 5.850)和高表达组(评分 ≥ 5.850)，分别与各项临床病理参数进行χ²检验(见表1)，检验结果表明在结直肠癌组织中，COL1A1蛋白的表达水平与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P < 0.05)；而与患者年龄、性别以及肿瘤位置无关(P > 0.05)。

(a)

(b)

Figure 2. Results of immunohistochemical staining. (a) Expression of COL1A1 protein in para-cancer tissues (10 × 10, 10 × 40); (b) Expression of COL1A1 protein in cancer tissue (10 × 40, 10 × 40)

图2. IHC染色结果。(a)：COL1A1蛋白在癌旁组织中的表达(10 × 10, 10 × 40)；(b)：COL1A1蛋白在癌组织中的表达(10 × 10, 10 × 40)

Figure 3. Immunohistochemical staining score results of COL1A1 protein

图3. COL1A1蛋白IHC染色评分结果

Table 1. Chi-square test results of COL1A1 protein expression level and related parameters

表1. COL1A1蛋白表达水平与相关参数的χ²检验结果

参数	例数	COL1A1蛋白表达水平		χ^2	P值
		低表达	高表达
年龄(岁)				0.013	0.910
≥60	53	17	36
<60	27	9	18
性别				0.745	0.388
男	50	18	32
女	30	8	22
分化程度				4.231	0.040
中、高	63	24	39
未、低	17	2	15
肿瘤直径(cm)				9.124	0.003
≥5	41	7	34
<5	39	19	20
淋巴结转移				8.320	0.004
有	37	6	31
无	43	20	23
TNM分期				4.984	0.026
I、II	41	18	23
III、IV	39	8	31
肿瘤位置				0.380	0.538
结肠	29	11	19
直肠	51	15	35

2) COL1A1mRNA在结直肠癌组织中的表达水平为4.345 ± 1.376，癌旁组织为1.529 ± 0.252，在癌组织中的COL1A1mRNA表达高于癌旁组织(t = 15.645, P < 0.001) (图4)。以COL1A1mRNA在癌组织中表达水平的均数(4.345)为界将50例结直肠癌患者分为低表达组(<4.345) 29例和高表达组(≥4.345) 21例，分别与各项临床病理参数进行χ²检验(见表2)，检验结果表明在结直肠癌组织中，COL1A1mRNA的表达水平与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P < 0.05)；而与患者年龄、性别以及肿瘤位置无关(P > 0.05)。

Table 2. The relationship between COL1A1mRNA expression level and clinicopathological parameters

表2. COL1A1mRNA表达水平与临床病理参数的关系

临床病理参数	例数	COL1A1mRNA表达水平		χ^2	P值
		低表达	高表达
年龄(岁)				0.351	0.574
≥60	36	16	20
<60	14	5	9
性别				1.3665	0.242
男	31	15	16
女	19	6	13
分化程度				——	0.031
中、高	40	20	20
未、低	10	1	9
肿瘤直径(cm)				4.711	0.03
≥5	28	8	20
<5	22	13	9
淋巴结转移				4.918	0.027
有	21	5	16
无	29	16	13
TNM分期				7.177	0.007
I、II	27	16	11
III、IV	23	5	18
肿瘤位置				0.867	0.352
结肠	18	6	12
直肠	32	15	17

Figure 4. Relative expression of COL1A1mRNA in both tissues

图4. COL1A1mRNA在两种组织中的相对表达量

3) 在结直肠癌组织和癌旁组织中，miR-143的表达水平分别为0.100 ± 0.044、0.377 ± 0.119，miR-143在癌组织中的表达水平低于癌旁(t = −21.085, P < 0.001) (图5)；以miR-143在结直肠癌组织中相对表达量的均数(0.100)为界将50例结直肠癌患者分为低表达组27例(<0.100)和高表达组23例(≥0.100)，分别与各项临床病理参数进行χ²检验(见表3)，检验结果表明在结直肠癌组织中，miR-143的表达水平与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P < 0.05)；而与患者年龄、性别以及肿瘤位置无关(P > 0.05)。

Figure 5. The relative expression of miR-143 in both tissues

图5. miR-143在两种组织中的相对表达量

Table 3. Analysis of miR-143 expression levels and clinicopathological parameters

表3. miR-143表达水平与临床病理参数的分析

临床病理参数	例数	miR-143表达水平		χ^2	P值
		低表达	高表达
年龄(岁)				0972	0.324
≥60	36	21	15
<60	14	6	8
性别				0.023	0.879
男	31	17	14
女	19	10	9
分化程度				——	0.014
中、高	40	18	22
未、低	10	9	1
肿瘤直径(cm)				11.022	0.010
≥5	28	22	6
<5	22	5	17
淋巴结转移				7.177	0.007
有	21	16	5
无	29	11	18
TNM分期				4.154	0.042
I、II	27	11	16
III、IV	23	16	7
肿瘤位置				1.817	0.178
结肠	18	12	6
直肠	32	15	17

4) 将结直肠癌组织的COL1A1mRNA与miR-143相对表达量进行Pearson相关性分析，发现两者的相对表达量呈显著负相关(r = −0.833, P < 0.001) (图6)。

Figure 6. Linear correlation diagram of miR-143 and COL1A1

图6. miR-143和COL1A1的线性相关图

4. 讨论

microRNA (miRNA)是一类单链小RNA分子，具有强大的基因调控能力，这种能力是与信使RNA的3’-utr定向结合来发挥的，两者结合后mRNA被沉默或分解，靶基因的表达由此被调控[1] [15]。miR-143是miRNA家族成员之一，相关研究表明miR-143可能是结直肠癌的生物学标志物并可对结直肠癌患者的病情进行评估，如：Mohammad等[7]发现结直肠癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移与血清中的miR-143表达降低相关；Qian等[8]发现结直肠癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移与组织中的miR-143表达降低相关。本研究结果表明miR-143在结直肠癌中低表达，并且与肿瘤的大小、分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关，与目前的研究结果基本一致，但本研究还发现miR-143与结直肠癌细胞的分化程度，再次表明miR-143可作为结直肠癌的生物学标志物。

通过targetscan数据库进行搜索发现COL1A1 (胶原蛋白I型α1)与miR-143存在结合位点(图1)，但COL1A1在结直肠癌中的作用尚不明确。由COL1A1参与组成的I型胶原蛋白是细胞外基质的主要结构蛋白，目前有观点[16] [17]认为：肿瘤来源的外泌体能介导肿瘤相关成纤维细胞(CAF)激活从而使COL1A1分泌增强，而COL1A1的表达失调会导致I型胶原的功能受到影响并通过影响细胞外基质的生物物理特性来影响肿瘤的发生发展。Liu等[18]发现当COL1A1被敲除之后，乳腺癌细胞的转移过程受到抑制；Wang等[19]通过调控COL1A1在胃癌细胞中的表达发现COL1A1高表达能够使肿瘤细胞的增殖加快并促进其迁移和侵袭；而在口腔鳞癌中，下调COL1A1能够减缓肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的侵袭和有丝分裂过程[20]。通过IHC和PCR技术检测COL1A1在结直肠癌中的表达并通过统计学分析发现COL1A1蛋白、mRNA在结直肠癌中的表达水平均上调，且都与肿瘤的直径、分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关，这说明COL1A1可作为结直肠癌的生物学标志物，并且可能参与了结直肠癌的发生发展。

miR-143被认为是结直肠癌的生物学标志物可通过调控某些基因的表达影响肿瘤细胞的生物学行为，寻找miR-143的下游靶基因能更进一步挖掘miR-143在结直肠癌发生发展中的作用。目前的研究发现：miR-143上调能降低整合素α6 (ITGA6)和Arf GTPase激活蛋白(ArfGAP)的表达从而抑制体外结直肠癌细胞的侵袭和转移[9]；转染miR-143后，结肠癌细胞中的ERK5蛋白的表达水平降低，从而影响肿瘤细胞的生物学功能[21]；miR-143与KRAS的信使RNA靶向结合，并通过下调KRAS表达来抑制肿瘤细胞的生长[22]。targetscan 数据库显示COL1A1是miR-143的预测靶基因，而本研究结果表明结直肠癌组织中的COL1A1mRNA表达水平与miR-143表达水平呈负相关；说明在结直肠癌中，COL1A1的表达可能受到miR-143的调控。

总而言之，本研究结果表明在结直肠癌中miR-143低表达、COL1A1高表达，两者都可作为结直肠癌的生物学标志物，并且COL1A1的表达可能受到miR-143的调控。因此可以合理推测结直肠癌中存在这样的机制：miR-143表达水平降低导致COL1A1高表达，从而促进了结直肠癌的发展。理论上可在结直肠癌中通过体外细胞实验研究三者之间存在的调控关系，在后续的实验可进一步探究miR-143、COL1A1对结直肠癌细胞增殖和转移的影响，尝试为探索结直肠癌的发病机制和治疗提供新的方向。

基金项目

1) 云南省教育厅科学研究基金(2023Y0983)；

2) 大理大学第一附属医院临床医学学科队伍建设项目(DFYGG2022-17)；

3) 云南省科技厅地方高校联合专项课题–面上项目；《Linc00460-miR143-COL1A1表达调控网络在结直肠癌细胞增殖和转移的作用机制研究》；项目编号：201901O070147。

NOTES

^*通讯作者。