1. 引言
艾纳香(Blumea balsamifera)是一种多年生草本或亚灌木植物，属于菊科艾纳香属。它通常见于贵州、云南和广西等的山区、河岸以及湿地等自然生境[1]。在药用领域，艾纳香因其多样的药用特性而备受重视，成为一种极具价值的药用植物。具体而言，艾纳香的地上部分可用于治疗风寒引起的感冒和外伤，具有驱风、除湿和活血解毒的功效[2]。从其叶片中提取的艾纳香油则具有消炎解毒和缓解疼痛的作用，适用于蚊虫叮咬和烧伤的治疗[2]。此外，艾纳香经过加工制成的艾片可用于提神醒脑和缓解热病引起的疼痛，适用于昏迷和中耳炎等病症[3]。艾片精制过程中所得油状物被称为艾纳香油，艾片和艾纳香油是咽康含片、金喉健喷雾剂、咽立爽口含滴丸、复方一枝黄花喷雾剂、万金香气雾剂、心胃止痛胶囊等中成药的重要成分[4]。艾纳香独特的香气也使其成为化妆品行业的理想原料。因此，以艾纳香为基础的新产品开发有潜力带来显著的社会和经济效益。
艾纳香含有挥发油、黄酮类、倍半萜类、苯丙素类等化学成分，具有抗菌、抗炎、镇痛、治疗烧烫伤等药理作用。苯丙素是天然存在的一类苯环与三个直链碳连接(C6-C3基团)构成的化合物。一般具有苯酚结构，是酚性物质。在生物合成上，苯丙素类化合物多数由莽草酸通过苯丙氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸，经脱氨、羟基化等一系列反应形成。苯丙素是影响植物生长发育的一类关键物质，是许多结构聚合物的重要组成部分，可抵御紫外线，抵御食草动物和病原体，作为花色素和气味化合物介导植物与传粉者的相互作用。
咖啡酸氧甲基转移酶可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化，在合成苯丙素类化合物的生物合成途径中具有重要作用。常见的苯丙素类主要包括香豆素、木脂素、木质素、简单苯丙素类等。COMT是较早发现的参与木质素单体生物合成的关键酶，可以催化咖啡酸(caffeic acid)、咖啡醛(caffe aldehyde)和咖啡醇(caffeyl alcohol)的氧甲基化反应[5]-[10]。自1991年Bugos等[11]首次从杨树中克隆出COMT基因，目前已有众多COMT基因从植物中克隆获得，包括拟南芥、小麦、高粱、苜蓿、甘蔗等[12]。在杨树、烟草、苜蓿、玉米等植物中的研究均表明，抑制表达COMT时，木质素含量显著降低，且影响不同类型木质素单体在木质素总量中的比例[13]-[16]。
目前关于COMT的报道较少，本研究首次从艾纳香中克隆得到COMT基因，命名为BbCOMT，并对其进行生物信息学分析，为阐明艾纳香BbCOMT基因的功能提供了科学依据，也为了解艾纳香苯丙素类化合物生物合成途径提供了分子基础。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
艾纳香(Blumea balsamifera (L.) DC.)材料取自贵州省罗甸县红水河岸，并长期保存在−80℃冰箱中备用。
2.2. 主要试剂
pET32a载体、Jm109感受态由本实验室保存；Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit (百迈克生物科技)；BamH I、Hind III、pMDTM18-T Vector Cloning Kit (宝日医生物技术有限公司)；DL2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master MixII、T4 DNA Ligase、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；逆转录试剂盒、基因测序(生工生物工程股份有限公司)。
2.3. 总RNA提取及cDNA的合成
利用植物RNA提取试剂盒，提取艾纳香叶片总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳验证其RNA完整性。使用逆转录试剂盒进行逆转录，得到艾纳香的cDNA。
2.4. BbCOMT基因的克隆
依据转录组测序结果，设计正反向引物序列，以cDNA为模板，摸索合适的引物退火温度。经过电泳验证结果后，利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。与pMD18-T载体16℃过夜连接，转化JM109感受态细胞，接种阳性克隆，进行测序。
2.5. BbCOMT的生物信息学分析
分别利用ExPASy ProtParam (蛋白理化性质)、ExPASy-ProtScale (亲/疏水性)、Cell-PLoc (亚细胞定位)、NCBI CD-search (结构域)、SignalP 4.1 (信号肽)、TMHMM 2.0 (跨膜结构)、SOPMA (二级结构)、SWISS-MODEL (三级结构)等在线分析软件对BbCOMT进行生物信息学分析，同时借助NCBI BLAST-blastp、DNAMAN和Mega 7.0进行多序列比对和系统进化树构建。
3. 结果与分析
3.1. 艾纳香BbCOMT基因的克隆
从艾纳香转录组数据中筛选得到1条咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)候选基因，该序列包含完整的开放阅读框(open reading frame, ORF)，含有起始密码子ATG和终止密码子TAA，序列全长为1062 bp，命名为BbCOMT (图1)。提取艾纳香叶片总RNA，逆转录得到cDNA，参考转录组测序结果，利用Primer Premier软件设计其特异性引物，设计正向引物序列COMT-F：GGCAACGAACAAATCAGT和反向引物序列COMT-R：CACAAAGGATGATAATTTTACTT，通过PCR扩增得到包含完整CDS序列的COMT基因全长序列，并连接至pMD18-T载体，转入Jm109感受态中，通过菌液PCR和双酶切验证(图2)并进行基因测序。
Figure 1. Gene sequence of BbCOMT from Blumea balsamifera DC. Note: Green: The initiation codon; Red: The termination codon
图1. 艾纳香BbCOMT基因序列。注：绿色：起始密码子；红色：终止密码子
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of BbCOMT. Note: M: DL2000 DNA Marker; (a): Agarose gel electrophoresis of PCR products; (b): Agarose gel recovery product; (c): Enzyme test of bacterial clone; Wire frame: Target band
图2. BbCOMT基因克隆凝胶电泳。注：M：DL2000 DNA Marker；(a)：PCR产物琼脂糖凝胶电泳；(b)：琼脂糖凝胶回收产物；(c)：基因克隆的质粒与酶切验证；线框：目的条带
3.2. 艾纳香BbCOMT蛋白的生物信息学分析
3.2.1. 理化性质分析
利用ExPASy ProtParam在线工具对BbCOMT蛋白的理化性质进行分析，结果显示，BbCOMT蛋白的分子式为C1786H2789N467O512S21，相对分子质量是39KD，BbCOMT理论等电点为5.96；不稳定指数是20.84 < 40，该蛋白比较稳定；脂肪系数为96.63。氨基酸组成中带负电荷残基为43个，带正电荷残基为34个。
通过ExPASy-ProtScale在线软件对BbCOMT蛋白的亲/疏水性进行预测，结果显示，该蛋白疏水性的最高值为2.078，亲水性最低值为−2.656，预测该BbCOMT蛋白为亲水性蛋白(图3)。利用Cell-PLoc在线工具对BbCOMT蛋白的亚细胞定位进行预测，结果显示，BbCOMT蛋白可能定位于叶绿体中。
Figure 3. Hydrophilic/hydrophobic prediction of BbCOMT
图3. BbCOMT的疏水性/亲水性预测
3.2.2. 结构域、信号肽和跨膜区预测分析
利用NCBI CD-search对蛋白质的结构域进行预测(图4)。结果表明，该BbCOMT蛋白在第25位至76位氨基酸含有二聚体结构域，在第130位至334位氨基酸含有AdoMet-MTase结构域。
Figure 4. Conserved domains prediction of BbCOMT
图4. BbCOMT保守结构域预测
利用SignalP 4.1进行信号肽预测(图5)。结果显示，最大值C = 0.224，Y = 0.198，S = 0.432，平均S = 0.174，平均D = 0.185，均小于0.45，证明该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白。利用TMHMM 2.0进行跨膜结构预测(图6)。结果显示，BbCOMT中有一个跨膜结构域，推测该蛋白为跨膜蛋白。
Figure 5. Signal peptide prediction of BbCOMT
图5. BbCOMT信号肽预测
Figure 6. Transmembrane domain prediction of BbCOMT
图6. BbCOMT跨膜域预测
3.2.3. 二级结构、三级结构预测和磷酸化位点分析
利用SOPMA网站预测BbCOMT蛋白的二级结构(图7)。结果显示，BbCOMT中α-螺旋有124个，占比35.13%，无β-转角，延伸链62个，占比17.56%，无规则卷曲167个，占比47.31%；表明该蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主要组成部分。同时，利用SWISS-MODEL在线工具预测了BbCOMT蛋白的三级结构(图8)。
Figure 7. Secondary structure prediction of BbCOMT
图7. BbCOMT二级结构预测
Figure 8. Tertiary structure prediction of BbCOMT
图8. BbCOMT三级结构预测
3.2.4. 多序列比对和进化树分析
将BbCOMT的氨基酸序列用National Center for Biotechnology Information在线软件进行BLAST比对，利用DNAMAN将青蒿(Artemisia annua) (PWA56118.1)、苦苣(Cichorium endivia) (KAI3512546.1)、菊苣(Cichorium intybus) (KAI3737699.1)、大蓟(Cirsium japonicum) (QQH14891.1)、除虫菊(Tanacetum cinerariifolium) (GEV60961.1)、向日葵(Helianthus annuus) (XP_022033982.1)的氨基酸序列与BbCOMT的氨基酸序列进行多序列比对分析(图9)。结果表明，BbCOMT与青蒿的氨基酸相似性最高，为72.39%。并利用MEGA 7.0构建NJ系统发生进化树，结果表明，艾纳香中的BbCOMT与青蒿聚在同一分支，说明其亲缘关系较近，与多序列比对结果一致(图10)。
Figure 9. Multiple sequence alignment
图9. 多序列比对
Figure 10. Construction of phylogenetic tree
图10. 系统进化树构建
4. 讨论
艾纳香为菊科艾纳香属多年生草本或亚灌木植物，是中药艾片、民族药艾纳香油的唯一基原。艾纳香含有挥发油、黄酮类、倍半萜类、苯丙素等化学成分。艾纳香功能主治最早出现孙思邈的《备急千金要方》，用于口臭、体臭的治疗。随后，陈藏器在《本草拾遗》中记载：“艾纳香，主癣辟蛀”；《海药本草》云：“谨按《广志》云：主伤寒，五泄；主心腹注气，下寸白，止肠鸣，烧之，辟温疫，合螫窠；浴脚气，甚良”；《开宝本草》：“去恶气，杀虫，主腹冷泄”；《全国中草药汇编》：“感冒，风湿关节炎，产后风痛，痛经，外有治跌打损伤，疮疖痛肿、湿疹、皮炎”；《中药辞海》记载：“祛风除湿，活血散瘀，杀虫，主治寒湿泻痢，腹痛肠鸣，肿胀，筋骨疼痛，跌打损伤，癣疮”；《中华本草(苗药卷)》记载，《贵州苗族药物彩色图集》：“抗菌，消炎，消肿，止痒，止痛”。
苯丙素类是艾纳香中重要的化学成分。苯丙素类成分是自然界中一类非常重要的天然有机化合物。五加科五加属植物中富含大量的苯丙素类成分，现代药理研究表明，五加属植物中的苯丙素类成分主要有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、改善心脑血管系统、改善神经系统等药理作用[17]。来江藤是玄参科来江藤属植物来江藤的干燥茎叶，抗氧化实验结果表明，来江藤苯丙素类成分具有较强的抗氧化能力[18]。据文献报道，苯丙素类化合物还具有抗氧化、抗疲劳、抗炎抑菌、抗病毒活性、降尿酸、调节糖脂代谢等多种药理作用[19]-[23]。
咖啡酸氧甲基转移酶可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化，是植物苯丙素途径的关键酶。COMT可催化咖啡酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，参与了芥子醇和松柏醇合成的甲基化反应[10]。研究发现，咖啡酸-O-甲基转移酶除了催化苯丙素和类黄酮类化合物的甲基化，某些COMT还具有类似褪黑素生物合成过程中N-乙酰-5-羟色胺甲基转移酶的作用，不仅能够催化N-乙酰-5-羟色胺生成褪黑素，还能够催化5-羟色胺生成5-氧甲基色胺[24]-[26]。孙莎莎等[27]过表达SlCOMT1提高了番茄内源褪黑素的含量和耐盐性，同时提高了干旱胁迫下番茄植株的光合作用和抗氧化能力，诱导了胁迫相关信号基因的表达，提高了番茄抗旱能力。
综上所述，对艾纳香BbCOMT基因进行克隆及生物信息学分析，可为后续构建表达载体进而验证基因功能奠定良好基础，例如构建原核表达载体可通过体外酶活检测验证出基因功能。本研究为艾纳香中咖啡酸氧甲基转移酶的生物学研究提供重要依据，并为其他植物COMT基因的研究提供思路，弥补了菊科药用植物艾纳香COMT基因相关研究的空缺，同时为艾纳香中苯丙素类化合物生物合成途径提供理论指导。
NOTES
*通讯作者。