摘要: 目的：利用网络药理学方法探讨“佛手–香橼”药对在心绞痛患者中的临床价值。方法：本研究拟以“佛手–香橼”为研究对象，采用Cytoscape 3.7.2构建“活性成分–靶点”网络图谱。通过GeneCards数据库收集心绞痛的相关靶点，将药物的有效靶点与疾病相关靶点进行关联，选取交集靶基因上传STRING 11.0数据库建立蛋白质相互作用网络，并导入Cytoscape 3.7.2对其进行处理。利用Metascape平台对其进行GO富集分析与KEGG Pathway富集分析。结果：共获得佛手和香橼活性成分12个，对应靶点278个，心绞痛相关靶点4478个。药物–疾病作用核心靶点98个，其中包括AKT1、PPARG、PTGS2、SRC、BCL2、MAPK3、EGFR等。结论：通过上述研究，初步阐明“佛手–香橼”对心绞痛“多途径，多靶点”的作用机理，为“佛手–香橼”在冠心病心绞痛防治中的应用提供新的研究思路和理论依据。
Abstract: Objective: To investigate the clinical value of the “bergamot-citron” drug pair in angina pectoris patients using a network pharmacology approach. Methods: In this study, we used “bergamot-citron” as the research object, and Cytoscape 3.7.2 was used to construct an “active ingredient-target” network map. The GeneCards database was used to collect angina pectoris-related targets, correlate the effective targets of the drugs with the disease-related targets, select the intersecting target genes and upload them to the STRING 11.0 database to establish a protein interaction network, which was then imported into Cytoscape 3.7.2 for processing. The Metascape platform was used for GO enrichment analysis and KEGG Pathway enrichment analysis. Results: A total of 12 active components of bergamot and citron were obtained, corresponding to 278 targets, and 4478 angina-related targets. There were 98 drug-disease action core targets, including AKT1, PPARG, PTGS2, SRC, BCL2, MAPK3 and EGFR, etc. Conclusion: Through the above study, the mechanism of “multi-pathway, multi-target” of “bergamot-citron” on angina pectoris was initially elucidated, providing new research ideas and new applications of “Bergamot-citron” in the prevention and treatment of angina pectoris in coronary heart disease.
1. 引言
心绞痛是由于冠状动脉供血不足，引起心肌急剧、暂时缺血与缺氧的临床综合征，是冠心病最常见的表现[1]。由于与心血管病(CVD)密切相关的不良方式，如不健康饮食、缺乏锻炼、吸烟等庞大的心血管危险因素人群的存在，导致CVD的发病率及病死率仍在上升。我国现CVD患者数据推算3.3亿，冠心病仅次于脑卒中为1139万，冠心病病死率自2012~2020年呈持续上升趋势，由此造成的心血管疾病负担已成为重大的公共卫生问题[2]。目前，冠心病患者药物治疗类别主要包括减少心绞痛症状和活动引起的缺血，并预防心血管事件；涉及的药物主要有抗栓、调血脂、抗心肌缺血以及改善预后和控制血糖的药物等[3]。但部分患者由于受到基因多态性的影响，可能会导致药物疗效降低或毒性增加等，且长期应用可能存在诸多不良反应的发生[4]。美国俄克拉何马州立大学健康科学中心研究报告，硝酸脂类防治心绞痛药物治疗期间导致的不良反应很常见，有82%的患者会出现头痛反应，约10%的患者因头痛或头晕不能耐药而撤药，其他患者的头痛为轻中度，能恢复或缓解而继续硝酸脂类药治疗[5]。因此，迫切需要探索行之有效的中西医诊疗手段。
佛手为芸香科植物佛手(Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle)的干燥果实，其味辛、苦、酸，性温，归肝、脾、胃、肺经。香橼为芸香科植物枸橼(Citrus medica L.)、香圆(Citrus wilsonii Tanaka)的干燥成熟果实，其味辛、苦、酸、温，归肝、脾、肺经[6]。佛手–香橼是临床常用的治疗心绞痛的药对。为了探究佛手–香橼药对治疗心绞痛的作用机制，本研究应用网络药理学，筛选佛手–香橼的有效成分及其作用靶点，通过生物功能及通路富集等分析其潜在的作用机制，以期为佛手–香橼配伍的临床应用提供新的理论依据，为临床辅助治疗心绞痛以及开发新药提供新的参考。
2. 资料与方法
2.1. 佛手–香橼药对的活性成分及作用靶点的筛选
基于中药系统药理学分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP) [7]，检索佛手–香橼两味中药的化学成分，筛选生物口服利用度(oral availability, OB) ≥ 30%，且类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18的化合物，并且获取它的作用靶点。将基因作用靶点与相对应的活性成分上传到“Cytoscape3.7.2”中，构建香橼–佛手“活性成分–靶点”网络。
2.2. 心绞痛相关基因的筛选并获取“药物–疾病”交集基因
通过Genecard数据库，以“angina pectoris”为关键词进行检索，得到4487个与心绞痛相关的基因，根据Score值大于中位数筛选出关键基因1568个，将得到的1568个与心绞痛相关的基因与佛手–香橼药对的靶基因取交集，得到98个“药物–疾病”交集基因，并绘制韦恩图以展示二者的联系。
2.3. 蛋白相互作用网络构建及核心靶点收集
将“2.2”项中经Venny2.1.0在线软件做出的重合靶点导入String数据库(https://stringdb.org/)进行检索，将“物种”设置为“Homo sapiens”，设置最低相互作用得分等于0.400。获得蛋白相互作用的结果，导入Cytoscape3.6.1软件从而构建PPI网络。
3. 结果
3.1. 佛手–香橼活性成分的收集及网络构建
通过TCMSP数据库筛选，共得到佛手活性成分81个及香橼活性成分47个。符合筛选条件OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18的活性成分分别为佛手5个，香橼7个，见表1。将基因靶点与对应活性成分输入“Cytoscape 3.7.2”，构建佛手–香橼“活性成分–靶点”网络。见图1。
Table 1. Screening of the main active ingredients of bergamot-citrus medicinal pairs
表1. 佛手–香橼药对主要活性成分筛选
化合物ID |
化合物名称 |
OB (%) |
DL |
中药名称 |
MOL001323 |
Sitosterol alpha 1 (α1-谷甾醇) |
43.28 |
0.78 |
佛手 |
MOL013253 |
5,2’,5’-Trihydroxy (三羟基)-6,7,8-trimethoxyflavone (三甲氧基黄酮) |
37.49 |
0.43 |
佛手 |
MOL001506 |
Supraene (角鲨烯) |
33.55 |
0.42 |
佛手 |
MOL002881 |
Diosmetin (香叶木素) |
31.14 |
0.27 |
佛手 |
MOL002917 |
5,2’,6’-Trihydroxy-7 (三羟基), 8-dimethoxyflavone (二甲氧基黄酮) |
45.05 |
0.33 |
佛手 |
MOL013348 |
cryptoflavin (隐黄素) |
69.87 |
0.58 |
香橼 |
MOL013349 |
luteoxanthin (黄体呋喃素) |
64.29 |
0.54 |
香橼 |
MOL013350 |
mutatoxanthin (玉米黄呋喃素) |
66.27 |
0.55 |
香橼 |
MOL013352 |
Obacunone (黄柏酮) |
43.29 |
0.77 |
香橼 |
MOL002341 |
Hesperetin (橙皮素) |
70.31 |
0.27 |
香橼 |
MOL002773 |
beta-carotene (β-葫萝卜素) |
37.18 |
0.58 |
香橼 |
MOL000358 |
beta-sitosterol (β-谷甾醇) |
36.91 |
0.75 |
香橼 |
Figure 1. Bergamot-citron drug-pairing component target network map
图1. 佛手–香橼药对成分靶点网络图
3.2. 佛手–香橼活性成分抗心绞痛的潜在作用靶点预测
在TCMSP数据库中获取“3.1”项中佛手–香橼的有效成分相对应的靶蛋白，去除无意义和重复的靶点之后，获取到佛手–香橼的活性成分相互作用靶点总共278个。利用GeneCards数据库对冠心病心绞痛的靶点进行分析，获得了冠心病心绞痛的相关靶点共4487个，通过Score值大于中位数的方法获取关键基因共1568个。利用维恩图在线绘制平台制作维恩图。见图2。
Figure 2. Venn diagram of bergamot-citron drug pair active ingredient targets versus angina targets
图2. 佛手–香橼药对活性成分靶点与心绞痛靶点Venn图
3.3. 药物–疾病关键靶点PPI构建
将关键交集靶点基因98个导入至STRING平台构建PPI，得到了PPI网络中的98个节点和996条边，并把这个网络中的各个节点信息上传到“Cytoscape 3.7.2”中，加工制作出PPI网络图，见图3。在此基础上，结合相关文献，对各节点Degree值、紧密度和介度等信息与心绞痛进行相关性分析。其中与心绞痛关联程度较高的靶点主要有AKT1、PPARG、PTGS2、SRC、BCL2、MAPK3、EGFR等。
Figure 3. PPI network of the bergamot-citron drug pair acting on angina pectoris targets
图3. 佛手–香橼药对作用于心绞痛靶点的PPI网络图
4. 讨论
流行病学调查发现，中国现有冠心病患者约1100万，死亡率约为110/10万[8]。冠脉粥样硬化是冠心病的主要病理学基础，患者在过度劳累、情绪激动时可诱发稳定型心绞痛。舌下含服硝酸甘油虽然可暂时性缓解心绞痛症状，但其并不能有效控制心绞痛复发[9] [10]。而心绞痛反复发作可引起心室重构，进一步加重冠心病病情[11] [12]。当前中医药治疗心血管疾病的疗效已经得到临床的认可。
通过PPI网络构建获得了与心绞痛关联程度较高的靶点，其中AKT1具有抗炎、调血脂等作用，在治疗心绞痛时主要发挥的作用是降血脂，还在血管重塑、血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖及迁移中起到重要作用[13]。AKT1是血管重塑和动脉粥样硬化形成期间体内血管平滑肌细胞存活的主要调节因子，在很大程度上通过抑制Foxo3a及其下游基因(包括凋亡蛋白酶激活因子1)来介导。研究表明，即使在血流变化过程中血管平滑肌细胞低表达的凋亡也决定了血管壁结构，并且在动脉粥样硬化形成过程中发挥促进纤维帽变薄功能[14]。PPARG基因与肥胖、动脉粥样硬化等疾病相关[15]，能阻断早期动脉粥样硬化，其机制可能是通过阻断肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)。PTGS2 (COX-2)在缺氧的心肌细胞和内皮细胞中显著上升，参与了动脉粥样硬化的形成，可能增加急性心血管事件的发生[16] [17]。MAPK属于丝氨酸苏氨酸激酶的一类，细胞外信号调节酶、JNK、p38/MAPK以及ERK5/BMKl通路作为MAPK的主要信号通路，研究发现无论是冠状动脉或者颈动脉粥样斑块附近都可以检测到MAPK相关激酶表达升高[18]。MAPK信号通路对细胞增殖、分化、转化、死亡等有调控作用，可通过激活通路调节动脉粥样硬化中的炎症反应[19]。
综上所述，本研究利用网络药理学来进行对佛手–香橼药对治疗心绞痛的作用机制探索，结果发现佛手–香橼药对可能从调节心肌细胞增殖和凋亡、调节血管新生、炎症反应、抗氧化应激等方面治疗心绞痛，具有多组分、多靶点、多途径的协同干预效应。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。