miRNA对骨肉瘤细胞相关靶向因子的调控

Regulation of miRNA on Osteosarcoma Cell-Related Targeting Factors

摘要: 骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是一种起源于成骨细胞间充质细胞的肉瘤，最常见于15~19岁的儿童和青少年。目前的治疗策略包括化疗联合积极手术切除，已经显著提高骨肉瘤患者的生存率。但复发率仍为30%~40%，因肺转移10年生存率为20%~30%。化疗是治疗骨肉瘤最有效的方法之一。然而，这些化疗药物由于获得耐药性和高剂量严重副作用而受到限制。近年来，微小RNA (MicroRNA, miRNA)分子作为恶性肿瘤的诊断和评估预后的重要组成部分，它们不但在真核基因表达调控中有着广泛的作用，而且还通过调控靶向因子对骨肉瘤细胞产生不同的影响，这也成为了探索骨肉瘤发生机制以及治疗策略的新思路。因此，本文就近年来几种常见miRNA的调控因子对骨肉瘤细胞所产生的影响进行总结，挖掘其在未来骨肿瘤疾病防治中的潜在价值。

Abstract: Osteosarcoma (OS) is a kind of sarcoma originating from osteoblast mesenchymal cells, which is most common in children and adolescents aged 15~19. Current treatment strategies, including chemotherapy combined with active surgical resection, have significantly improved the survival rate of osteosarcoma patients. But the recurrence rate is still 30%~40%, and the 10-year survival rate due to lung metastasis is 20%~30%. Chemotherapy is the most effective method to treat cancer and osteosarcoma. However, these chemotherapy drugs are limited by acquiring drug resistance and high dose of serious side effects. In recent years, MicroRNA (miRNA) molecules, as an important part of the diagnosis and prognosis evaluation of malignant tumors, not only play a wide role in the regulation of eukaryotic gene expression, but also have different effects on osteosarcoma cells by regulating targeting factors, which has become a new idea to explore the pathogenesis and treatment strategies of osteosarcoma. Therefore, this paper summarizes the effects of several common miRNA regulatory factors on osteosarcoma cells in recent years, and explores their potential value in the prevention and treatment of bone tumor diseases in the future.

1. 前言

骨肉瘤是指来源于成骨间叶细胞的原发恶性骨或软组织肿瘤[1]，其生物学行为为增殖的肿瘤细胞直接分化形成骨或骨样组织；具有较高的侵袭性和迁移性。容易在早期发现时经血液转移至肺。临床上，骨肉瘤通常是多种治疗方式相结合的综合治疗，包括手术、化疗和放射治疗，虽然能显著提高骨肉瘤患者的生存率，但是由于其恶性程度高、容易复发和早期转移的特性，以及其对化疗的耐药性，导致目前骨肉瘤的治疗仍不理想[2]-[6]；因此，在骨肉瘤化疗耐药性的基础上寻找具有更高敏感性和特异性的治疗靶点及其相关通路，然后对这些相关靶点因子进行预测，从而应用于骨肉瘤的早期诊断、临床治疗以及预后评估之中，对提高骨肉瘤患者生存率具有深远意义[7]。

MicroRNA (miRNA)是一类内生的、长度约为20~24个核苷酸的小RNA，其在不同的细胞内具有不同的调节机制。每个miRNA可能对应调控多个靶基因，而有的靶点基因则需要多个miRNA共同调节，以完成对应信号通路的传导。这种相互作用的复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个靶点基因的功能，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。查阅文献已发现有多项研究表明，miRNA可以通过控制不同的靶点基因来抑制骨肉瘤细胞的进展情况。如miR-382-5p通过负向调节VEZF1表达抑制骨肉瘤的发生和进展[8]。此外miR-182可通过靶向调控RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡并阻止其细胞周期进程[9]。另外，也有研究认为，miR-659-3p通过靶向SRPK1抑制细胞增殖和侵袭来抑制骨肉瘤的进展和转移[10]。

骨肉瘤的发病机制中涉及不同的信号通路、靶点因子及多种miRNA，在众多通路中最为人熟知的信号通路是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)、P53 (人体抑癌基因，其编码蛋白相对分子质量53000)、Notch (由Notch配体、受体和胞内效应分子组成)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路。相应的靶向调控因子有E盒结合锌指蛋白1 (ZEB1)、KLF8、CDK6、叉头框D1 (FOXD1)等，这些通路及因子都需要相关靶向miRNA来调控，进一步发挥抑制骨肉瘤细胞活性及耐药性的作用，例如：miR-629-5p、miR-659-3p、miR-182、miR-144-3p、miR-34c、miR-374a-5p、miR-335-3p、miR-101、miR-1236-3p等[11]。近年来，miRNA分子作为恶性肿瘤早期诊断和治疗的重要组成部分，不仅对研发抗肿瘤新药物有一定的指导作用，同时还参与调控骨肉瘤相关靶点基因及信号通路，为探索骨肉瘤发生、发展和预后的相关机制提供了新的研究思路。因此，本文就不同miRNA调控骨肉瘤细胞相关靶点因子的研究进展作一综述。

2. miRNA-1236-3p通过靶向KLF8抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导其凋亡

据报道，miRNA-1236-3p在许多类型的肿瘤中下调[12]-[14]，这与骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力密切相关。然而，miRNA-1236-3p在介导骨肉瘤细胞进展中的作用鲜有报道。Y Sun [15]等发现，miRNA-1236-3p过表达通过下调KLF8抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，诱导细胞凋亡。他们采用实时聚合酶链式反应(Real Time-Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)检测骨肉瘤组织和细胞系中miRNA-1236-3p的相对水平。通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测miRNA-1236-3p对人骨肉瘤细胞HOS和U-2OS增殖能力的调控作用。再通过流式细胞术检测miRNA-1236-3p对骨肉瘤细胞周期进程和凋亡的潜在影响。随后，进行双荧光素酶报告基因检测，探索KLF8 (krppel样因子8)与miRNA-1236-3p的结合。结果显示miRNA-1236-3p在HOS和U-2OS细胞中的过表达抑制了细胞的增殖能力，阻滞了细胞周期在G0/G1期，诱导细胞凋亡。相反，miRNA-1236-3p敲低获得相反的趋势。证实KLF8与miRNA-1236-3p结合，其表达在骨肉瘤细胞中受到miRNA-1236-3p的负调控。故通过调节miR-1236-3p及其靶基因来建立一种新型骨肉瘤疗法。

3. miR-335-3p与miR-30a-5p通过靶向FOXD1抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

miR-335-3p作为一种抑癌基因已经被众多学者知晓并报道，例如：Zhang L [16]等人的研究表明miR-335-3p/EIF3E轴可能是减缓AML进展的一个有希望的治疗靶点。然而，miR-335-3p在OS的发生和进展的相关分子机制的阐明仍然有限。韩交玲[17]等为了阐明miR-335-3p与FOXD1之间的相互作用，以及二者协同下对骨肉瘤细胞的影响，采用了蛋白质免疫印迹法检测骨肉瘤细胞中FOXD1蛋白表达，结果显示：过表达的FOXD1促进OS细胞肿瘤生物学行为；相反，转染了miR-335-3p的FOXD1对OS细胞的增殖、迁移和侵袭有明显的抑制作用，以此途径为切入点可为骨肉瘤患者提供一种新颖的临床治疗方案。miR-30a-5p可能通过靶向FOXD1抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。Jun Tao [18]等通过双重荧光素酶分析证实FOXD1受miR-30a-5p直接调控，又通过体外试验证实FOXD1过表达促进OS细胞增殖和迁移，转染抑制剂后结果相反，OS细胞的活性显著减低；再次体内试验进一步显示了敲除FOXD1后对肿瘤生长的抑制。这些结果表明，FOXD1可能在OS细胞的增殖和迁移中起关键作用，并且在OS细胞中受到miR-30a-5p的负调控，这为进一步治疗骨肉瘤提供了新的思路以及新的靶点。

4. miR-144-3p、miR-708-5p、miR-126等通过调节ZEB1抑制骨肉瘤的增殖和侵袭

Jiang M [19]等采用细胞系来源的肿瘤异种移植(CDTX)模型进行体内实验，可以对生理状况进行近似模拟，从而得出具有坚实临床价值的结论，然后从OS组织中提取外泌体进行测序，与血清外泌体相比，来自肿瘤局部组织的外泌体能更准确地反映肿瘤微环境的组成，便于进一步研究肿瘤细胞间的通讯及对周围其他细胞的影响，分别上调和下调miR-144-3p和ZEB1，充分验证了铁下垂的多种可能途径，并进行了功能挽救实验，验证了miR-144-3p/ZEB1轴在铁下垂机制中的作用；采用生物信息学分析方法鉴定骨肉瘤中与铁细胞凋亡结果OS细胞系和组织中miR-144-3p低表达，ZEB1高表达。过表达miR-144-3p可促进OS细胞的铁下垂，降低OS细胞的存活能力，阻止OS的进展。此外，过表达miR-144-3p可以下调细胞系和裸鼠中ZEB1的表达。miR-144-3p的敲低具有相反的作用。功能修复实验证实miR-144-3p可以调控下游ZEB1，通过干扰氧化还原稳态和铁代谢参与OS的发生发展。这些发现有助于进一步了解OS的发病机制，并证实了铁下垂相关miRNA作为抗癌治疗靶点或诊断生物标志物的潜力巨大。

丰天宇[20]等为了证实miR-708-5p与ZEB1的相互作用，以及二者协同下对骨肉瘤细胞的影响；通过Targetscan7.2预测出miR-708-5p和ZEB1的3’UTR区均有结合位点，双荧光素酶报告结果显示二者之间有直接结合。Western blot结果显示：miR-708-5p在骨肉瘤细胞中过表达后ZEB1的蛋白表达水平显著下降。通过恢复实验验证了ZEB1也可逆转miR-708-5p对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的抑制作用，并且敲低ZEB1的表达可以抑制骨肉瘤细胞的迁移与侵袭。Jiang R [21]等通过TargetScan预测、qRT-PCR和Western blot检测ZEB1的蛋白表达；结果显示：miR-126的过表达显著抑制细胞增殖、迁移、侵袭，预测并验证了ZEB1是miR-126的靶基因，这为治疗骨肉瘤提供了一个新的研究方向。

5. miR-196与miR-15通过靶向调控CDK6的表达抑制骨肉瘤细胞活力、迁移和侵袭

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)家族包含13种不同的丝氨酸/苏氨酸激酶，CDK6是较为经典的细胞周期激酶，它的异常激活会导致细胞周期紊乱，从而使细胞的增殖出现失控，进一步导致癌症的发展；张靖勇[22]等为了检测miR-196和CDK6在骨肉瘤细胞中的表达情况，采用了MTT实验和双荧光素酶报告实验检测二者的协同作用以及它们对骨肉瘤细胞的影响；结果显示：过表达的miR-196能够显著地抑制CDK6的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，相反则能够促进骨肉瘤细胞中的CDK6的表达。这一研究有望成为骨肉瘤早期诊断和治疗的分子靶点，构建相关生物制剂可能从基因层面出发改变骨肉瘤细胞的进展过程，对未来的早期诊治有一定的帮助。Shen Z [23]等通过qRT-PCR与transwell实验证实miRNA-15是通过抑制CDK6的表达进而抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭作用，相反，CDK6过表达减轻了miR-15过表达对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用，这表明CDK6是miR-15在骨肉瘤中功能作用的中介；因此，miR-15/CDK6可能在未来成为治疗骨肉瘤的关键手段。

6. miR-154-5p与miR-34c通过靶向调控E2F5的表达促进骨肉瘤细胞的凋亡以及 抑制细胞增殖

E2F家族是一组转录因子，包括E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5等多个成员，它们通过调控基因表达来控制细胞周期进程，在G1期、S期和G2期都有重要作用；E2F家族过度激活会导致细胞周期失控，从而诱发肿瘤。李彦华[24]等通过双荧光素酶实验与Western blot分析证明miR-154-5p上调可通过降低E2F5的水平，进而诱导OS细胞发生凋亡，从而抑制OS细胞增殖。Bae Y [25]等为了证明miRNA-34c与E2F5在骨肉瘤细胞中的作用以及二者之间的关系，采用了qRT-PCR分析基因表达，然后运用TargetScan分析发现E2F5转录因子受到的影响最为显著，再通过生物发光成像检测荧光素酶表达来监测肿瘤生长和肺转移情况；结果显示：miR-34c在体外具有抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭的作用，E2F5可能与骨肉瘤细胞进展相关，因为过表达的miR-34c能明显地抑制E2F5的活性进而抑制骨肉瘤细胞的表达，这项研究结果不仅强调了miR-34c对骨肉瘤细胞的靶向抑制作用，还证明了其在未来治疗领域的价值；新的miRNA与靶点基因的发现是至关重要的，无论是早期诊断还是针对化疗耐药性的治疗都有极大帮助与指导意义。总结见表1。

Table 1. Regulatory functions of miRNA and different target genes

表1. miRNA与不同靶基因的调节功能

MiRNA	靶基因	功能	参考文献
miRNA-1236-3p	KLF8	抑制增殖、诱导凋亡	[15]
miR-335-3p	FOXD1	抑制增殖和侵袭	[16]
miR-30a-5p	FOXD1	抑制增殖和侵袭	[17]
miR-144-3p	ZEB1	抑制增殖、迁移和侵袭	[18]
miR-708-5p	ZEB1	抑制迁移和侵袭	[19]
miR-126	ZEB1	抑制增殖、迁移和侵袭	[20]
miR-196	CDK6	抑制活力、迁移和侵袭	[21]
miR-15	CDK6	抑制增殖和侵袭	[22]
miR-154-5p	E2F5	抑制增殖和诱导凋亡	[23]
miR-34c	E2F5	抑制增殖和侵袭	[24]

7. 结语与展望

MiRNA对骨肉瘤细胞的调控主要是靶向调控相关因子的过程，通过上调或下调相关因子的表达，进而影响其通路的传导而发挥抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭的作用；目前针对骨肉瘤的治疗方式已经有了很大的进展，相关miRNA和靶点因子也逐渐被发现并证实其作用；但是仍然还有很多未知miRNA通过靶向调控相关因子及通路进而调控骨肉瘤的发生及发展机制尚未被发掘，例如KLF8因子能够介导细胞周期进程和癌症转化，但关于该因子的其他相关机制还少之又少；因此我们还需要大量的查阅文献以及大量临床样本和实验数据支持，不断探索新的靶点机制，在符合临床要求的基础上，尽可能多地发现骨肉瘤细胞相关miRNA及其靶点和通路，并证实其作用。众多研究表明骨肉瘤相关靶向因子在整个骨肉瘤患者中呈现过表达的状态，反之则是表达受到抑制的状态。因此探讨miRNA对骨肉瘤细胞相关靶向因子的调控机制及相互作用，结果使相关具有抑癌功能的miRNA在骨肉瘤细胞中过表达，达到抑制相关靶点因子的作用；相反，敲低那些促进癌症进展的miRNA及其相关靶向因子，从而降低其活性和耐药性，提高骨肉瘤患者对化疗药物的敏感性，改善预后，为骨肉瘤的早期治疗原则提供新的思路。

NOTES

^*通讯作者。