烟草根腐病生防菌的筛选鉴定及抑菌活性分析

Screening, Identification, and Antibacterial Activity Analysis of Antagonistic Bacteria against Tobacco Root Rot Disease

摘要: 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的根腐病是烟草大田种植中的常见病害，具有发病率高、传染性强和不易防治等特点，给烟农带来了严重的经济损失。为了绿色防控镰刀菌根腐病，本研究采用平板对峙法筛选出了1株能高效抑制尖孢镰刀菌的拮抗菌NYM2002，形态观察和16S rRNA测序鉴定其为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。该菌株能产生几丁质酶和纤维素酶，具有分解几丁质和纤维素的能力；同时该菌株发酵液能提高烟叶PPO、POD和PAL防御酶的活性。盆栽试验也发现该菌株对镰刀菌根腐病的防控优于商品化的农药甲霜·锰锌可湿性粉剂，相对防效高达81.03%，表明短小芽胞杆菌NYM2002具有开发为绿色防治烟草根腐病的生物农药的潜力。

Abstract: Root rot caused by Fusarium oxysporum is a common disease in tobacco field planting. It has the characteristics of high incidence rate, strong infectivity and difficult control, which has brought serious economic losses to tobacco farmers. In order to prevent and control Fusarium wilt disease in a green way, this study used the plate confrontation method to screen out a strain of antagonistic bacterium NYM2002 that can efficiently inhibit Fusarium oxysporum. Morphological observation and 16S rRNA sequencing identified it as Bacillus subtilis. This strain can produce chitinase and cellulase, and has the ability to decompose chitin and cellulose; At the same time, the fermentation broth of this strain can enhance the activity of PPO, POD, and PAL defense enzymes in tobacco leaves. The pot experiment also found that the strain of Bacillus subtilis NYM2002 has better control over Fusarium root rot than the commercial pesticide Methomyl·Manganese Zinc Wettable Powder, with a relative control efficiency of 81.03%, indicating that it has the potential to be developed as a green biopesticide for controlling tobacco root rot.

1. 引言

烟草根腐病是由镰刀菌属真菌引起的土传性病害，防治难度大，严重影响烟草产业发展[1]。镰刀菌根腐病的病原菌有尖孢镰刀菌(F. oxysporium) [2]-[4]、茄病镰刀菌(F. solani) [5]，共享镰刀菌(F. commune) [6]等。该病可引起植物根部发生病变，造成顶部弯向一侧，叶片小，烟草根部腐烂，剖开病茎、病根，观察到木质部褐变，破坏了烟草的维管系统，导致地上部分的水分吸收及地下部的营养吸收困难，最后致使烟草植株死亡[7] [8]，从幼苗到成株期均可发病，降低烟叶产量，影响烟叶品质。

目前，农业防治、化学防治与生物防治等方法普遍应用于烟草根腐病的防治。其中，生物防治是指利用有益微生物或天然代谢产物对植物病害进行防治，不仅可以提高土壤质量、改善土壤微环境，而且无毒害残留，为烟草种植提供绿色可持续发展的生态环境，在烟草根腐病的防治中具有重要应用价值[9] [10]。烟草根腐病的生物防治可以通过引入拮抗真菌、生防细菌等途径[11]，目前已报道的用于防治烟草根腐病的微生物如棘孢木霉(T. asperellum)抑制烟草镰刀菌达93.13%，并促进烟草种子萌发和根长增长[12]。付宏喆等[13]筛选出深绿木霉(T. atroviride)，对烟草镰刀菌抑菌率为55.25%。特基拉芽孢杆菌(B. tequilensis)，对烟草拟枝镰刀菌的抑制效果达82.66%，对腐皮镰刀菌的抑菌率达76.9%，其发酵液对拟枝和腐皮镰刀菌的抑菌率分别为84.76%和60.85% [14]。贝莱斯芽孢杆菌(B. velenzensis)，其10%和20%发酵滤液对病菌生长抑制率分别为53.09%和62.24%，发酵液处理15 d、30 d、45 d，对烟草根腐病的防效分别为70.00%、74.62%和79.51% [15]。微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)浓度为7.0 × 10⁶ cfu∙mL⁻¹时对烟草尖孢镰刀菌的抑制作用最大，抑制率为28.27%；蜡质芽孢杆菌(B. cereus)浓度为3.4 × 10⁷ cfu∙mL⁻¹的抑制作用最大，抑制率为21.74% [16]等。

尖孢镰刀菌(F. oxysporum)是引起烟草镰刀菌根腐病的最主要病原菌之一[17]，从生理水平上，尖孢镰刀菌通过阻塞植物导管和分泌毒素使宿主发病，它产生的果胶酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶能共同分解植物细胞壁，导致果胶阻塞导管，影响植物吸收水分，最终宿主植物因缺水而萎蔫死亡。由镰刀菌属真菌分泌的非特异性毒素5-丁基-2-吡啶甲酸，亦称镰刀菌酸，能够损伤植物的根系细胞膜，增加细胞透性，减少线粒体中活性氧的含量并阻碍ATP合成，导致根系吸水受阻并抑制生长[18]。此外，镰刀菌产生的脱氢镰刀菌酸、伏马菌素、白僵菌素、卡毒素、麦角固醇素等致病毒素也能损伤植物根系，同时影响宿主的种子萌发和形态结构[19]。故本研究期望筛选出对尖孢镰刀菌具有较好抑菌效果的拮抗菌，并鉴定其种属，评价其促生防病效果，为烟草根腐病的绿色防控提供理论依据，为微生物农药的开发提供微生物资源。

2. 材料与方法

2.1. 材料与培养基

供试植物为云烟87。

供试菌株：20株待筛选内生细菌和尖孢镰刀菌为本实验室保存。

TSA培养基(胰蛋白胨15.0 g/L、大豆胨5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂15.0 g/L、PH值7.3 ± 0.2)。

LB培养基(蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、酵母5 g/L)。

NA培养基(蛋白胨100 g/L，牛肉膏粉30 g/L，氯化钠50 g/L)。

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15~20 g和蒸馏水1 L。

2.2. 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙法筛选拮抗菌。在PDA平板中央接种直径6 mm的尖孢镰刀菌病原菌菌饼，在两侧距菌饼2.0 cm处画线接种分离的内生细菌，对称接两行，同时以不接内生菌为对照，置于28℃恒温箱中培养6 d，测量病原菌直径。

$抑菌率\left(\%\right)=\frac{对照组病原菌直径-处理组病原菌直径}{对照组病原菌直径-菌饼直径}\times 100\%$ (1)

2.3. 拮抗菌株的鉴定

2.3.1. 形态观察

将拮抗细菌在LB固体培养基上进行划线，观察单菌落特征，并对其进行革兰氏染色[20]。

2.3.2. 菌株的16SrRNA序列分析及系统发育树构建

菌株基因组DNA的提取：挑取细菌单菌于LB培养基中，220 r/min、37℃条件下培养12 h，取100 μL得到的菌株发酵液12,000 r/min离心5 min，去掉上清，只留菌体。将50 μL质量分数为5%的Chelex-100加入菌体中，微波30 s，12,000 r/min离心10 min，上清即为DNA，将得到的DNA放置在−20℃条件下保存。

16S rRNA的PCR扩增：以提取的细菌总DNA为模板，选取16S rRNA引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')采用菌落聚合酶链式反应的方法对拮抗菌株的16SrRNA基因序列进行扩增，由生工生物工程(上海)股份有限公司将得到的PCR扩增产物进行测序，将测序结果在线上提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库，进行同源性搜索比对，应用Blast搜索工具进行基本局部比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，最后采用MEGA11软件中的邻接法绘制菌株的系统发育树[21]。

2.4. 拮抗菌株纤维素酶和几丁质酶活性的测定

收集拮抗菌株发酵液的上清液(全菌液经12,000 r/min离心5 min，取上清液过滤)。再使用纤维素酶活性检测试剂盒(YX-SH-TQ22025，上海原鑫生物科技有限公司)测定纤维素酶含量，几丁质酶活性检测试剂盒(YX-W-B917，上海原鑫生物科技有限公司)检测几丁质酶含量[22]。

2.5. 拮抗菌株发酵液对烟叶防御酶活性诱导试验

采用盆栽试验，在烟苗移栽后7 d接种拮抗菌株发酵液(1.0 × 10⁸ cfu/mL)、发酵液10 mL，以清水处理为对照(CK)，各处理设置10次重复。接种后第7 d取第3片叶，采用邻苯二酚法测定多酚氧化酶(PPO)活性[23]，愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性[24]，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参考文献[25]的方法。

2.6. 盆栽试验

拮抗菌液的制备：将拮抗菌株接种于NA液体培养基，37℃、200 r/min振荡培养2 d，制成浓度为1.0 × 10⁸ cfu/mL的细胞悬液，即为拮抗菌液。病原菌孢子悬液的制备：将尖孢镰刀菌接种于PDA培养基，28℃、200 r/min振荡培养4 d，制成孢子浓度为1.0 × 10⁸ cfu/mL的孢子悬液，即为病原菌孢子悬液，采用灌根法浇灌烟株，烟苗移栽后7 d接种病原菌孢子悬液，浇灌量200 mL/盆。接种7 d后进行甲霜·锰锌可湿性粉剂(有效成分含量为58%，其中甲霜灵10%，代森锰锌48%，苏州宝灵化工股份有限公司) 600倍溶液浇灌处理(T1)。T2处理为拮抗菌液灌根，拮抗菌液浇灌量为200 mL/盆。对照CK采用清水处理。每个处理重复3组，每组6株烟株，灌根后14 d开始对烟苗发病情况进行调查，并计算发病率、病情指数和相对防效[26]。

$发病率=\left(染病株数/调查总株数\right)\times 100\%$ (2)

$病情指数=\sum \left(各级病株数 \times 该病级值\right)/\left(调查总株数\times 最高级值\right)\times 100\%$ (3)

$相对防效=\left(对照病情指数–处理病情指数\right)/对照病情指数\times 100\%$ (4)

3. 结果与分析

3.1. 内生细菌中拮抗菌株的筛选

将20株内生细菌与尖孢镰刀菌进行平板对峙试验，结果如表1。其中对尖孢镰刀菌具有高效拮抗作用(抑菌率 > 50%)的内生细菌8株，从中选择抑菌率为88.0%的NYM2002菌株进一步测定并验证其抑菌效果，平板抑菌如图1。

Figure 1. Antagonistic effect of antagonistic strain NYM2002 on F. oxysporum

图1. 拮抗菌株NYM2002对尖孢镰刀菌的拮抗效果

Table 1. The antagonistic effect of endophytic bacteria on F. oxysporum

表1. 内生细菌对尖孢镰刀菌抑菌效果

菌株编号	对照组病原菌直径(cm)	处理组病原菌直径(cm)	抑菌率(%)
ORM8001	5.6	0.7	98.0
NRM3001		0.8	96.0
ZYM4002		1	92.0
NYM5001		1.1	90.0
NYM2002		1.2	88.0
FRM9001		1.3	86.0
ORM7001		1.7	78.0
NYM6005		1.9	74.0
NYM11002		3.5	42.0
ZRM8001		3.5	42.0
NYM8005		3.8	36.0
NJM6001		4.4	24.0
ZYM5001		4.5	22.0
FRM7001		4.8	16.0
NJM10001		5.0	12.0
NYM4001		5.0	12.0
FRM5001		5.4	4.0
ZJM4002		5.4	4.0
NYM9001		5.6	0
ZYM8001		5.6	0

3.2. 拮抗菌株NYM2002的鉴定

3.2.1. 形态观察

如图2所示，菌株NYM2002在TSA培养基上菌落呈现出不规则的形状，菌落不透明，整体呈现不透明乳白色，菌落表面光滑有光泽，在显微镜下呈杆状，革兰氏染色阳性。

Figure 2. Colony (A) and cell morphologies (B) of antagonistic strain NYM2002

图2. 拮抗菌株NYM2002菌落形态(A)与细胞形态(B)

3.2.2. 16S rRNA序列分析及系统发育树构建

在NCBI中对菌株NYM2002的16S rRNA基因序列进行Blast分析，并下载相似性较高的序列，利用MEGA7.0构建系统发育进化树。如图3所示，对比序列间的同源性，其与Bacillus pumilus聚成一枝，同源性达到100%。结合形态鉴定确定菌株NYM2002为短小芽孢杆菌。

Figure 3. Phylogenetic tree of antagonistic strain NYM2002

图3. 拮抗菌株NYM2002的系统进化树

3.3. 拮抗菌株NYM2002纤维素酶和几丁质酶活性的测定

纤维素和几丁质是许多植物病原真菌细胞壁的组成部分。在生产上，许多生防微生物可以分泌几丁质酶和纤维素酶，同时破坏了植物病原真菌细胞壁的结构，影响其稳定性因而表现出有较强的抑菌作用[27]。在菌株NYM2002的发酵上清液中检测到了几丁质酶和纤维素酶的酶活分别为80.64 U∙mL⁻¹和311.43 U∙mL⁻¹，见图4，表明该菌株能产生几丁质酶和纤维素酶，具有分解尖孢镰刀菌细胞壁中几丁质和纤维素的能力。

Figure 4. Contents of chitinase and cellulose in strain NYM2002

图4. 菌株NYM2002的几丁质酶和纤维素酶含量

3.4. 拮抗菌株NYM2002发酵液对烟叶防御酶活性诱导试验

PPO、POD和PAL是3种极为重要的防御酶，与植物的抗(耐)病性密切相关[28]。如图5所示，烟叶内三种防御酶活性变化规律整体上一致。与CK相比，发酵液处理时三种防御酶活性在接种后第7天均呈升高趋势，可以得出发酵液(1.0 × 10⁸ cfu/mL)可提高三种防御酶活性。

Figure 5. The effect of fermentation broth of strain NYM2002 on PPO, POD, and PAL enzyme activities in tobacco leaves

图5. 菌株NYM2002发酵液对烟叶PPO、POD和PAL酶活性的影响

3.5. 盆栽试验

如图6所示，烟株经CK、化学药剂甲霜·锰锌(T1)和拮抗菌株NYM2002处理后，发病率(DR)分别为88.22%、60.07%、15.15%；病情指数(DI)分别为50.19%、32.07%、9.52%，T1与菌株处理组均低于CK。T1处理时防效为36.10%；菌株NYM2002处理时防效为81.03%。可见，生防菌株NYM2002在盆栽试验呈现出中较高的防治效果。

Figure 6. Potting experiment on the control effect of strain NYM2002 bacterial solution

图6. 菌株NYM2002菌液的盆栽试验防效

4. 讨论

以尖孢镰刀菌(F. oxysporum)为主要病原菌的烟草镰刀菌根腐病在我国大多数烟区发生且危害严重，给烟叶生产带来巨大的损失[29] [30]。拮抗微生物一直被认为是一种环境友好、经济性好和可持续的生物制剂[31]。植物内生菌是一类重要的微生物资源，在植物体内具有稳定的生存空间，不易受外界环境的影响。许多研究证明，健康植物体内存在的大量内生细菌是植物病害生物防治的潜在资源菌。

芽胞杆菌属(Bacillus sp.)是一类重要的植物病原菌拮抗菌、易于定向分离，又是自然界广泛存在的非致病菌、多分布于土壤、植物体表面及水体中，繁殖快速，无湿状态可耐低温−60℃、耐高温+280℃，耐强酸，耐强碱，抗菌消毒；好氧或兼型厌氧；细胞呈杆状，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖；产抗逆性孢子，在制剂加工和储存过程中不易失活；可产生对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用[32]。芽孢杆菌具有分泌多种结构和生物活性的次生代谢产物的能力，其全基因组中有5%~10%的基因用于合成具有抗菌作用的次生代谢产物[33]。生防菌常抑制尖孢镰刀菌的孢子萌发、菌丝生长及对菌丝有致畸效果，而芽孢杆菌发酵液可致尖孢镰刀菌丝扭曲、断裂、破碎[34]。目前已报道的用于烟草根腐病防治的芽孢杆菌如：枯草芽孢杆菌(B. subtilis)在控病测试中防效达77.1% [35]；淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)无菌滤液对烟草根黑腐病菌的抑制率为81.5% [36]、暹罗芽孢杆菌(B. siamensis)对尖孢镰刀菌抑菌率分别为34.79 %和35.40% [37]；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) [38]等。

本研究筛选出菌株NYM2002对尖孢镰刀菌(F. oxysporum)具有较好的抑制效果，抑菌率为88.0%，对烟草根腐病防效为81.03%，与已知芽孢杆菌相比，本菌株对烟草根腐病具有相对高防效率。根据菌株形态特征、生理生化特性、16S rRNA分子鉴定并构建系统发育树，确定菌株NYM2002为短小芽孢杆菌(B. pumilus)。但是，目前在实际烟草根腐病防控方面，短小芽孢杆菌的应用研究尚少，且由于菌株NYM2002是从叶内分离的，它在烟草根部的定殖能力、林间防治效果以及在烟草体内传导等还需进一步研究。

5. 结论

本研究中短小芽孢杆菌(B. pumilus)菌株NYM2002对尖孢镰刀菌(F. oxysporum)平板对峙试验抑菌率为88.0%；盆栽试验中对烟草根腐病防效为81.03%；且菌株NYM2002能产生几丁质酶和纤维素酶，具有分解几丁质和纤维素的能力；该菌株发酵液可提高PPO、POD和PAL三种防御酶活性。可见，短小芽孢杆菌(B. pumilus)菌株NYM2002具有防治烟草根腐病的潜力。短小芽孢杆菌是芽孢杆菌属的重要成员，其生长快、抗逆性强、对人和动物安全无毒，主要通过生产脂肽、水解酶、微生物挥发性有机化合物以及ISR等抑制植物病原真菌[39]，是理想的生防菌源。

基金项目

中国烟草总公司重点科技项目“基于微生物组的烟草根际生物屏障抗病机理及应用研究”(110202101047(LS-07))；“烟草生防菌精准鉴定、重要性状解析及资源库建设”(110202201019(LS-03))；湖北省烟草公司重点科技项目“雪茄烟主要病虫害灾变规律调查及防控技术研究与应用”(027Y2022-023)。

NOTES

^*通讯作者。