基于生物信息学技术研究破格救心汤治疗急性心肌梗死合并心源性休克的作用机制

Research on the Mechanism of Poge Jiuxin Decoction in Treating Acute Myocardial Infarction with Cardiogenic Shock Based on Bioinformatics Technology

摘要: 目的：运用生物信息学技术探讨破格救心汤(Poge Jiuxin Decoction, PJD)治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)合并心源性休克(cardiogenic shock, CS)的作用机制，为临床研究提供理论依据。方法：借助TCMSP、BATMAN-TCM 2.0和HIT 2.0中药药理学数据库筛选破格救心汤中各个单味药的有效成分和潜在靶点；检索Genecards疾病数据库，分别筛选AMI和CS的疾病靶点；获得破格救心汤治疗AMI合并CS的交集靶点基因。构建PJD有效成分–靶点基因网络并筛选出重要的有效成分；利用String数据库分析靶点间相互作用的PPI网络；对靶点基因进行基因本体(GO)生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。利用Cytoscape3.8.2软件和R语言软件包对分析结果进行可视化。最后在CB-Dock2平台上对关键成分与核心靶点蛋白进行分子对接验证。结果：预测破格救心汤靶点880个，筛选AMI靶点1274个，CS靶点164个，将三者取交集，获得破格救心汤治疗AMI合并CS靶点共34个。破格救心汤在治疗AMI合并CS中重要的有效成分包括槲皮素、芸香苷等。GO生物学功能主要富集于循环系统中的血管过程、含胶原蛋白的细胞外基质、信号受体激动剂活性等；KEGG通路主要富集于包含细胞因子–细胞因子受体相互作用、恰加斯病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等疾病相关信号通路。分子对接结果显示槲皮素、芸香苷与核心靶点TNF之间存在较强的结合活性。结论：该研究通过生物信息学方法研究破格救心汤治疗AMI合并CS的作用机制，初步阐明破格救心汤可通过多成分、多靶点和多通路参与治疗AMI合并CS患者，为后续深入研究提供理论基础，但仍需具体实验验证。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of Poge Jiuxin Decoction (PJD) in treating acute myocardial infarction (AMI) complicated with cardiogenic shock (CS) using bioinformatics technology, and to provide a theoretical basis for clinical research. Methods: The effective components and potential targets of each single herb in PJD were screened using TCMSP, BATMAN-TCM 2.0, and HIT 2.0 traditional Chinese medicine pharmacology databases; the disease targets of AMI and CS were screened separately using the Genecards disease database; the intersection target genes of PJD in treating AMI combined with CS were obtained. A PJD effective component-target gene network was constructed and important effective components were screened; the PPI network of interactions between target genes was analyzed using the String database; the target genes were subjected to Gene Ontology (GO) biological process analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis. The analysis results were visualized using Cytoscape3.8.2 software and R language packages. Finally, molecular docking validation of key components with core target proteins was performed on the CB-Dock2 platform. Results: A total of 880 targets of PJD were predicted, 1274 targets of AMI were screened, and 164 targets of CS were screened. Taking the intersection of the three, a total of 34 targets of PJD in treating AMI combined with CS were obtained. Important effective components of PJD in treating AMI combined with CS include quercetin, rutin, etc. GO biological functions are mainly enriched in vascular processes in the circulatory system, extracellular matrix containing collagen, and signal receptor agonist activity; KEGG pathways are mainly enriched in disease-related pathways including cytokine-cytokine receptor interaction, Chagas disease, and AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications. Molecular docking results show that quercetin, rutin, and the core target TNF have strong binding activity. Conclusion: This study investigated the mechanism of PJD in treating AMI combined with CS through bioinformatics methods, preliminarily clarifying that PJD can participate in the treatment of AMI combined with CS patients through multiple components, multiple targets, and multiple pathways, providing a theoretical basis for subsequent in-depth research, but still requiring specific experimental verification.

1. 引言

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)是一种因冠状动脉阻塞而导致心肌缺血和损伤的疾病。动脉粥样硬化斑块破裂继发血栓形成是本病的病理基础[1]。心源性休克(Cardiogenic Shock, CS)是一种心脏泵血功能不足引起的严重临床状态，尤其是在大面积心肌梗死或伴有明显左心室功能衰竭的患者中更为常见[2]。AMI和CS之间存在密切的联系[3]。AMI是CS最常见病因之一，其发病机制主要通过心肌损伤导致心脏射血分数降低与全身组织灌注不良，进而危及生命[4]。目前，中国心血管疾病(cardiovascular diseases, CVD)患病率正处于持续上升阶段，2021年农村、城市CVD分别占死因的48. 98%和47.35%，每5例死亡中就有2例死于CVD [5]。破格救心汤(Poge Jiuxin Decoction, PJD)是由著名中医师李可创制的经典方剂，广泛应用于心血管系统相关重症疾病的临床治疗[6]。多项临床研究表明，在急性心肌梗死(AMI)伴随心源性休克(CS)的治疗中，PJD作为辅助药物使用时，通常能显著改善疗效[7]-[10]。虽然本方在临床工作中取得了较好的效果，但因PJD在治疗AMI合并CS中的药理作用机制并不明确，这在一定程度上限制了该方剂的进一步推广与应用。

2. 资料与方法

2.1. 采集并筛选PJD组方药物作用靶点

将PJD组方药物(附子、干姜、炙甘草、高丽参、山萸肉、龙骨、牡蛎、磁石、麝香)分别导入TCMSP数据库(https://www.tcmsp-e.com/#/database) [11]、HIT 2.0数据库[12] [13] (http://www.badd-cao.net:2345/)和BATMAN-TCM 2.0数据库[14] (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)中搜索并筛选PJD潜在靶点，去除重复靶点后建立PJD作用靶点数据集。

2.2. 获取与AMI和CS相关的疾病靶点基因

通过GeneCards数据库[15] (https://www.genecards.org/)以“acute myocardial infarction”、“cardiogenic shock”为关键词检索AMI和CS相关的疾病靶点基因，去除重复靶点后建立疾病靶点基因数据集。

2.3. 预测PJD对AMI和CS作用靶点

利用R语言软件中ggplot2、VennDiagram等工具包将1.1和1.2中得到的数据集进行韦恩分析，得到PJD、AMI、CS三者的交集基因并绘制韦恩图。这些交集基因可能是PJD在治疗AMI合并CS中发挥关键作用的基因。

2.4. PPI网络分析及核心基因筛选

在1.3中得到交集基因后，仍需对各交集基因的重要性进行排序，进而得出PJD治疗AMI合并CS的核心基因。限定检索条件为“Homo sapiens”、隐藏无连接的节点，其他参数保持默认值，将交集基因导入SRTING数据库[16] (http://www.string-db.org/)得到蛋白相互作用(PPI)网络图，再利用Cytoscape3.10.2软件对网络图进行分析并筛选核心基因。

2.5. 构建并分析药物–有效成分–靶点网络图

取1.3中三者交集基因作为图中靶点，检索方中各个药物中与靶点相对应的药物活性成分并进行编码。利用Cytoscape3.10.2软件制作网络图并进行拓扑分析，找出与1.5中得出的核心基因联系紧密的中药有效成分作进一步探讨。

2.6. 生物学过程富集分析和信号通路分析

基因本体(Gene Ontology, GO)生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析是生物信息学研究的重要组成部分，通常借助R语言软件clusterProfiler、org.Hs.eg.db等工具包实现[17]。GO数据库把基因的功能分为三类：生物过程(Biological Process, BP)、细胞组分(Cellular Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)。利用GO数据库，可以得到目标基因在BP、MF和CC三个层面的联系[18]。KEGG数据库是一种收集了很多信号通路的数据库[19]。分析结果的可视化工作由ggplot2包实现。限定物种为“Homo sapiens”，以p value < 0.05对分析数据进行筛选。进而分析PJD通过调节人体基因的何种功能或信号通路治疗AMI合并CS。

2.7. 分子对接

取1.4中核心靶点蛋白和1.5中关键活性成分。在RCSB Protein Data Bank数据库(https://www.rcsb.org/)下载靶点蛋白的PDB文件；在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载关键活性成分的SDF文件。CB-Dock2平台是一个先进的蛋白质–配体盲对接工具，在生物信息学研究中具有不可忽视的重要性与实用性[20]。为了深入探究有效成分与靶点蛋白之间的相互作用关系，本研究将获得的蛋白结构文件和活性成分文件导入CB-Dock2平台(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)进行分子对接并进行可视化。

3. 结果

3.1. PJD治疗AMI合并CS的靶点

在TCMSP数据库中，设定检索条件为口服生物利用度(OB) ≥ 30%和类药性(DL) ≥ 0.18；在HIT 2.0和BATMAN-TCM 2.0数据库中，保持默认检索条件。经整理后共检索到PJD的880个潜在靶点。在GeneCards数据库中，共检索到AMI疾病靶点1274个、CS疾病靶点164个。将三者靶点交叉生成韦恩图，见图1，可得到34个作用靶点，这可能是PJD在治疗AMI合并CS过程中的关键靶点。

3.2. PPI网络及核心基因

将2.1中获取的34个交集靶点导入SRTING数据库，在导出结果中去除在“Homo sapiens”范围内未找到的靶点和游离的靶点，得到交集靶点中各个蛋白相互作用的网络图，见图2。PPI网络中共包含32个节点，278条边，Degree (度)值平均数为17.375。在Cytoscape3.10.2软件中进一步分析，可得到PJD治疗AMI合并CS的核心靶点，以度值大小进行排序并绘制网络图，见图3。取度值、紧密中心值、介数中心值三者中位数前五名作为PPI网络中的核心靶点，分别为TNF、IL6、INS、MMP9、IL10。

3.3. 药物–有效成分–靶点网络图

在Cytoscape3.10.2软件中绘制药物–有效成分–靶点网络图，包含176个节点和404条边，见图4。节点间的连接提示各节点的相关性。PJD中有效成分共139个。有效成分连接靶点的数量与治疗作用呈正相关。度值较高的有效成分包括Quercetin (槲皮素)、Rutin (芸香苷)、Estradiol (雌二醇)等；度值较高的靶点包括CAT、TNF、MMP9等。寻找与2.2中核心靶点联系密切的活性成分，发现有效成分中槲皮素和芸香苷与核心靶点作用频率并列最高。因此，笔者将槲皮素与芸香苷视为本方治疗AMI合并CS的关键成分。结合有效成分–靶点度值和核心靶点PPI网络度值，本研究将“槲皮素-TNF”和“芸香苷-TNF”作为分子对接研究方向。

Figure 1. Common targets of treating acute myocardial infarction combined with cardiogenic shock with the use of the Poge Jiuxin Decoction

图1. 破格救心汤治疗急性心肌梗死合并心源性休克的共同靶点

Figure 2. Intersection target PPI network diagram

图2. 交集靶点PPI网络图

Figure 3. PPI network diagram of core targets (sorted by Degree value)

图3. 核心靶点PPI网络图(按Degree值排序)

Figure 4. Drug-active ingredient-target network diagram

图4. 药物–有效成分–靶点网络图

(A) (B)

(C) (D)

(A)：生物过程分析；(B)：细胞组分分析；(C)：分子功能分析；(D)：信号通路分析

Figure 5. Enrichment analysis of PJD-AMI-CS common targets

图5. PJD-AMI-CS共同靶点富集分析

3.4. GO生物学过程富集分析KEGG通路分析

借助R语言内置工具包对2.1中获取的34个交集基因靶点作GO和KEGG富集分析并进行数据可视化。结果显示三者共同靶点在BP中主要富集于循环系统中的血管过程(vascular process in circulatory system)、解剖结构的尺寸调控(regulation of anatomical structure size)、管径调节(regulation of tube size)等，见图5(A)；共同靶点在CC中主要富集于含胶原蛋白的细胞外基质(collagen-containing extracellular matrix)、质膜外侧(external side of plasma membrane)、内吞囊泡(endocytic vesicle)等，见图5(B)；共同靶点在MF中主要富集于信号受体激动剂活性(signaling receptor activator activity)、受体–配体活性(receptor ligand activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)等，见图5(C)；PJD在治疗AMI合并CS过程中主要参与的信号通路包含细胞因子–细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、恰加斯病(Chagas disease)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、疟疾(Malaria)、脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)等疾病相关信号通路，见图5(D)。

3.5. 分子对接结果

在CB-Dock2平台上导出结果后发现有效成分槲皮素和芸香苷与核心靶点TNF的最佳结合位点结合能均≤−9.5 kcal/mol，见图6。当结合能 < −5.0 kcal/mol时，通常意味着该活性成分与核心靶点蛋白具有较好的结合性；当结合能 < −7.0 kcal/mol时，表明该活性成分与核心靶点蛋白具有很强的结合性[21]。

(A) (B)

(A)：槲皮素与TNF；(B)：芸香苷与TNF

Figure 6. Molecular docking diagram of quercetin, rutin and core target TNF

图6. 槲皮素、芸香苷与核心靶点TNF的分子对接图

4. 讨论

本研究基于生物信息学方法，深入探讨了破格救心汤在治疗急性心肌梗死合并心源性休克中的作用机制。通过综合分析，我们发现破格救心汤的治疗作用涉及多个复杂生物过程，其中34个交集作用靶点扮演了关键角色。这些靶点不仅涵盖了炎症相关因子，如TNF、IL6，还涉及代谢调控和细胞外基质动态平衡的重要分子，如INS、MMP9和IL10。这些研究结果为我们理解破格救心汤的药理作用提供了新的视角。

首先，炎症在急性心肌梗死和心源性休克的发展过程中起着至关重要的作用。TNF和IL6作为经典的炎症因子，在心血管疾病中的表达往往与病情严重程度密切相关[22]。有研究发现，破格救心汤能够通过调节这些炎症因子的表达，从而减轻心肌炎症反应和心肌纤维化程度，保护心肌细胞免受进一步损伤[23]。这一发现与传统的中药抗炎理念相吻合，也验证了破格救心汤在抗炎方面的独特疗效。代谢异常也是心血管疾病的重要病理特征之一[24]。INS作为调节糖代谢的关键激素，在急性心肌梗死合并心源性休克患者中常出现异常。本研究结果显示，破格救心汤能够影响INS的信号通路，可能通过改善心肌细胞的能量代谢，为缺血缺氧的心肌提供更多的能量支持。这一机制可能是破格救心汤发挥治疗作用的重要环节。细胞外基质的动态平衡对于维持心脏结构和功能的完整性至关重要[25] [26]。MMP9作为细胞外基质降解的关键酶，在心肌梗死后的心室重构过程中发挥着重要作用[27]。本研究发现，破格救心汤能够调节MMP9的表达，可能通过抑制过度的心室重构，保护心脏免受进一步的功能损害。同时，IL10作为抗炎因子，也可能在调节细胞外基质动态平衡中发挥积极作用[28]。

在药物成分方面，本研究共检索出破格救心汤有效成分139个，其中槲皮素、芸香苷、雌二醇为本方主要成分。这些成分具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗凋亡等。槲皮素可有效清除自由基，减轻氧化应激损伤，保护心血管系统免受氧化损害；槲皮素还能抑制多种炎症介质(包括细胞因子、趋化因子)的释放及其信号传导通路(如NF-κB、MAPK)降低心血管炎症反应，从而减轻心肌损伤；槲皮素亦能通过调节凋亡相关基因(如Bcl-2、Bax)的表达，有效抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞存活与修复。芸香苷则主要通过增强血管内皮细胞抗氧化能力，保护血管壁免受自由基攻击，进而改善血管通透性，降低心血管疾病风险；同时还能增强毛细血管韧性和通透性改善心肌微循环，确保心肌供血充足。雌二醇可通过调节血脂代谢、抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移、促进血管舒张等方式保护心血管系统；雌二醇也能通过调节抗氧化酶系统(例如超氧化物歧化酶)和抑制炎症反应间接增强心血管系统的抗氧化能力；雌二醇亦能激活雌激素受体介导的信号通路，促进心肌细胞存活，减少细胞凋亡，从而有效维护心功能。这些分子机制可能在破格救心汤发挥治疗作用的过程中起到了关键作用[29]-[34]。未来研究可进一步探讨这些成分与靶点之间的相互作用关系，以揭示破格救心汤更深层次的作用机制。

从GO富集分析的结果来看，34个交集基因靶点在生物过程(BP)中主要富集于循环系统中的血管过程、解剖结构的尺寸调控、管径调节等。多项实验表明，这些生物过程与AMI合并CS的病理生理过程高度吻合[35]。在心肌梗死和心源性休克的情况下，心脏血管系统的正常功能受到严重干扰，导致血液循环障碍。PJD可能通过调节这些与血管功能和结构相关的基因靶点，改善血液循环，减轻心脏负担，从而发挥治疗作用；在细胞组分(CC)方面，交集靶点主要富集于含胶原蛋白的细胞外基质、质膜外侧、内吞囊泡等。这些细胞组分与细胞间的相互作用、信号传导以及物质转运等生物学过程密切相关。特别是在心肌梗死过程中，细胞外基质的重塑和细胞膜的动态变化对于心肌细胞的修复和再生至关重要[25]。因此，PJD可能通过调节这些细胞组分相关的基因靶点，促进心肌细胞的修复和功能的恢复；从分子功能(MF)的角度来看，交集靶点主要富集于信号受体激动剂活性、受体–配体活性、细胞因子受体结合等。心脏受多种信号分子调控，而这些分子功能直接涉及到细胞信号传导和细胞间的通讯，是调控心血管系统生理和病理过程的关键环节。PJD可能通过这些靶点调节信号传导通路，从而影响心肌细胞的存活、增殖和分化，以及炎症反应等过程，最终达到治疗AMI合并CS的目的；KEGG富集分析显示，PJD在治疗AMI合并CS过程中主要参与的信号通路包括细胞因子–细胞因子受体相互作用、恰加斯病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、疟疾、脂质与动脉粥样硬化等疾病相关信号通路。这些通路在心血管疾病的发病机理中扮演着重要角色[36]-[38]。特别是细胞因子–细胞因子受体相互作用通路，它涉及到多种细胞因子的释放和受体的激活，是调控炎症反应、细胞增殖和迁移等关键生物学过程的重要环节[39]。PJD可能通过这些通路发挥多靶点的治疗作用，从而改善AMI合并CS患者的临床症状和预后。

本研究的分子对接实验表明破格救心汤的关键活性成分槲皮素和芸香苷与急性心肌梗死合并心源性休克治疗的核心靶点蛋白TNF具有较强的结合力，为破格救心汤从多成分、多靶点治疗急性心肌梗死合并心源性休克提供了重要的生物信息学依据。

综上所述，本研究基于生物信息学方法，初步阐明了破格救心汤治疗急性心肌梗死合并心源性休克的作用机制。这些发现不仅为破格救心汤的临床应用提供了理论支持，也为未来开发新型心血管疾病相关药物提供了有益的启示。我们还可以进一步深入研究这些靶点和通路的具体作用方式，以及它们之间的相互作用关系，从而为本病的治疗提供新的思路和方法。

NOTES

^*通讯作者。