1. 引言
油菜，是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)以菜籽榨油为主要种植目的的一年生或越年生草本植物的通称。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是全球重要的油料作物之一，也是我国主要的经济作物，年种植面积约1亿亩[1]，年产菜籽油约500万吨，占国产植物油总量的50%左右。目前，在国内广泛种植经过改良的“双低”油菜中，油酸(单不饱和脂肪酸)含量达60%以上，亚油酸和亚麻酸(多不饱和脂肪酸)比例最接近人体需要的比例，且富含维生素E、菜籽甾醇、菜油甾醇和豆甾醇，是权威油脂健康专家组认定的“最健康的大宗食物油”[2]。
在油菜生长发育过程中，常常受到干旱、低温、盐渍等多种非生物环境胁迫的影响，从而引发体内一系列生理和生化代谢反应，这些反应会影响植株正常的代谢与生长，不利于营养体的发育，严重时甚至导致不可逆损害，并最终造成作物死亡[3]。其中，目前低温胁迫是限制“稻油”“稻稻油”多熟制种植模式发展的主要因素。在多熟制模式下需要选择发育进展更快的早熟、超早熟油菜，早熟油菜易早薹早花，遭遇春冻极易导致叶片受冻，花蕾闭蕾、死蕾，花朵畸形，花序死亡，角果空瘪等，最终造成产量损失[4]。因此，促进油菜生产的健康发展，最有效的方法就是开展油菜耐低温的机理研究，提高油菜的抗寒能力，培育高耐受性的油菜新品种，选育各生育期均具有强低温抗性的油菜品种，减少油菜因低温胁迫造成的损失[5] [6]。
近年来，关于油菜抗寒基因及其调控机制的研究取得了一定的进展。Raza等[7]对甘蓝型油菜低温胁迫反应的全基因组转录因子分析，超过400个TFs在冷应激反应中有差异表达，其中有25个TFs在总DEGs中的表达量极高；利用转录组的方法在白菜型油菜中鉴定出136个推断的bZIP转录因子，其中6个基因可能与低温胁迫反应有关[8]；油菜基因型中的低温胁迫响应基因、代谢物和代谢途径，发现大多数DEGs和差异积累的代谢物参与淀粉和蔗糖代谢以及苯丙氨酸代谢进行了组学研究，这些研究为深入探究油菜的抗寒性机制提供了重要的参考[9]-[11]。在冷响应表达的基因中，与糖代谢相关的酶基因也较多[12]-[15]。
在拟南芥中，己糖激酶样基因AtHKL1在低温胁迫下被诱导表达，并迅速激活以应对低温条件。目前，对油菜HKL1基因相关报道极少，多集中在对其逆境胁迫的应答及分子机制方面，尚未有将HKL1基因转入油菜的效果报道[16] [17]。为此，本研究构建了甘蓝型油菜BnaHKL1基因过量表达载体pFGC5941-BnaHKL1，并采用农杆菌介导法将该载体转入甘蓝型油菜“XY15”品系的基因组中，以获得基因过量表达植株[18]-[21]。以糖含量变化作为抗性参考指标，比较了转基因油菜与野生型油菜在低温胁迫条件下糖含量的变化[22]。这为进一步研究该基因的功能奠定了基础，同时也为HKL1基因在油菜分子育种中的应用提供了理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
甘蓝型油菜材料“XY15”种子来自于湖南农业大学作物表观遗传调控与发育重点实验室。大肠杆菌DH5α感受态由本实验室保存，植物表达载体pFGC5941由本实验室提供。
2.2. 方法
2.2.1. 过量表达载体构建
以甘蓝型油菜cDNA为模板，构建反应体系如下：cDNA (300 ng) 1 μL、Phanta Max Super - Fidelity DNA Polymerase 1 μL、2 × Phanta Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、引物F (10 μM) 0.5 μL、引物R (10 μM) 0.5 μL以及ddH₂O 21 μL，总体积为50 μL。PCR反应条件设置为：预变性95℃，持续3分钟；变性95℃，15秒；退火62℃，15秒；延伸72℃，45秒；最终延伸72℃，5分钟，共进行34个循环。使用引物Bna-C-F(5'TGAGCGAACCATGCATTCAA3')和Bna-C-R(5'TGACCGAACCATGCATATCCGA3')扩增带有酶切位点的BnaHKL1 CDS片段。
通过胶回收试剂盒回收目标片段，并将回收的片段连接到pEASY载体上，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。涂抹到带有卡那霉素(Kan)的筛选培养基上，挑单菌落，根据以下反应体系进行菌落PCR验证：单菌落/菌液/DNA 1 μL、2 × Rapid Taq Master Mix 7.5 μL，引物F (10 μM) 0.2 μL，引物R (10 μM) 0.2 μL，以及ddH₂O 6.1 μL，总体积15 μL。PCR条件与前述相同，仅改变引物为35S-F (CTATCCTTCGCAAGACCCTTC)和Bna-C-R，以确认转化成功样品。测序结果显示正确的，则进一步扩大培养后，用质粒提取试剂盒提取带目标片段的pEASY-BnaHKL1 CDS质粒用于下一步。
在提取质粒后，根据以下酶切反应体系酶切与连接：质粒(1 ng) µL，10 × buffer 2 µL，酶1 (SwaI)约0.5 µL，酶2 (SmaI)约0.5 µL及ddH₂O至20 µL。其中，对pEASY-BnaHKL1 CDS和pFGC5941进行双酶切分别回收需要的片段；将大小正确片段再通过T4连接酶完成连接后，用DH5α感受态细胞转化大肠杆菌。同样挑选单菌落验证，如与预期一致，即对检验合格的阳性株送去测序，对比分析测序结果。如确认无误，即可扩大培养并从中提取质粒。测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。
2.2.2. 根癌农杆菌转化
采用电击转化法，将过表达载体pFGC5941-BnaHKL1质粒转化至根癌农杆菌GV3101中。随后，将转化后的菌株涂布于含有50 µg·mL−1卡那霉素、50 µg·mL−1利福平和50 µg·mL−1庆大霉素的培养基上，以筛选阳性菌株。将平板放置于28℃摇床中培养2~3天后，挑取单个菌落进行阳性克隆的鉴定。
2.2.3. 遗传转化油菜
(1) 种子的消毒与播种：在生物安全柜中进行全程无菌操作。使用75%酒精及0.1%升汞溶液消毒种子，并浸泡后用灭菌水冲洗干净。将灭菌种子点播在M0培养基上，在24℃暗培养6天。
(2) 浸染菌的制备：转化农杆菌并PCR确认目标克隆，然后OD600达到0.3~0.5时重悬于DM培养基中，经离心处理再次重悬，再放入28℃摇床培育。
(3) 外植体准备与浸染：切取下胚轴，用DM培养基保持湿润，在重悬菌液中浸染15分钟。同时需要轻摇确保接触充分。之后去除多余的菌液，用滤纸吸走残留部分。
(4) 外植体共培养：外植体置于M1培养基中，共培育40~48小时以促使浸染(观察有明显白色菌点应立即转出)。
(5) 初步诱导筛选：将外植体转至M2进行光照处理20天直到出现绿色组织，每隔一定时间更换新鲜介质以提高效率。
(6) 愈伤组织再生：当外植体在M2中明显分化且呈绿色时才能转入M3，每14天继代一次直至出现绿芽，如未产生可选择性放弃该外植体。
(7) 再生植株的生根、炼苗及移栽：从芽点切取长出两片叶子的部分(芽点尺寸应确保超过3 cm，以保证具备足够的生长潜力)，放入M4培养基中，之后将已经生根的小幼苗转移至蛭石中进行炼苗一周，再将小幼苗移栽至土壤中。
2.2.4. 转基因油菜的检测
待小花砵中的植株长出2~3片新叶，用CTAB法提取叶片DNA，PCR检测引物对位：pFGC5941-F (5’TGCCGATGAACCATGCATGTCGA3’)和G-Bna-C-R (5’CTGACATTAGGCACGTCAACCTGA3’)。预计PCR产物的长度为1497 bp，产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2.2.5. 半定量RT-PCR
用RNA试剂盒(普洛麦格，上海)分别提取转基因和野生型油菜幼苗叶片总RNA，经反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoFisher Scientific, Shanghai)反转录合成cDNA。根据BnaHKL1基因的保守区设计特异性引物BnaHKL1-F (5’CGCGGATCCGCATTTAATTCTTGG3’)和BnaHKL1-R (5’ACTCCGTAGCTAACCTGAACGCTCA3’)，同时，油菜看家基因Actin2作为参照，引物为Actin2-F (5’TGCTAGACACCATGGAGCAGCGGCAGTGA3’)和Actin2-R (5’TGCTCAGCACCTAGGCGCACGTAAGCA3’)。以野生型与转基因植株的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR循环条件设置为：预变性95℃，持续3分钟；变性95℃，15秒；退火58℃，15秒；延伸72℃，45秒；最终延伸72℃，5分钟，共进行35个循环。扩增产物经电泳后，通过凝胶成像系统拍照记录。所有实验重复进行三次。
2.2.6. 转基因植株的糖含量测定
用植物蔗糖含量检测试剂盒BC2460 (索莱宝，北京)结合分光光度法测定油菜幼苗叶片蔗糖含量(用分光光度法测定)，波长为480 nm；用可溶性糖试剂盒BC0030 (索莱宝，北京)结合分光光度法测定可溶性糖含量(用分光光度法测定)，波长为620 nm；用果聚糖试剂盒FRUCTAN assay kit K-FRUC (Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland)，结合分光光度法测定果聚糖含量(用分光光度法测定)，波长为410 nm；用淀粉试剂盒BC0700 (索莱宝，北京)结合分光光度法测定淀粉含量(用分光光度法测定)，波长为620 nm。
3. 结果与分析
3.1. 植物表达载体pFGC5941-BnaHKL1的构建
以甘蓝型油菜cDNA为模板，采用引物BnaHKL1-F和引物BnaHKL1-R扩增BnaHKL1片段。结果表明，扩增产物大小与预期一致，约为1497 bp (图1)。将扩增得到的产物插入至pFGC5941的相应位点，并转化大肠杆菌。利用设计好的载体特异性引物35S-F和Bna-C-R对重组载体进行菌落PCR验证，结果显示重组载体中的插入片段与预期一致(图2)。经过测序分析，确认插入片段的序列及方向均正确，从而证明pFGC5941-BnaHKL1过量表达载体构建成功。
Figure 1. PCR amplification of BnaHKL1. M.250 bp DNA Ladder; 1. BnaHKL1
图1. BnaHKL1片段的PCR扩增结果。M.250 bp DNA Ladder；1. BnaHKL1
Figure 2. PCR amplification for detecting pFGC5941-BnaHKL1 vector. M.250 bp DNA Ladder；1, 2, 3: BnaHKL1
图2. pFGC5941-BnaHKL1载体的菌落PCR鉴定。M.250 bp DNA Ladder；1、2、3：BnaHKL1
3.2. 转基因植株的分子检测和过表达分析
借助农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，420个外植体，得到34株抗性油菜(图3，表1)。
Figure 3. Genetic transformation of rapeseed mediated by agrobacterium tumefaciens. a) Hypocotyl growth; b) Joint culture; c) Callus induction; d) Callus differentiation; e) Roots formation; f) Regenerated plantlet
图3. 根癌农杆菌介导的油菜遗传转化。a) 下胚轴生长；b) 共培养；c) 愈伤组织诱导；d) 愈伤组织分化；e) 生根；f) 再生植株
Table 1. Statistical table of transgenic rape
表1. 转基因油菜统计表
载体 |
抗性 |
下胚轴 |
愈伤组织 |
抗性幼苗 |
转基因油菜 |
阳性率(%) |
pFGC5941-BnaHKL1 |
PPT |
420 |
112 |
34 |
11 |
32% |
进一步对34株抗性苗进行PCR检测，确认获得了11株转基因植株(图4)。
Figure 4. PCR detection of partial transgenic plants. M.1 kb DNA Ladder. 1~6: Transgenic plants; 7: Blank control; 8: Untransformed plant (negative control); 9: pFGC5941-BnaHKL1 vector (positive control)
图4. 部分转基因植株的PCR检测。M.1 kb DNA Ladder。1~6：转基因植株；7：空白对照；8：未转基因植株(阴性对照)；9：pFGC5941-BnaHKL1载体(阳性对照)
从11株转基因植株中选取其在电泳检测中显示的电泳条带相对较弱的3株转基因植株，检测BnaHKL1基因是否过表达。半定量结果显示，相较于非转基因的野生型油菜，这三株转基因植物中BnaHKL1基因的表达量均显著提高(图5)。
Figure 5. Expression analysis of the BnaHKL1 gene. 1. Wild-type; 2~4: Three transgenic plants of the to generation
图5. BnaHKL1基因表达分析。1.野生型植株；2~4：3株To代转基因植株
3.3. 糖含量测定分析
通过对受体XY15与过表达植株中的蔗糖、可溶性糖、果聚糖和淀粉进行了测定，结果显示：在过表达植株中的蔗糖、可溶性糖、果聚糖的含量显著高于XY15中的含量；相反，过表达植株中淀粉含量显著低于XY15植株中的含量(图6)。
注：符号*表示在p < 0.05的概率水平上与CK有统计学意义上的显著偏差。
Figure 6. The variations in the sugar determination contents of XY15 and BnaHKL1
图6. XY15和BnaHKL1的糖测定含量变化
4. 讨论
己糖激酶存在于微生物、动物和植物中，是生物进化中最保守的葡萄糖传感器，是植物进行呼吸代谢的关键酶之一[23]。己糖激酶主要催化己糖磷酸化，使己糖进入糖酵解途径，为植物体的生长和发育提供能量[24]。其中，己糖激酶HKL1基因在植物体内具有多个同源基因，参与植物糖代谢的基因，编码的酶可以催化己糖的磷酸化，从而参与植物体内糖的合成和分解代谢，是植物生长发育和胁迫应答中发挥重要作用的基因[25]。
5. 结论
BnaHKL1基因过量表达能改变油菜叶片中的糖的组分，让蔗糖、果聚糖和总可溶性糖含量增加，可溶性糖和果聚糖的增加有利于植物提高抗非生物胁迫的能力[26] [27]。
过量表达BnaHKL1基因来提高油菜组织中可溶性糖的含量，就有可能创制出具有耐寒性的材料。油菜在“稻–稻–油”栽培模式下，生产上急需特早熟油菜品种，而特早熟油菜遇到的最主要的问题是：在长江中下游以南，1月份气温往往在−1~−2℃，这样的低温条件下，幼荚难以形成果实，后期无法形成有效产量。因此，通过改变HKL1基因的表达模式，不仅可以深入探究HKL1基因在植物耐寒过程中的作用机制，还可能有利于创制幼荚耐寒的新种质，为特早熟油菜品种的创制提供新的途径。
基金项目
国家自然基金委联合重点项目(U20A2028)，湖南农业大学研究生科研创新项目(2023XC078)。
NOTES
*通讯作者。