基于孟德尔随机化方法探究多种危险因素与胰腺癌发病风险的因果关系

Exploring the Causal Relationship between Multiple Risk Factors and the Risk of Pancreatic Cancer Based on Mendelian Randomization Method

摘要: 目的：胰腺癌是全球常见的死亡原因，可由多种危险因素引起。而这些因素相互关联、互为混杂。分离混杂因素得出因果关系，就可以了解是哪些因素对于胰腺癌的发生起到了实际影响。为此本研究利用两样本孟德尔随机化方法探究多种危险因素与胰腺癌发病风险之间的因果关系。方法：采用公共数据库中的工具变量(IV)分别进行两样本孟德尔随机化(TSMR)分析，通过逆方差加权法(IVW)，MR-Egger回归分析、加权中位数分析(WME)等两样本孟德尔随机化方法来评估肥胖、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病及高胆固醇血症与胰腺癌发病风险之间的因果关系。最后进行敏感性分析来评估结果的可靠性与稳健性。结果：逆方差加权法显示肥胖(OR = 1.250, P = 0.04)、吸烟(OR = 5.386, P = 0.01)、饮酒(OR = 1.027, P = 0.39)、高血压(OR = 0.778, P = 0.004)、糖尿病(OR = 1.041, P = 0.51)、高胆固醇血症(OR = 0.480, P = 0.28)，数据显示吸烟、肥胖、高血压与胰腺癌的发病具有因果关系。敏感性分析的多效性及异质性P值均 > 0.05，因此孟德尔随机化在本研究中为因果推断的有效方法。结论：利用两样本孟德尔随机化方法排除混杂因素和反向因果关联，据此可以确定吸烟、肥胖、高血压与胰腺癌发病之间具有因果关系。

Abstract: Objective: Pancreatic cancer is a common cause of mortality worldwide and can be influenced by various risk factors. These factors are interrelated and mutually affect each other. By separating the confounding factors and obtaining the causal relationship, we can know which factors play a real role in the occurrence of pancreatic cancer. This study aims to investigate the causal relationships between various risk factors and the risk of pancreatic cancer using two-sample Mendelian randomization (MR) methods. Methods: Two-sample Mendelian randomization (TSMR) analyses were conducted using instrumental variables (IV) from public databases. Causal relationships between obesity, smoking, alcohol consumption, hypertension, diabetes, and hypercholesterolemia and the risk of pancreatic cancer were evaluated using inverse variance-weighted (IVW), MR-Egger regression analysis, and weighted median analysis (WME) in the two-sample Mendelian randomization methods. Sensitivity analyses were performed to assess the reliability and robustness of the results. Results: Inverse variance-weighted analysis indicated that obesity (OR = 1.250, P = 0.04), smoking (OR = 5.386, P = 0.01), alcohol consumption (OR = 1.027, P = 0.39), hypertension (OR = 0.778, P = 0.004), diabetes (OR = 1.041, P = 0.51), and hypercholesterolemia (OR = 0.480, P = 0.28) showed causal relationships with the risk of pancreatic cancer. Sensitivity analyses demonstrated that the pleiotropy and heterogeneity P-values were both >0.05, indicating the effectiveness of Mendelian randomization for causal inference in this study. Conclusion: Two-sample Mendelian randomization methods, by eliminating confounding factors and reverse causality, confirm the causal relationships between smoking, obesity, hypertension, and the risk of pancreatic cancer.

1. 引言

胰腺癌是一种恶性肿瘤，起源于胰腺组织，通常在早期没有明显症状，因此常常被称为“沉默的杀手”[1]。一旦病情发展到晚期，患者常会出现黄疸、腹痛、消化不良、体重减轻等症状。胰腺癌的发病率逐年上升，而且由于其难以早期诊断和治疗，预后不佳，导致死亡率接近其发病率[2]。胰腺癌在过去的20年里，全球每年诊断出的胰腺癌病例数量翻了一番。经济发达地区的发病率高于发展中国家，这种现象可能是饮食、老龄化与医疗水平有关[3] [4]。由于缺乏准确的筛查标志物，目前尚不能进行大规模胰腺癌筛查[5]。因此，确定初级预防的风险因素是减少该疾病发病率和后果的一种重要方法。胰腺癌的病因尚未完全明确，流行病学调查显示胰腺癌发病与多种危险因素有关如吸烟、糖尿病、肥胖、高脂饮食、饮酒、高血压[6]-[8]。在上海一项针对慢性胰腺炎患者的随访研究进一步证实了吸烟与胰腺癌之间的联系。研究发现，每年吸烟超过60包的患者胰腺癌的发病风险显著提高[6]。一项关于吸烟对胰腺癌风险影响的mata分析发现，与从不吸烟者相比，吸烟人群患胰腺癌风险增加。在吸烟率下降的地区，吸烟导致的胰腺癌比例也有所下降[9]。一项研究发现，与没有糖尿病的患者相比，那些病程不超过1年的新发2型糖尿病患者，其胰腺癌的风险增加了近7倍。然而，通过使用抗糖尿病药物或胰岛素控制血糖后，胰腺癌的患病风险有所降低[10]世界癌症研究基金会与美国癌症研究所工作组认为超重、肥胖或身高过高会增加患胰腺癌的风险。胰腺癌肿瘤微环境中的脂肪细胞在促炎过程中起着关键作用，通过与癌细胞和其他间质细胞的串扰机制促进胰腺癌的进展[11]中国的一项队列研究调查了1783例胰腺癌患者的BMI与胰腺癌生存率的关系，未发现两者有相关性。不同研究之间确定的危险因素不尽相同，其中还相互矛盾[12] [13]。

于是，我们引入一种新的方法去研究多因素与胰腺癌，通过从因果关联的角度对胰腺癌进行研究，可以帮助临床医生对胰腺癌的发展进行干预，提供干预措施和预防策略，从而改善胰腺癌的预后和降低患者家庭及社会的卫生经济负担[14]。这种新方法是孟德尔随机化研究[15] [16]，它是一种评估病因推断的数据分析技巧，是利用与暴露因素具有强相关的遗传变异作为工具变量，来评估暴露因素与结局之间的因果关系。基于全基因关联数据库GWAS的遗传数据[17]，利用随机分配的遗传变异对表型的影响，来推断表型对疾病的影响。这种方法不仅选择的样本量大更有可信度，同时避免了随机对照试验(randomized controlled trials, RCT)中的代表性问题混杂因素与反向因果[18]。

2. 资料与方法

2.1. 数据来源与SNP的选择

吸烟、饮酒、肥胖、高血压、糖尿病及高胆固醇血症与胰腺癌的数据均来自IEU Open GWAS project (https://gwas.mrcieu.ac.uk/)网站。详见表1，以P < 5 × 10⁸为筛选条件，从暴露因素中选择具有统计学意义的SNP位点作为初步筛选的工具变量。设置连锁不平衡系数r² = 0.001，kb = 10,000，以保证各个SNP之间互相独立，排除多效性对结果影响。收集每个SNP的主要等位基因、等位基因频率、β值、Ｐ值和标准误差。计算IVs的F值，确保F > 10的IVs被纳入研究，以避免弱IVs所引起的偏差。此外，通过Phenosanner平台筛查后予以排除与混杂因素相关的SNPs。最终数据集为本次研究所需要的工具变量。

Table 1. Summary of the GWAS included in this two-sample MR study

表1. 两样本MR研究中GWAS数据库中的简要信息

	GWAS ID	Trait	Consortium	Sample size	Number of SNPs	Population
BMI	ieu-b-40	body mass index	GIANT	681,275	2,336,260	European
Smoked	ukb-b-20261	Ever smoked	MRC-IEU	461,066	9,851,867	European
Alcohol	ukb-b-5779	Alcohol intake frequency	MRC-IEU	462,346	9,851,867	European
Hypertension	ukb-b-12493	hypertension	MRC-IEU	463,010	9,851,867	European
Pancreatic cancer	ebi-a-GCST90018893	Pancreatic cancer	NA	476,245	24,195,229	European
High cholesterol	ebi-a-GCST90038690	High cholesterol	NA	484,598	9,587,836	European
Type 2 diabetes	ebi-a-GCST90018926	Type 2 diabetes	NA	490,089	24,167,560	European

2.2. MR分析

在这项研究中，我们运用了双样本MR方法来评估吸烟、饮酒、肥胖、高血压、糖尿病及高胆固醇血症与胰腺癌发病风险之间的因果关系。MR方法基于三个关键假设[19]：1) SNP与暴露因素之间存在强相关性。2) SNP与混杂因素之间没有相关性。3) SNP仅通过暴露因素对结局产生影响，即不存在水平多效性。本研究采用了逆方差加权(IVW)、加权中位数(WM)、MR-Egger回归分析以上暴露与胰腺癌之间的潜在关系以保证结果的可靠性。

2.3. 敏感性分析

我们进行孟德尔随机化分析和离群值(MR-PRESSO)检验、Cochran Q检验、漏斗图、留一法(Leave-one-out)和MR-Egger截距检验。若Q检验的P > 0.05，则说明不存在SNPs间的异质性。为了避免出现某个SNP导致MR分析出现因果关联的偏倚，我们进行留一法分析，逐个剔除单个SNP以排除个别SNP对因果关联的干扰。本研究采用R (4.3.1版本)中的“TwoSampleMR”和“MRPRESSO”包进行分析，P < 0.05认为差异具有统计学意义。MR分析结果以优势比(odds ratio, OR)和95%置信区间(confidence interval, CI)表示。

3. 结果

3.1. IVs选择结果

本研究工具变量筛选标准均是通过提取强相关、去除连锁不平衡、去除弱工具变量，剔除混杂因素，并且在胰腺癌的GWAS数据库中匹配上述SNP，数据统一化处理后，去除回文序列的SNPs，得到最终纳入研究的肥胖SNPs 479个、吸烟SNPs 74个、饮酒SNPs 75个、高血压SNPs 66个、2型糖尿病SNPs 151个、高胆固醇血症SNPs 78个。

3.2. MR分析结果

3种方法的结果见表2，由表可知，IVW方法显示支持吸烟、肥胖、高血压与胰腺癌之间存在因果关系，结果示：肥胖(OR = 1.250, P = 0.04)、吸烟(OR = 5.386, P = 0.01)、饮酒(OR = 1.027, P = 0.39)、高血压(OR = 0.778, P = 0.004)、糖尿病(OR = 1.041, P = 0.51)、高胆固醇血症(OR = 0.480, P = 0.28)，MR-Egger回归分析显示除肥胖(OR = 1.871, P = 0.04)外，余下因素P值均大于0.05。

Table 2. Three MR Regression results of BMI, smoking, alcohol consumption, hypertension, diabetes and cholesterol

表2. BMI、抽烟、饮酒、高血压、糖尿病、胆固醇的三种MR回归结果

	Method	nsnp	β	SE	OR (95%CI)	P
BMI	MR-Egger回归	479	0.597	0.296	1.817 (1.016~3.250)	0.04
	WME	479	0.304	0.194	1.356 (0.926~1.984)	0.11
	IVW	479	0.223	0.113	1.250 (1.001~1.562)	0.04
Smoked	MR-Egger回归	74	4.882	3.198	131 (9.250~69677.664)	0.13
	WME	74	1.788	0.931	5.982 (0.764~46.795)	0.08
	IVW	74	1.683	0.666	5.386 (1.458~19.894)	0.01
Alcohol intake	MR-Egger回归	75	−0.092	0.124	0.912 (0.714~1.164)	0.46
	WME	75	−0.004	0.018	0.996 (0.960~1.033)	0.84
	IVW	75	0.027	0.032	1.027 (0.965~1.094)	0.39
Hypertension	MR-Egger回归	66	0.194	0.325	1.215 (0.642~2.298)	0.55
	WME	66	−0.145	0.081	0.864 (0.736~1.014)	0.07
	IVW	66	−0.250	0.087	0.778 (0.655~0.924)	0.004
Type 2 diabetes	MR-Egger回归	151	0.019	0.142	1.019 (0.770~1.349)	0.89
	WME	151	0.026	0.091	1.026 (0.857~1.229)	0.77
	IVW	151	0.04	0.062	1.041 (0.921~1.176)	0.51
High cholesterol	MR-Egger回归	78	−0.276	1.224	0.758 (0.068~8.357)	0.82
	WME	78	−1.234	1.081	0.291 (0.034~2.425)	0.25
	IVW	78	−0.731	0.683	0.480 (0.126~1.835)	0.28

3.3. 敏感性分析结果

MR-Egger回归截距项分别为肥胖b = 0.0006 (P = 0.173)、吸烟b = −0.022 (P = 0.309)、饮酒b = 0.003 (P = 0.878)、高血压b = 0.019 (P = 0.349)、2型糖尿病b = 0.001 (P = 0.871)、高胆固醇血症b = −0.004 (P = 0.654)，即筛选出的SNP与结局胰腺癌之间不存在水平多效性(见表3)，因此孟德尔随机化方法在本研究中为因果推断的有效方法。Q检验仅糖尿病P值 = 0.016，提示SNP之间不存在异质性(见表4)。另外，MR-PRESSO分析结果表明本研究所纳入的SNPs没有显著的异常值。各种暴露因素的散点图(见图1)，可以直观看到，吸烟、肥胖与胰腺癌成正相关，高血压与胰腺癌成负相关。图2森林图表明这些研究结果一致，支持存在因果关联。留一法图(图3)表明，没有单一SNP对总体评估有主导作用。此外，漏斗图(图4)的结果也显示因果关联受到潜在偏倚的影响较小。通过这些分析方法，我们能够更加可靠地评估SNPs的影响，并确认研究结果的稳健性。

Table 3. Horizontal pleiotropy

表3. 水平多效性

	egger_intercept	P
肥胖	−0.006	0.173
抽烟	−0.022	0.309
饮酒	0.003	0.878
高血压	0.019	0.349
高胆固醇	−0.004	0.654
糖尿病	0.001	0.871

Table 4. Heterogeneity results

表4. 异质性结果

	Q	P
肥胖	443.577	0.868
抽烟	60.661	0.848
饮酒	95.77	0.243
高血压	80.806	0.103
高胆固醇	79.698	0.394
糖尿病	189.325	0.016

A1

B1

C1

D1

E1

F1

注：A1、B1、C1、D1、E1、F1分别为BMI、抽烟、饮酒、高血压、糖尿病、胆固醇。

Figure 1. Scatter plot

图1. 散点图

A2

B2

C2

D2

E2

F2

注：A2、B2、C2、D2、E2、F2分别为BMI、抽烟、饮酒、高血压、糖尿病、胆固醇。

Figure 2. Forest plot

图2. 森林图

A3

B3

C3

D3

E3

F3

注：A3、B3、C3、D3、E3、F3分别为BMI、抽烟、饮酒、高血压、糖尿病、胆固醇。

Figure 3. Left-behind diagram

图3. 留一法图

A4

B4

C4

D4

E4

F4

注：A4、B4、C4、D4、E4、F4分别为BMI、抽烟、饮酒、高血压、糖尿病、胆固醇。

Figure 4. Funnel diagram

图4. 漏斗图

4. 讨论

本研究采用GWAS数据，通过使用两样本孟德尔随机化方法来分析吸烟、饮酒、肥胖、高血压、糖尿病及高胆固醇与胰腺癌发病风险之间的因果关系。研究结果显示，吸烟、肥胖、会导致胰腺癌发生风险增大并具有因果关系。高血压会降低胰腺癌发生风险，并具有因果关系。糖尿病、饮酒、高脂血症与胰腺癌发生无因果关系。

传统的观察性研究难以解释多个因素的相互影响和建立单个因素的因果关系。本研究结果将支持肥胖对胰腺癌发病风险增加的直接作用，其机制可能为肥胖导致胰岛素水平增加和高胰岛素血症的风险，这反过来又降低了胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白，从而增加了胰岛素样生长因子I (IGF1)的循环水平[19]。胰岛素和IGF1都是肿瘤细胞中细胞增殖和细胞凋亡抑制的促进剂[20]。肥胖个体的身体内含有大量的脂肪组织，这些脂肪组织会分泌多种脂肪细胞因子，其中低脂联素和高瘦素水平也是胰腺癌易感因素。瘦素水平的升高会激活Notch通路，这是许多肿瘤的信号通路，包括胰腺癌[21]。此外，低脂联素会导致脂肪细胞在体内积聚，形成促癌环境，从而诱发胰腺癌的发生[22]。烟草中存在多种致癌物质，其中以芳香胺和多环芳烃为主要成分。这些致癌物质可以通过呼吸道吸收进入血液，进而到达胰腺。另外，它们也可能通过消化道进入胰管，最终影响胰腺功能。一旦进入胰腺，这些致癌物质可能导致抑癌基因失活和致癌基因过度表达，从而促进恶性肿瘤的发生[22]。其次，烟草中的尼古丁和其他成分可以刺激胰腺分泌大量胰岛素和生长因子，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，从而促进胰腺癌的发展[23]。此外，烟草烟雾中的一氧化碳和其他有害成分也可能对胰腺组织产生损害[24] [25]。高血压史是胰腺癌发病的危险因素，这可能与高血压患者胰腺小血管硬化，导致胰腺免疫损伤有关[26]。酒精可以促进胰腺癌的发生和发展，其作用机制主要包括增强胰腺对胆碱能和促胰酶素的反应，导致富含蛋白的胰液分泌增加。此外，饮酒者的胰腺溶酶体易受损，溶酶体酶更容易激活胰蛋白酶，从而引起胰腺损伤[27]。糖尿病可能通过以下机制诱发胰腺癌：高血糖和胰岛素抵抗的相互作用，通过影响胰腺细胞的增殖和代谢，从而引发肿瘤。高血糖增加糖醛还原酶活性，激活多元醇通路，导致正常组织损伤和癌变，同时高血糖为肿瘤细胞提供良好的生长环境，促进肿瘤细胞增长。长期暴露于高血糖环境可导致胰腺慢性刺激，损伤胰腺细胞，破坏线粒体，促使正常细胞向肿瘤细胞转化[28] [29]。高胆固醇血症可能通过多种途径影响胰腺癌的发病机制。首先，胆固醇是细胞膜的重要组成部分，高胆固醇水平可能促进肿瘤细胞的增殖和生长。其次，胆固醇代谢产物，特别是氧化型胆固醇代谢产物，可能对细胞的DNA损伤和修复产生影响，从而促进癌症的发生。胆固醇代谢产物还可能通过影响炎症反应、细胞凋亡和细胞信号传导等途径参与胰腺癌的发病机制。另外，高胆固醇血症可能通过影响肝脏的胆汁酸合成和代谢，导致胆汁酸在肠道内的过量吸收，从而影响胆汁酸的代谢途径，增加胰腺癌的发病风险[30]。

Mendelian randomization (MR)分析最大限度地减少了观察性研究固有偏倚的可能性，这种偏倚可能由于残余混杂或反向因果关系而引起。通过使用MR分析，我们能够更好地控制这些潜在的偏倚因素，从而得出更准确的结论。本研究全面评估吸烟、肥胖、高血压与胰腺癌发生风险之间因果关系的研究。我们使用了全基因组关联研究数据集来确定工具变量，并采用了三个不同的MR分析模型来确定其因果关系。然而，MR分析的结果易受多效性的影响[31]。为了消除多效性的影响，我们采用了加权中位数分析方法，即使有50%的单核苷酸多态性(SNPs)不是有效的工具变量，该方法仍能提供有效的MR分析结果。此外，我们还使用MR-Egger回归方法来评估不平衡暴露对结果的因果效应[32]。根据截距P值显示，MR-Egger方法并未发现不平衡多效性的证据。本研究存在一定的局限性。首先，所有的GWAS数据均来源于欧洲人群，我们所得出的结果是否适用于其他人群还有待进一步研究。其次，由于胰腺癌的影响因素过多，我们的研究中只列出了部分影响胰腺癌的因素，未来需要进行更广泛的研究。最后，研究过程中选用的结局数据均为汇总结果，并未对具体分类的疾病进行研究，无法探究更加具体的表型，如胰腺癌严重程度等。本研究证实肥胖、吸烟、高血压与胰腺癌均有因果关系，而肥胖、抽烟会导致胰腺癌风险增大。了解肥胖、吸烟、高血压等危险因素与胰腺癌的关系，可以帮助人们采取相应的预防措施，减少患病风险。通过健康的生活方式、规律的体检和积极的健康管理，可以有效降低胰腺癌的发病率，保护人们的健康。

NOTES

^*通讯作者。