ICU重症肺炎患者病原体检测技术的研究进展

Research Progress on Pathogen Detection Technology for ICU Severe Pneumonia Patients

摘要: 重症肺炎(Severe pneumonia, SP)是一种在重症监护病房(Intensive care unit, ICU)中常见的危急呼吸系统疾病。患者病情可以迅速恶化，发展为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，甚至发展为感染性休克，导致血液循环严重衰竭和多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，根据相关研究，重症肺炎的患者通常需要入住ICU进行全面监护和治疗，因为其死亡率较高，尤其是在老年人和有基础疾病的患者中更为显著。医务人员需要采取积极的治疗措施，包括抗生素治疗、呼吸支持、液体复苏等，以控制感染、减轻炎症反应，并防止并发症的发生。其中，病原菌的检测及抗生素的应用对于提高患者的生存率和改善预后至关重要。目前，重症肺炎的病原体正在发生变化，传统检测方法主要依赖标本染色、培养及生化反应等。尽管微生物培养被视为感染病原体检测的金标准，但对一些非典型病原菌和病毒的检测仍然耗时且难度较大，给临床诊断和治疗带来了挑战。随着各类检测技术的不断发展，临床上重症肺炎病原体的检测阳性率显著上升。本文旨在对ICU重症肺炎患者的病原体及其检测方法的最新进展进行综述。

Abstract: Severe pneumonia (SP) is a common acute and critical respiratory disease in intensive care unit (ICU), which can rapidly develop from local infection to systemic inflammatory response syndrome (SIRS), It can even cause severe complications such as septic shock and multiple organ dysfunction syndrome (MODS). According to relevant research, patients with severe pneumonia usually need to be admitted to the ICU for general care and treatment because of its high mortality, especially in the elderly and patients with underlying diseases more significant. Medical personnel need to take the initiative treatment measures, including antibiotic treatment, respiratory support, fluid resuscitation, etc., to control infection, reduce inflammatory reaction, and prevent complications of the Environmental Protection Department. The detection of pathogenic bacteria and the application of antibiotics are very important to improve the survival rate and prognosis of patients. Currently, severe pneumonia traditional detection methods mainly depend on specimen staining, culture and biochemical reaction, etc. Although microbial culture is regarded as the gold standard for the detection of infectious pathogens, the detection of some atypical pathogens and viruses is still time-consuming and difficult, posing challenges to clinical diagnosis and treatment. With the development of various detection techniques, the positive rate of pathogens in severe pneumonia increased significantly. This article aims to provide a review of the recent progress of pathogens and their detection methods in ICU patients with severe pneumonia.

1. 引言

重症肺炎(Severe pneumonia, SP)，一种严重的肺部感染，是由细菌、病毒、真菌及不典型病原体等感染引起的急危重病症[1]。迅速识别病原体并实施针对性的抗感染治疗对改善患者预后至关重要[2] [3]。近年来，重症肺炎的病原体谱发生了变化，ICU患者中多药耐药菌(multi-drug resistance bacteria, MODR)和病毒感染的比例显著增加[4] [5]。随着病原体新的检测技术不断出现，重症肺炎病原体检出率也不断提高。监测病原体变化并选择合适的检测方法对早期识别和精准干预具有重要意义。

2. 重症肺炎的临床现状

SP的发病机制十分复杂，主要包括病原体感染，炎症反应，凝血紊乱，氧化应激，肺部缺氧等机制，病原微生物如细菌、病毒或真菌等的感染是较为常见的发病机制。这类病原体能够侵入人体的呼吸系统，并在其中繁殖，触发身体免疫系统的异常反应以及氧化应激反应的增强。这一系列反应最终会导致肺泡和血管内皮细胞的损伤，引起急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合症(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)等病理性变化[6]。临床上患者通常表现为咳嗽、咳痰、发热、寒战，有较高的风险发展为呼吸衰竭，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征或感染性休克[7]。治疗策略主要集中于抗感染治疗和机械通气等，以缓解症状并控制病情的发展[8]。

3. 重症肺炎感染类型

3.1. 细菌感染

导致重症肺炎的病原体中，细菌与病毒、真菌、非典型病原体等相比占比较多，其中包括肺金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、纹带棒状杆菌等[9]。研究显示，有ICU机械通气患者有72%发生了耐药细菌的感染[10]。北京市西城区调查了1247例重症肺炎患者所感染的病原体，结果显示有20.21%的患者检测出细菌感染，检出率最高的病原菌分别是鲍曼不动杆菌(9.22%)、铜绿假单胞菌(8.26%)、嗜麦芽窄食单胞菌(7.78%)、肺炎克雷伯菌(6.74%) [11]。贵阳市公共卫生救治中心调查了463例重症肺炎患者标本中，共分离出604株病原菌，其中革兰阳性菌占26.99%，主要为金黄色葡萄球菌等，革兰阴性菌65.73% (397/604)，主要为鲍曼不动杆菌等[12]。这与国内其余地区重症肺炎感染的细菌有所差异[13]，这可能是由于地区不同，病原菌的种类及数量也存在差异。

3.2. 病毒感染

病毒感染是引起重症肺炎的另一大类病原体。近年来，病毒感染所致重症肺炎明显增多。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)所引起的持续大流行对全世界人们的生命健康产生了重大的威胁[14]，新型冠状病毒一旦进入宿主细胞，SARS-CoV-2基因组RNA的胞浆释放被激活并开始复制。新的病毒体然后组装并分泌到细胞间隙以感染邻近细胞引起相关感染[15]。新型冠状病毒感染的临床特征多种多样，从无症状到急性呼吸道感染，多器官功能障碍[16]。伴有多器官损伤的严重COVID-19疾病可能是致命的，其风险在很大程度上取决于合并症，包括糖尿病、肥胖、高血压等[17] [18]。因此，包含众多危险因素的患者在感染新型冠状病毒后，更容易出现重症肺炎。人腺病毒(human adenovirus, HAdV)也是常见的传染性病毒，严重感染的HAdV病死率可能超过50%，幸存患者会出现不同的后遗症，如闭塞性细支气管炎等[19]。有研究发现，人腺病毒也是导致儿童下呼吸道感染的主要病原体，尤其在婴幼儿、免疫缺陷或免疫抑制的儿童中，常导致重症肺炎的发生以及气道闭塞、支气管扩张等远期后遗症[20]。呼吸道合胞病毒也被认为是严重呼吸道疾病的主要病因之一[21]。对于病毒所导致的感染，鼻咽拭子的PCR检测仍然是当前的诊断标准[22]。由于生活习惯、季节等多种因素，导致各地区病毒种类有所差异。

3.3. 真菌感染

重症患者因其病情严重和免疫系统功能受损，成为了肺部真菌感染的高危群体[23]。过去，ICU中的肺部真菌感染往往被认为是免疫系统功能减退患者的特有疾病，尤其是在重症状况下，感染风险持续增加。研究发现，APACHE II > 18分、中心静脉置管留置、尿管植入、气管插管、2种广谱抗菌药物的使用 > 7 d、使用免疫抑制剂，ICU住院 > 7 d是重症患者医院获得性真菌感染的危险因素[24]。近期研究显示，由流感或SARS-CoV-2病毒引发的急性感染也被公认为真菌感染的一个风险因素[25]。Wu [26]等人的研究指出，卡氏孢子菌及曲霉菌是免疫功能低下患者最常见的感染病原菌。此外，肺念珠菌和肺隐球菌等病原体在肺部真菌感染中的检出率持续上升，它们同样对肺部真菌感染患者的预后构成了严重威胁[27]。

4. 重症肺炎病原体检测技术

4.1. 传统病原学检测技术

传统的病原体检测方法包括细菌涂片，细菌培养等方法，是指从临床样本中提取一小部分细菌，在显微镜载玻片上制备成薄层，以进行显微镜检验，并将样本中的细菌在适宜的培养基上培养，以便它们在实验室条件下生长，从而实现病原体的识别。细菌培养是临床普遍应用的技术，具有提供微生物确切病原学信息及抗生素敏感性等优点。但细菌涂片无法确定感染的具体病原体，细菌培养时间较长，通常需要数天时间。对于生长要求特殊或数量较少的细菌，仍存在着培养失败的风险，且对于病毒等病原体培养难度极大，仍存在较大局限性。

4.1.1. 痰细菌涂片及培养

在呼吸系统感染疾病的诊疗中，临床医生常通过呼吸系统分离菌检测结果指导用药及评估疗效，长期以来一直是检测肺炎病原菌的“金标准”。研究表明，合格的痰液涂片及培养对于早期抗生素治疗具有重要的价值[28]。但痰液培养结果受到许多因素的影响，培养结果无法准确判断是否为致病菌。传统真菌培养敏感度较低且周期长，阳性率低。与细菌培养结果相似，培养结果不能区分定植和感染，培养阴性也无法排除真菌感染，仍需与血清检测结果相结合判断。因此在临床中应尽可能提升痰液标本的合格率，与辅助检查结果相结合分析，提高诊断的准确性[29]。

4.1.2. 纤维支气管镜下肺泡灌洗液检查

纤维支气管镜是一种通过气管和支气管进行直接观察的仪器。它由一根细长的柔性管(纤维支气管镜)和光源组成，可以在纤维支气管镜的帮助下直接观察到气道和肺部情况，并根据病变情况进行进一步检查和治疗[30]。纤维支气管镜可以进行镜下肺部灌洗，针对脓性感染部位进行采样，以获取较为准确的病原学标本。研究表明，使用纤维支气管镜进行肺泡灌洗可以诊断呼吸道感染，具备高标本合格率、高准确率和低误诊率等优势[31]。Sircar [32]等研究显示，将支气管镜下的肺泡灌洗液(BALF)与mPCR结合使用，可以提高病原体感染的检出率。叶寅杰[33]等通过RT-CRP检测肺泡灌洗液中的白细胞吞噬的细菌种类，并与痰培养结果进行对比，可以更准确地进行病原学诊断。这种方法有助于早期实施针对性的抗感染治疗，从而缩短经验性抗感染治疗的时间，并降低抗生素耐药的发生率。

4.2. 抗原抗体检测技术

抗原抗体检测是一种重要的免疫学检测方法，广泛应用于疾病诊断、疫苗效果评估和免疫监测等领域，抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、快速试纸检测及免疫荧光检测等，ELISA能够定量检测血清中抗体的浓度。例如ELISA可以对SARS-CoV-2蛋白进行抗体检测，具有较高的灵敏性及特异性[34]。杨文洪[35]等人通过免疫荧光法检测80例上呼吸道感染的患儿，结果表明免疫荧光检测具有明显检出率高、灵敏度高等优势。抗原检测常用方法包括：免疫层析法及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，通过抗原检测的手段可以检测出临床标本中的抗原，这些方法在呼吸道病毒的检测中，作为早期快速诊断的初筛工具，具备快速和高特异度的优势[36] [37]。抗原抗体检测能够准确识别特定病原体及免疫反应，能够较快获得检测结果，但也存在假阳性或假阴性结果等缺点，需要临床医师的综合判断。

4.3. 分子生物学检测技术

分子生物学检测技术是指利用分子生物学方法识别、检测和定量微生物(包括病毒、细菌、真菌)的方法。是分子及核酸层面的检验，这一进步使得病原体的核酸序列具有特异性，可以有效识别其独特的基因片段。聚合酶链反应(PCR)技术以其快速和准确的特性，能够有效检测特定病原体。然而，在面对未知病原体的检测时，PCR技术仍存在一定的局限性，限制了其在某些临床应用中的效果。为了克服这些不足，mNGS (宏基因组测序)作为一种创新的核酸检测技术应运而生。mNGS通过提取样本中所有微生物的核酸，并构建宏基因文库，从而分析整个病原菌的基因组。这一过程使得检测人员能够精确确定病原体的类型。mNGS不仅具备高灵敏度，还能够进行全面的混合感染检测，显著提升了病原微生物的检测能力，为临床提供了更为准确和全面的诊断工具。现正逐渐应用于临床诊疗。

4.3.1. 宏基因二代测序技术(mNGS)

宏基因二代测序(Metagenomic next-generation sequencing, mNGS)又称高通量并行测序，它能够对环境或生物样本中所有微生物的基因组进行全面分析。通过提取样本中的核酸并进行高通量测序。mNGS能够同时进行众多序列的测定，此外，mNGS只需提取少量DNA即可同步检测和鉴定病原体及其耐药基因[38]。mNGS因其广泛覆盖、高阳性率、高通量和低成本等优点，正在逐渐应用于临床感染性疾病的病原体诊断中。研究人员探讨了肺泡灌洗液在肺部感染患者诊断中的价值，发现mNGS能够清晰地显示呼吸道微生物的分布，在描述多种微生物生态系统方面，优于传统培养方法[39]，在未来病原体的检测和抗生素应用等方面具有至关重要的作用[40]。

4.3.2. 聚合酶链式反应技术(PCR)

PCR(聚合酶链反应)是一种体外分子生物学技术，旨在选择性地扩增特定的DNA片段。通过这一技术，它能够在实验室条件下快速获取大量的特定DNA序列，PCR的基本原理与DNA的自然复制过程相似。自然界中的DNA复制依赖于细胞内的酶系统，而PCR则在体外利用专门的酶(如DNA聚合酶)进行有目的的DNA扩增。此过程涉及对DNA结构的加热、冷却和引物的特异性结合，以确保所需片段的选择性扩增。在通过变性、退火、延伸后，可以实现特定基因或DNA序列的大量复制[41]。近年来，PCR技术发展迅速，广泛应用于临床病原体检测，显示出比免疫学方法更高的灵敏度和特异性，能够识别一些无法培养的病原体。其优势包括高灵敏性、快速检测、强特异性和良好的重复性，使其在临床中得到了广泛应用。PCR技术对实验室的环境和设备要求较为严格。进行PCR实验需要配备专用的仪器，如热循环仪、精密的温控系统以及合适的试剂和引物。且PCR技术通常设计为针对特定的病原体进行检测。这意味着每个PCR实验的引物和反应条件是特定于目标DNA序列的。因此，在一次PCR实验中，通常只能针对一种病原体进行检测，无法同时识别多种病原体。这一特点限制了PCR在多重病原体检测中的应用。普通医院可能缺乏进行PCR所需的设备和技术支持，且高昂的检测成本和复杂的操作流程也使得其普及受到挑战。因此，尽管PCR是一种高灵敏度和特异性的检测方法，但在临床常规检测中，尤其是在资源有限的医疗环境中，其应用仍然受到制约。

多重PCR技术(mPCR)在病原体的检测中展现了独特的优势，它能够在一次反应中同时识别多种病毒或同一病毒的不同亚型。这一技术的优势在于其能够高效地扩增多个核酸片段，克服了常规PCR中每对引物仅能针对一个特定片段进行扩增的局限性。然而，在多种病原体的检测中，随着检测重数的增加，这可能导致引物之间相互作用的可能性上升，形成二聚体或多聚体。这种情况的轻微影响可能导致非特异性扩增的出现，进而降低检测的灵敏度和特异性，从而产生假阳性或假阴性结果。这些假结果将直接影响检测的准确性，进而影响临床决策和患者的治疗。因此，在检测多种病原体方面，mPCR仍显示出一定的不足[42]。此外，mPCR不受之前抗生素使用的影响，这意味着即使患者曾接受抗生素治疗，检测结果依然可靠。因此，mPCR为实现对多种病原体的准确诊断提供了重要的支持。WAGNER等[43]研究发现，mPCR在多种病原体检测中具有高灵敏性和特异度。

数字聚合酶链式反应(Digital polymerase chain reaction, dPCR)是基于单分子扩增和反应体系分割的一种核酸分子绝对定量分析技术[44]。在肿瘤，感染性疾病的应用中敏感性较高，具有其他技术无法比拟的优势。dPCR作为新兴的痕量核酸分子技术，具有灵敏度高、耐受性强、可绝对定量分析等优点，在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、BK病毒、定量检测中广泛应用。Abram [45]等研究也表明dPCR方法在靶向检测革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的抗生素耐药基因方面具有巨大应用潜力。

4.3.3. 微生物学快速现场评价

微生物学快速现场评价(M-ROSE)是一种新兴的微生物检测技术，旨在快速、准确地识别临床样本中的病原体，尤其在急性和重症感染的情况下具有重要应用价值。M-ROSE具有快速性的特点，可以缩短传统涂片及培养所需要的时间，仅需数小时即可得出检验结果[46]。M-ROSE通过提取临床样本中的DNA或RNA，使用聚合酶链反应(PCR)、实时荧光定量PCR (qPCR)或其他分子生物学技术，快速扩增并检测特定病原体的基因序列。杨幸乐[47]等人的研究表明，依据M-ROSE检测结果选择抗菌方案的重症肺炎患者可快速有效地改善症状，缩短ICU住院时长。M-ROSE在重症医学、感染性疾病、外科感染等领域有着广泛的应用前景，能够显著提升临床微生物学检测的效率和准确性，是未来微生物检测技术的发展趋势之一。随着技术的不断进步和设备的普及，M-ROSE有望成为常规临床诊断的一部分。

5. 小结

综上所述，重症监护病房(ICU)中的肺炎患者常常遭受多种病原菌的混合感染，这种情况不仅导致诊断过程变得复杂，还显著提高了患者的病死率。这类感染可能由多种病原体引起，包括细菌、病毒和真菌等，近年来，病毒性重症肺炎的病例数量也有了显著增加。随着检测技术的不断进步，各种检测方法在临床应用中展现出各自的优势和局限性。精准的诊断技术可以有效提高病原体的阳性检出率，从而帮助医生更快地进行治疗。传统检测方法在处理疑难或危重感染时，其灵敏度较低，可能导致假阴性结果，这使得它们在某些情况下无法准确反映患者的真实感染状态。尽管如此，传统检测方法仍然是临床实验室中不可或缺的一部分，发挥着重要作用。此外，分子生物学诊断技术虽然具有高灵敏性和强特异性，能够准确检测病原体，但其复杂性、对结果解释的专业知识要求以及较高的成本使得广泛应用面临挑战。因此，选择适合特定临床情况的方法，可以显著提高病原体的检出率。有效的病原体识别能够帮助医生快速制定合适的治疗方案，优化患者的临床预后。对于重症肺炎患者至关重要。

基金项目

黑龙江省卫生健康委科研课题(课题项目编号：20231717010214)；黑龙江省省属高等学校基本科研项目(项目编号：2023-KYYWFMY-0037)。

NOTES

^*通讯作者。