摘要: 目的：基于网络药理学分析探讨胃糜舒治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型的相关作用机制，为后续实验提供参考。方法：通过中药系统药理数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)和Herb (http://herb.ac.cn/)进行药物的活性成分的筛选，根据药代动力学特征ADME，将化合物SMLIE号导入SwissTargetPrediction数据库筛选药物的作用靶点。通过GeneCards、OMIM数据库，得到目标靶点基因，利用String平台进行蛋白质相互作用分析，构建PPI网络互作图。采用DAVID数据库平台分析“药物–成分–靶点”及其参与的生物过程及通路。结果：胃糜舒的核心活性成分为豆甾醇、异鼠李素、山萘酚、槲皮素、
β-谷甾醇，主要作用于IL-17信号通路、TNF信号通路、p53信号通路、NF-
κB信号通路和JAK/STAT信号通路。结论：本研究对胃糜舒治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型的作用机制进行了初步网络验证，为后续实验研究提供参考。
Abstract: Objective: This paper aims to investigate the mechanism of action of Weimishu in the treatment of chronic atrophic gastritis with hepatogastric disharmony based on network pharmacological analysis, so as to provide reference for follow-up experiments. Methods: The active ingredients of the drugs were screened through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) and Herb (http://herb.ac.cn/), and the compounds SMLIE were selected according to the pharmacokinetic characteristics of ADME The target of action of the drug was screened into the SwissTargetPrediction database. Through the GeneCards and OMIM databases, the target genes were obtained, and the String platform was used for protein-protein interaction analysis to construct the PPI network interaction map. The DAVID database platform was used to analyze the “drug-component-target” and the biological processes and pathways involved in it. Results: The core active components of Gastric Misot were stigmasterol, isorhamnetin, kaemphanol, quercetin and β-sitosterol, which mainly acted on IL-17 signaling pathway, TNF signaling pathway, p53 signaling pathway, NF-κB signaling pathway and JAK/STAT signaling pathway. Conclusion: This study preliminarily validated the mechanism of action of chylosol in the treatment of chronic atrophic gastritis with hepatogastric disharmony, and provided a reference for follow-up experimental research.
1. 引言
慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis, CAG)是一种多致病因素疾病，以胃粘膜上皮与腺体数目减少、萎缩，粘膜基层增厚等为主要病理特征，部分患者伴有幽门腺化生、肠腺化生、不典型增生等，被认为是一种癌前病变，病情较长，迁延难愈，且易受外界因素影响而反复发作，临床治疗较为棘手[1] [2]。目前治疗CAG多采用清除幽门螺杆菌、补充维生素、保护胃粘膜、抑酸及促胃动力等方法[3]。有许多研究显示中医药治疗慢性萎缩性胃炎具有明显的疗效[4] [5]，但整体研究证据质量较低。胃糜舒是青海名中医李军茹主任医师经长期临床实践拟定的治疗肝胃不和型慢性萎缩性胃炎的经验方，已在临床应用20余年。该方由柴胡、炒枳壳、白芷、白芨、三七粉、制乳香、制没药、煅瓦楞子、黄芪、红景天、麝香、槟榔、败酱草十三味中药组成，具有疏肝理气、健脾和胃、活血止痛之功效。经前期临床研究表明，胃糜舒治疗肝胃不和型慢性萎缩性胃炎总有效率达96.67%，明显高于西药对照组(80.77%)，且该药可以明显改善萎缩性胃炎伴或不伴肠化生患者的临床症状，减轻患者胃镜下胃粘膜萎缩或肠化生[6]。但该药治疗肝胃不和型慢性萎缩性胃炎的作用机制尚不明确。因此，本研究首先基于网络药理学，对胃糜舒治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型的作用机制进行初步的网络验证，为下一步实验提供参考。
2. 资料与方法
2.1. 收集药物中的活性成分及其潜在靶点
运用中药系统药理数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)和Herb (http://herb.ac.cn/)进行药物的活性成分的筛选。分别以“柴胡、炒枳壳、白芷、白芨、三七粉、制乳香、制没药、煅瓦楞子、黄芪、红景天、麝香、槟榔、败酱草”检索词，获取SMLIE号，导入SwissADME，根据药代动力学特征ADME (吸收、分配、代谢和排泄)，设定筛选条件：GI absorption选high、Lipinski、Ghose、veber、Ean、Megge中至少3个yes，OB ≥ 30，DL ≥ 0.18。筛选后，将化合物SMLIE号导入SwissTargetPrediction数据库药物目标靶点转换为官方基因符号，获取单个基因名称，筛选药物的作用靶点。
2.2. 药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成靶点的相关基因筛选
通过GeneCards、OMIM数据库，以“Chronic atrophic gastritis, CAG”作为关键词检索，获取所有慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成疾病靶点基因。使用Venny软件，将药物作用靶点基因与慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成的相关基因取交集，即得到药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成的目标靶点基因。
2.3. 蛋白互作网络构建及核心靶点基因的筛选
将药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成的目标靶点基因导入 String 数据库，设置以下参数：物种为“Homosapiens (人类)”，最低作用分数 > 0.4，并且隐藏所有孤立蛋白节点，即得到药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型形成的蛋白互作网(Protein-Protein Interaction Network, PPI)。随后将数据以TSV格式导出并导入Cytoscape 3.9.1，利用Cytoscape 3.9.1软件中的Network Analyzer工具计算网络的拓扑学性质，随后使用cytoNCA插件计算节点的拓扑参数：介值中心度(Betweenness Centrality, BC)贴近度中心度(Closeness Centrality, CC)、度中心度(Degree Centrality, DC)、特征向量中心度(Eigenvector Centrality, EC)、网络中心度(Network Centrality, NC)和局部平均连通度(Local Average Connectivity, LAC)，参数值越高，代表网络中的节点越重要，最后获取网络中的核心靶点基因。
2.4. 药物–成分–靶点–疾病互作网络的构建
将药物–有效活性成分–靶点基因–疾病形成数据导入Cytoscape 3.9.1软件，利用Cytoscape软件中的Network Analyzer工具计算网络的拓扑学性质，经调整得到“药物–有效活性成分–靶点基因–疾病形成”网络调控关系图。
2.5. GO和KEGG富集分析
将药物与慢性萎缩性胃炎肝胃不和型的相关靶点使用David分别进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，GO富集分析以Pvalue为筛选条件，选取结果中P值的前10个生物学条目绘制条形图。KEGG富集分析同样以Pvalue为显著富集筛选条件，选取前20条信号通路绘制气泡图进行可视化分析。
3. 结果与分析
3.1. 药物活性成分的筛选
通过数据库检索药物的化学成分，经过筛选后，有效成分前5位，分别见表1。
Table 1. Composition of compounds
表1. 化合物成分
序号 |
代号 |
成分 |
归属药材 |
1 |
A1 |
Stigmasterol |
柴胡、白芷、三七粉、制没药、败酱草 |
2 |
B1 |
isorhamnetin |
黄芪、黄芪 |
3 |
C1 |
kaempferol |
黄芪、红景天、败酱草 |
4 |
D1 |
quercetin |
三七粉、制没药、黄芪、红景天、败酱草 |
5 |
E1 |
beta-sitosterol |
炒枳壳、白芷、三七粉、制没药、败酱草 |
3.2. 韦恩图
根据Genscards、OMIM筛选条件，搜索得到1025个与慢性萎缩性胃炎肝胃不和型相关的基因。将药物与疾病靶点合并取交集，得到139个药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型靶点，绘制韦恩图，见图1。
Figure 1. Venn diagram of drug and chronic atrophic gastritis hepatogastric discord target
图1. 药物与慢性萎缩性胃炎肝胃不和型靶点韦恩图
3.3. “成分–主要靶点–疾病”网络
将上述药物主要靶点及疾病导入Cytoscape 3.9.0中进行可视化处理，构建“成分–靶点–疾病”网络图，如图所示。对该网络进行分析可知，该网络图中共有293个节点和1141条边。其中同一活性成分可能对应不同靶点，不同活性成分也可能对应同一靶点，这表明药物是通过多成分多靶点作用于疾病。其中度值(Degree)排名前五的节点所对应的化学成分分别为D1\CH29\CH24\SX2\CH18这5种成分作用靶点数量较多，表明它们可能是药物中主要药理活性成分，见图2及表2。
Figure 2. Component-target-disease network diagram
图2. “成分–靶点–疾病”网络图
Table 2. Core ingredients
表2. 核心成分
序号 |
化合物 |
Degree值 |
1 |
D1 |
34 |
2 |
CH29 |
33 |
3 |
CH24 |
31 |
4 |
SX2 |
28 |
5 |
CH18 |
26 |
6 |
CH15 |
25 |
7 |
C1 |
25 |
8 |
CH20 |
22 |
9 |
CZK4 |
19 |
10 |
CH27 |
19 |
3.4. PPI网络图构建及关键靶点筛选
将139个交集靶点导入String数据库进行分析，得到PPI蛋白互作图，如图。该网络中包含138个节点，2798条边。其中度值排名前五的节点为TNF\IL6\TP53\AKT1\IL1B表明这些节点在PPI网络中处于核心位置，节点联系较为紧密。上述5个基因靶点可能为药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型的核心靶点，药物发挥药效的机制可能与这5个基因的表达相关，见图3及表3。
Figure 3. PPI network diagram
图3. PPI网络图
Table 3. Key targets
表3. 关键靶点
序号 |
靶点 |
Degree值 |
1 |
TNF |
108 |
2 |
IL6 |
107 |
3 |
TP53 |
103 |
4 |
AKT1 |
102 |
5 |
IL1B |
98 |
6 |
BCL2 |
97 |
7 |
CASP3 |
96 |
8 |
MMP9 |
94 |
9 |
JUN |
94 |
10 |
IFNG |
93 |
3.5. 对药物治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型交集靶点的GO分析结果
利用DAVID数据库对作用靶点进行富集分析，得到以上GO富集图，纵坐标代表GO的各个条目，横坐标代表富集到与该条目的靶点数目。BP主要涉及凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、蛋白质磷酸化的正调控、内皮细胞增殖的正调控等；MF主要包括酶结合、受体结合、蛋白酶结合等；CC主要包含线粒体、蛋白质复合物、细胞内膜结合的细胞器等。对图进行分析可知，共得到979条GO富集条目，其中属于生物学过程(Biological Process, BP)的781条，属于细胞组成成分(Cellular Component, CC)的75条，属于分子功能(Molecular Function, MF) 123条。GO富集分析(BP、CC、MF各取前10进行可视化)，见图4。
Figure 4. GO enrichment analysis
图4. GO富集分析
3.6. KEGG代谢通路富集分析
对靶点进行KEGG通路富集分析，纵坐标为不同KEGG通路，气泡大小为基因个数，横坐标为fold enrichment，颜色深浅同样为-lg(P)，一共富集得到166条信号通路，按照p-Value值对富集通路进行了排序，对20条通路绘制气泡图进行可视化分析，如图5所示。
Figure 5. Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway
图5. KEGG代谢通路富集分析
4. 讨论
胃糜舒是青海名中医李军茹主任医师经长期临床实践拟定的治疗肝胃不和型慢性萎缩性胃炎的经验方，已在临床应用20余年。该方由柴胡、炒枳壳、白芷、白芨、三七粉、制乳香、制没药、煅瓦楞子、黄芪、红景天、麝香、槟榔、败酱草十三味中药组成，具有疏肝理气、健脾和胃、活血止痛之功效。
在药物活性成分方面，在组成胃糜舒的组成中药中，各自交集的活性成分豆甾醇、异鼠李素、山萘酚、槲皮素、β-谷甾醇等在胃糜舒众多有效成分中占据重要地位，可能是在治疗慢性萎缩性胃炎肝胃不和型疾病中的主要成分，将作为日后关注的重点。
通过网络药理学我们对胃糜舒的作用机理有了初步的认识，KEGG富集结果中表明IL-17、TNF、p53等多数信号通路与炎症的发生发展以及治疗密切相关，进一步验证了慢性萎缩性胃炎是一个非常复杂的炎症过程，涉及多分子、多通路。NF-κB和JAK/STAT信号通路虽然排名略微靠后，但其通路相关因子对炎症、免疫反应、细胞分化、增殖和存活相关基因的调节至关重要[7]。
根据信号级联的组成部分，NF-κB信号通路可分为经典和非经典通路，分别由p50/RelA和p52/RelB的转录蛋白复合物代表[8]。经典的NF-κB通路被各种细胞外信号激活，例如促炎信号，被激活后NF-κB从细胞质中释放出来，发生核转位，启动靶基因的表达[9]。非经典NF-κB信号通路由TNF家族成员触发。NF-κB的激活是导致炎症的中心事件，NF-κB活化后可诱导TNF-α和IL-1β等炎症因子的转录，促进iNOS、COX-2等促炎介质的表达，从而进一步放大炎症信号[10]。此外，他还负责转录抗凋亡因子和血管内皮生长因子(VEGF)等细胞粘附因子[11]。尽管经典和非经典途径具有不同的触发信号和下游靶标，但这两种途径都参与了多种炎症性疾病甚至癌症的发病机制和疾病进程。
NF-κB信号通路是“炎–癌转化”的关键节点，控制了炎症与肿瘤信号通路的中心[12]。研究发现，中医药可通过调节炎症反应发挥抗癌作用，有效阻断“炎–癌转化”[13]。目前中药调控NF-κB信号通路主要通过以下几个方面发挥作用：一是在直接降低NF-κB信号通路的表达，减少炎症因子和促炎介质的释放，改善炎症微环境来缓解炎症反应；二是通过调控NF-κB上游通路来抑制NF-κB信号通路的活性，进而修复炎症、氧化应激、肿瘤微环境等引起的组织损伤；三是通过抑制NF-κB信号通路来调控其下游靶标，发挥诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖、侵袭、血管形成以及提高放化疗敏感性等的作用，展现出巨大的抗炎、抗癌潜力；四是通过抑制NF-κB信号通路并提高紧密连接蛋白的活性，从而修复黏膜屏障功能，显示出对粘膜的保护作用[14]。
JAK/STAT级联反应作为细胞因子和生长因子主要的信号转导通路，它调节各种细胞增殖、分化、迁移和存活等的细胞过程，可促进多种炎症性和肿瘤性疾病的发生发展。JAK/STAT通路的异常激活与胃癌的发生发展有关[15]。其机制如下：上游因子激活JAK酶族后刺激STAT3磷酸化形成P-STAT3诱导基因表达，抑制胃黏膜细胞凋亡。研究发现酪氨酸磷酸化STAT3 (p-STAT3)在萎缩、肠化生、异型增生的表达均高于正常胃黏膜的表达，提示酪氨酸磷酸化STAT3上调可能在肠型胃癌的发生中起重要作用。基于以上理论，推测该通路的激活可能在CAG发生发展中起重要作用，抑制该通路可能阻止CAG向胃癌发展[16]。抑制STAT3可致抗凋亡蛋白Survivin水平显著下降，从而降低胃癌细胞的存活[17]。STAT3激活胃粘膜上皮细胞TLR2导致异常增生和凋亡[18]。且NF-κB和JAK/STAT信号通路之间存在交互作用。转录因子NF-κB和STAT3被细胞因子激活后分别或联合调节参与细胞凋亡、增殖和其他细胞进程的基因转录。在胃癌中NF-κB和STAT3作为癌基因增强肿瘤细胞的转移能力，参与胃癌的发生发展。因此，我们选择上述两条通路作为未来研究的重点，并准备后续相关实验。
NOTES
*通讯作者。