1. 引言
近年来，研究证实肠道微生物在精神分裂症的发病中扮演重要角色[1]。大量的研究表明精神分裂症患者肠道菌群的特征与健康人群的肠道菌群存在差异。目前已检测出人体肠道菌群由几十个门组成，其中厚壁菌门和拟杆菌门约占总量的90% [2]。有研究发现链球菌属、乳杆菌属水平与精神症状及症状的严重程度有关[3]，拟杆菌属丰度与简明精神量表得分及患者的抑郁症状呈正相关[4]，然而，目前的研究尚未阐明与精神分裂症阳性症状有关的肠道菌群特征。因此，本研究首先利用16SrDNA扩增子基因测序技术，通过以阳性症状为主的精神分裂症患者与健康人群之间的组间比较，获得精神分裂症阳性症状相关特异性肠道微生物菌种，并分析特异肠道微生物与精神分裂症阳性症状的关联，为今后精神分裂症发病机制的研究提供重要参考。
2. 对象与方法
2.1. 研究对象
本研究为病例对照研究。收集2022年5月至2023年2月在西安市精神卫生中心就诊符合入排标准的精神分裂症患者共20例作为研究组，同时通过网络宣传在社区招募符合入排标准的健康人群21名作为健康对照组。
(1) 研究组
纳入标准：a、符合ICD-10精神分裂症诊断标准；b、年龄在18~55岁；c、PANSS总分 > 70分，阳性症状分量表中任意3项评分 > 4分；d、近期连续1月以上未使用精神类药物；e、陕西居住 > 3年，每年居住的时间 > 10月；f、饮食晕素搭配，无特殊饮食习惯。g、体重指数满足17.5~30.0 kg/m2；h、近期无跨境旅游史；i、签署知情同意书。排除标准：a、患有自身免疫性疾病、胃肠疾病、糖尿病；b、患有其他精神疾病；c、孕妇、哺乳期妇女；d、近1个月内曾使用抗生素、益生菌或益生元；e、近1个月有明显腹泻或便秘。f、过去6个月内存在酒精或物质依赖/滥用；g、既往有自杀史或有严重自杀倾向或行为的患者；h、过去1年内任何原因导致的失去意识超过1小时；i、筛选前30天服用过其他试验用药品；j、可能会影响疗效判断的医学状况；k、躯体疾病症状恶化，导致需要住院或加强关护的患者；l、实验室检查结果异常且有临床意义；m、研究者认为不适合参加本研究。
(2) 健康对照组
纳入标准：a、无ICD-10中任意精神疾病诊断；b、年龄在18~55岁；c、陕西居住时间 > 3年，每年居住时间 > 10月；d、饮食晕素搭配，无特殊饮食习惯。e、体重指数满足17.5~30.0 kg/m2；f、无精神疾病史及家族史；g、签署书面知情同意书。排除标准：同研究组排除标准。
2.2. 精神症状评估
采用PANSS量表对精神症状进行评估，PANSS量表包括阳性症状分量表、阴性症状分量表和一般精神病理症状分量表。本研究要求PANSS总分 > 70分，阳性症状分量表中任意3项评分 > 4分。在评分前进行标准化培训，要求由至少工作两年的精神科医师进行评定，以尽量保证结果的一致性。
2.3. 粪便样本收集和16S rRNA测序
2.3.1. 粪便样本采集
对研究人员进行采集过程严格无菌操作培训。使用一次性粪便收集器，在无菌巾铺垫的容器中采集新鲜、中后段、内部粪便标本3 ml，采样后立即盖上盖子旋紧并迅速(不超过1小时)放置于−80℃冰箱保存待测。标本应避免混入尿液、水等其他物质。保存期间忌反复冻融，运检时使用足量干冰保持低温。
2.3.2. 样品DNA提取和测序分析
准备1.5 ml离心管、QlAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒、金属浴恒温器、震荡仪、离心机及无水乙醇等物品。按照QlAamp Fast DNA Stool Mini Kit说明书标准提取总DNA，最后将提取的DNA样本迅速放置−80℃冰箱保存待检。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA并稀释，选取V3、V4区进行PCR扩增。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测、纯化和回收。用TruSeq® DNAPCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库，再经Qubit和Q-PCR定量检测，最后使用NovaSeq6000进行上机测序。
2.4. 生物信息数据处理
(1) 测序数据处理
寻找Barcode序列和PCR扩增引物序列的位置，依据这些位置作为端点将下机数据拆出各样本的数据，除去Barcode和引物的部分，在使用FLASHv1.2.7对每个样本的reads进行拼接，得到原始的Tags数据；用fastp软件进行过滤，利用Vserch软件与Silva数据库进行比对，去除嵌合体，得到有效数据。
(2) OTU聚类和物种注释
利用Uparse算法以97%的一致性对有效数据进行OTUs聚类，选取有代表性序列，用Mothur方法与Silva138数据库进行物种注释分析。
(3) 样本复杂度分析(Alpha-Diversity)
α-多样性指物种丰度和多样性。Chao1用于描述物种的丰度。Shannon和 Simpson指数反映物种的多样性。本研究使用Qiime2软件计算Chao1，Shannon，Simpson，Observed-otus指数。
(4) 生境间多样性分析(Betabio-Diversity)
β-多样性通过非加权算法计算样品间距离反映群落组成变化的程度。本研究基于QIIME软件非度量多维标定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS)，通过样本的分布分析组间菌群的相似性。
(5) 组间差异显著性分析
通过LEfSe软件采用线性判别(LDA)分析差异具有统计学意义的菌类。LDAscore > 4.0显著差异菌类。
2.5. 统计学处理
采用SPSS 26.0统计学软件进行分析。由于两组受试者一般信息的计量资料成正态分布且方差齐(p > 0.05)，因此两组受试者一般资料的比较采用两独立样本t检验和χ2检验；由于两组受试者肠道菌群α-多样性和丰度均呈偏态分布(p < 0.05)，因此采用中位数(四分位数) [M(P25, P75)]描述，采用Mann-Whitney U检验，用Spearman分析研究组肠道菌群与阳性症状严重程度的相关性。
3. 结果
3.1. 社会人口学特征
研究组共入组20例，对照组共入组21例。使用两独立样本t检验以及χ2检验对两组受试者的年龄、受教育年限、婚姻状况、居住地和性别进行比较，发现两组间均无明显的统计学意义(p > 0.05) (见表1)。
Table 1. Comparison of the general demographic data of the two groups
表1. 两组受试者一般人口学资料比较
指标 |
研究组(n = 20) |
对照组(n = 21) |
t/χ2 |
p |
年龄(岁，±s) |
34.25 ± 11.14 |
34.90 ± 8.37 |
−0.213 |
0.832 |
受教育年限(年，±s) |
13.10 ± 1.92 |
13.57 ± 4.01 |
−0.484 |
0.632 |
性别 |
|
|
0.034 |
0.853 |
男 |
8 (40%) |
9 (42.86%) |
|
|
女 |
12 (60%) |
12 (57.14%) |
|
|
婚姻状态 |
|
|
−0.978 |
0.334 |
已婚 |
7 (35%) |
10 (47.61%) |
|
|
未婚 |
11 (55%) |
8 (38.10%) |
|
|
离异 |
2 (10%) |
3 (14.29%) |
|
|
丧偶 |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
|
居住地 |
|
|
−0.462 |
0.647 |
城镇 |
9 (45%) |
10 (47.62%) |
|
|
农村 |
11 (55%) |
11 (52.38%) |
|
|
3.2. 研究组和对照组肠道微生物特征比较
3.2.1. 两组受试者肠道微生物α-多样性比较
采用Mann-Whitney U检验对两组受试者肠道微生物α-多样性进行比较。结果显示：两组间Chao1 (p = 0.251)，Observed feature (p = 0.375)，Shannon (p = 0.348 )与Simpson (p = 0.794)指数组间均没有统计学差异(见表2)。
Table 2. Comparison of the diversity α intestinal microbiota between the two groups
表2. 研究组与对照组肠道菌群α多样性比较
指数 |
研究组 |
对照组 |
z |
p |
Chao1 M (IQR) |
417.13 (303.16, 472.08) |
444.92 (330.57, 533.37) |
−1.148 |
0.251 |
Observed-feature M (IQR) |
410.10 (303.00, 466.75) |
427.10 (322.50, 507.50) |
−0.887 |
0.375 |
Shannon M (IQR) |
5.88 (5.11, 6.39) |
5.49 (4.69, 6.14) |
−0.939 |
0.348 |
Simpson M (IQR) |
0.93 (0.89, 0.97) |
0.91 (0.89, 0.97) |
−0.261 |
0.794 |
3.2.2. 两组受试者肠道微生物β-多样性分析
PCoA分析提取3个主成分，结果表明两组间菌群组成存在统计学差异(p < 0.05)，患者组肠道菌群聚类比对照组更紧密。见图1。
注：图中每一个点代表一个样本，点与点的距离说明样本相似性程度，圆圈为同一分组样本。图中的横纵轴标注的百分比即该主成分对样本OTU数据差异的贡献度。SZ1：研究组；NC：健康对照组。
Figure 1. β-diversity analysis of gut microbiota in schizophrenia patients and healthy controls of the study group
图1. 研究组精神分裂症患者与健康对照肠道菌群的β-多样性分析
3.2.3. 两组受试者肠道微生物物种组成丰度分析
LefSe分析显示，患者组和对照组之间21个特征菌属的丰度有差异(LDA值 > 2)。研究组肠道菌群中有1个门富集，为疣微菌门；1个纲富集，疣微菌纲；1个目富集，疣微菌目；3个科富集，分别为阿克曼菌科、莫拉氏菌科、颤螺旋菌科；2个属富集，嗜冷菌属、阿克曼菌属；2个种富集，脆弱拟杆菌、多氏拟杆菌。对照组肠道菌群中有2个目富集，梭杆菌目、泰氏菌目；4个科富集，梭杆菌科；假单胞菌科、瘤胃球菌科、消化链球菌科。见图2。
注：条块长度代表肠道菌群差异物种的贡献度大小(即为LDA值)，图中展示了LDA值 > 2的条件下两组间丰度有统计学差异的肠道菌群。SZ：研究组；NC：健康对照组。
Figure 2. Analysis of the abundance of intestinal microbial species composition in the two groups
图2. 两组受试者肠道微生物物种组成丰度分析
3.3. 研究组特异性肠道菌群丰度水平与阳性症状的相关性
用Spearman相关进行研究组特异肠道微生物丰度水平(研究组和对照组之间有差异的21个特征菌属)与PANSS量表阳性因子得分之间的相关性分析。结果显示：嗜冷菌属(r = −0.492, p = 0.027)与PANSS阳性因子得分呈正相关，梭杆菌目(r = −0.514, p = 0.02)和梭杆菌科(r = −0.499, p = 0.025)与PANSS阳性因子得分呈负相关，其他菌群水平与阳性症状评分无统计学相关性(p > 0.05)。
4. 讨论
本研究以阳性症状为主的精神分裂症患者为研究对象，分析患者与健康对照肠道菌群多样性和菌群构成特征的差异，并探索特异肠道微生物与精神分裂症阳性症状的关联。结果发现：在α-多样性上，Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数在研究组组和对照组之间没有统计学差异；在β-多样性上，患者组与对照组肠道菌群存在显著差异。本研究有关α-多样性的结果与大多数研究相同。但是，也有少数研究得出了不同的结果，如Zhang等[5]的研究发现患者组和对照组在α-多样性中Chao1和Shannon指数有统计学差异。本研究有关β-多样性的结果也支持了LI等[6]的结论，即患者组与对照组之间β-多样性存在显著性差异。
研究组肠道菌群富集疣微菌门、疣微菌纲、疣微菌目、阿克曼菌科、阿克曼菌属。越来越多的研究[7]表明阿克曼菌属通过恢复肠道菌群、重建肠道粘膜屏障的完整性、调节宿主免疫、调节肠道和神经炎症等方式，有效改善神经精神疾病的症状。这与既往研究结果不一致，结合阿克曼菌属的作用，猜想这种改变或许与精神分裂症患者的病程，抗精神病药的作用或肠道菌群紊乱的代偿作用有关，但仍需进一步研究。此外，本研究还发现患者组肠道菌群富集拟杆菌门中的脆弱拟杆菌、多氏拟杆菌。这与张言武等人[8]的研究结论一致，并且研究表明[9]拟杆菌在不同年龄、不同饮食习惯的人群中的分布不同，脆弱拟杆菌通过影响CD4+ T细胞发育，调节T辅助细胞(Th1/Th2)的免疫平衡和产生短链脂肪酸维持稳态等方式对维持免疫系统稳态和预防细菌、病毒感染发挥重要作用。然而，当免疫系统受损、肠道屏障破坏、过度使用抗生素等情况下，细菌发生易位，拟杆菌便会充当致病菌引起炎症[10]。精神分裂症患者肠道菌群失调引起的低度炎症被认为是精神分裂症的诱发因素之一[11]，与临床症状也密切相关[3]。对照组肠道菌群中富集梭杆菌目、泰氏菌目、梭杆菌科、假单胞菌科、瘤胃球菌科、消化链球菌科。既往SHEN等[12]的研究发现健康人群肠道菌群富集所属梭菌目的毛螺菌科，与本研究结果不一致。本研究还发现研究组嗜冷菌属(r = −0.492, p = 0.027)与PANSS阳性因子得分呈正相关，梭杆菌目(r = −0.514, p = 0.02)和梭杆菌科(r = −0.499, p = 0.025)与PANSS阳性因子得分呈负相关。Nguyen [13]等人报道了精神分裂症患者肠道微生物区系中梭状芽胞杆菌丰度比健康人更低，该结果提示该菌的增加可能与更高的精神病性风险密切相关，但其具体机制需进一步研究。既往的发现[14]有发现瘤胃球菌科和毛螺菌科与患者阴性症状呈正相关，棒状杆菌属与阴性症状呈负相关。另有研究[15]却发现阿克曼氏菌属、拟杆菌属、韦荣氏球菌属、共生梭菌属、西拉氏真杆菌属、坂崎克罗诺杆菌属、前庭链球菌属、嗜碱菌属、粪肠球菌属、长双歧杆菌属、青春双歧杆菌属与患者精神病性症状和认知症状的严重程度呈正相关，该研究并未区分与精神病性症状和认知症状相关的菌群。SCHWARZ等[4]发现毛螺菌属与精神分裂症症状严重程度呈负相关，但并未区分阴性症状和阳性症状。
从以上研究可以看出，本研究与既往的研究有一致，也有不同。可能因为既往的研究纳入的对象为精神分裂症患者，并没有区分患者以什么症状为主，也就是说并没有将以阳性症状为主的分裂症患者作为研究对象，研究对象不够同质，并且既往研究主要聚焦在精神分裂症的阴性症状和认知症状和肠道菌群的关系上，几乎没有聚焦在以阳性症状为主的分裂症患者的文献，因此既往研究与本研究的结果有差异可以理解。
总之，本研究发现以阳性症状为主的精神分裂症患者肠道菌群特征与健康对照存在差异，推测嗜冷菌属、梭杆菌目和梭杆菌科可能在精神分裂症阳性症状中的发病中起到一定的作用。但本研究仍存在一定局限性，如样本量较小，这限制了探索肠道菌群差异及评估阳性症状和肠道菌群关系的统计学效能。未来研究需进一步增大样本量，明确肠道菌群改变和精神分裂症阳性症状发病的因果关系，为精神分裂症的早期干预、治疗提供新的理论依据。
基金项目
1. 陕西省重点研发计划项目(编号：S2022-YF-YBSF-1381)。
2. 西安市科技计划项目(编号：2021JH-04-0231)。
NOTES
*通讯作者。