探究一款后生元牙膏对口腔菌群的影响

Exploring the Impact of a Postbiotic Toothpaste on Oral Microbiota

摘要: 目的：探究一款后生元牙膏对健康人群口腔菌群的影响。方法：纳入30名口腔健康人群，在使用牙膏前(0 d)和使用30天后(30 d)分别采集唾液，测定PLI值和CAT值，并进行16S rDNA测序，分析两组菌群结构及多样性差异。结果：与使用前相比，使用牙膏后的PLI值和CAT值均显著降低(P < 0.0001)。使用牙膏前后口腔菌群的优势菌基本一致，但在相对丰度上存在差异。与使用前相比，使用牙膏后的Alpha多样性指数Ace和Chao均显著降低(P < 0.0001)。PCA分析结果显示，使用牙膏前后的口腔菌群组成差异主要由嗜二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)和孪生球菌属(Gemella)导致。结论：该款后生元牙膏能够有效减少牙菌斑，降低龋病风险，并能够调节口腔微生态。

Abstract: Objective: To investigate the effect of a postbiotic toothpaste on the oral microbiota of healthy people. Methods: A total of 30 oral health individuals were enrolled, and saliva was collected before (0 day) and 30 days after 30 days (30 days) of toothpaste, and PLI and CAT values were measured, and 16S rDNA sequencing was performed to analyze the differences in microbial community structure and diversity between the two groups. Results: Compared with the before use, the PLI value and CAT value were significantly reduced after using toothpaste (P < 0.0001). The dominant bacteria in the oral microbiota were basically the same before and after the use of toothpaste, but there were differences in relative abundance. Compared with the before use, the alpha diversity index Ace and Chao were significantly decreased after using toothpaste (P < 0.0001). The results of PCA analysis showed that the differences in oral microbiota composition before and after toothpaste use were mainly caused by Capnocytophaga and Gemella. Conclusion: This postbiotic toothpaste can effectively reduce dental plaque, reduce the risk of caries, and regulate the oral microecology.

1. 引言

口腔微生态系统是指定植于口腔的菌群及其与宿主之间相互作用的系统，包括牙齿表面、口腔黏膜、舌面以及其他口腔组织表面的微生物[1]。口腔菌群是口腔微生态系统的重要组成部分，包含至少600多种微生物，其中细菌占大多数[2]。健康人群的口腔菌群与人体保持动态平衡，但当口腔微生态失调时，口腔菌群中的变异链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)等菌属占数量优势[3]，容易引发龋齿[4]、牙周炎[5]、口腔癌[6]、心血管疾病[7]、糖尿病[8]、类风湿性关节炎[9]等各类全身疾病[10]。因此，维持口腔菌群平衡对人体健康至关重要，应着重关注口腔护理产品对维持口腔菌群平衡的功效。

目前，益生菌、后生元在口腔护理产品中均有应用[11]-[15]，并对龋齿、牙周炎等口腔疾病具有一定的改善功效[16]-[19]。后生元的作用机制与益生菌类似，主要通过以下几种方式维护口腔菌群平衡：调控口腔菌群的代谢途径或合成某些活性代谢物；抑制致龋微生物生物膜形成；实现竞争性粘附和定植，从而占据生态位优势；与病原体发生聚集作用，限制其活动；以及调节免疫系统反应，共同作用于口腔微生态，来维护口腔菌群平衡[20]。国际微生物学会联合会(IUMS)根据临床资料推测，口腔护理产品中使用活的益生菌依然存在一定的潜在风险[21]。后生元作为无活性的益生菌发酵产物，具有良好的酸碱和热稳定性，易于储存和使用，安全性高，应用前景广阔[22]-[24]。但口腔后生元护理产品的安全性和有效性数据有限，还有待进一步评估[20]。因此，本研究中我们通过人群实验，探讨了一款后生元牙膏对口腔菌群的影响，为后生元口腔护理产品的开发提供依据。

2. 材料和方法

2.1. 研究对象和纳排标准

纳入标准：年龄18~30岁，男女不限，对市售口腔产品或化妆品无过敏史，自愿参加本试验，能按时参加试验复查并能完成整个试验步骤(4周时间)，愿意填写知情同意书及提供个人病史，在试验期间不使用其他牙膏及漱口液等口腔护理产品，至少有20颗未做冠修复的天然恒牙(除第三磨牙)，最近3个月内没有使用过抗生素和专业牙科预防药物，牙齿健康，无龋洞，无疼痛感，牙龈颜色正常，用棉签划牙龈无出血现象。

排除标准：患有慢性病包括糖尿病、移植、艾滋病、心脏病和传染性疾病者，因其他慢性疾病，需要服用抗生素、激素、非甾体类抗炎药物、免疫抑制剂、免疫增强剂、细胞毒药物、细胞周期类药物、止痛药等对牙龈及口腔黏膜存在影响的药物或制剂，正在进行正畸治疗或戴有可摘式局部义齿，孕妇及哺乳期妇女，最近一个月参加了临床研究、进行了医疗或牙科手术、正在进行医疗或牙科治疗，可见龋齿或严重牙周病，吸烟者，对牙膏成分过敏者。

本研究获得天津科技大学伦理委员会批准(伦理编号：TUST2022-10-01)，所有志愿者均在取样和收集信息前签署书面知情同意书。

2.2. 实验设计

按照纳排标准纳入30名口腔健康志愿者。分别在第0天和第30天采集唾液样本，进行16S rDNA测序分析，并检测PLI值和CAT值。实验期间，受试者使用统一发放的实验牙膏及标准软毛牙刷。根据WS/T326-2010《牙膏功效评价》[25]要求，每天早晚2次刷牙，牙膏使用量为膏体长度1 cm，每次刷牙计时满2分钟，按照Bass刷牙法刷牙。

2.3. 实验材料

主要试剂：唾液取样器(美迪科生物医疗科技有限公司，中国)、菌斑指示剂片剂(TePe公司，美国)、CAT试剂盒(河北冈大生物科技有限公司，中国)。

主要材料：知情同意书、志愿者招募文件、评分记录表、一款后生元牙膏(由山东本真化妆品有限公司提供)：含20% Lactobacilli sp. BZ发酵提取物、磷酸二氢钙、甘油、水、纤维素、果胶、黄原胶、结冷胶、凝乳胶、琼脂、牙刷、无菌棉签、标签、冰盒。

2.4. 唾液样本的采集及16S rDNA测序分析

受试者需确保检测前14日内未使用抗生素，检测前2 h未进食，未漱口和刷牙。采集时，按照顺序领取唾液采集管，待采集到4 ml唾液样本后，贴好标签置于−20℃冰箱保存。

唾液送上海美吉生物医药科技有限公司，采用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行浓度和纯度检测，对口腔菌群16S rDNA的V3-V4区域进行测序，本研究采用的引物序列为：338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，对测序结果用Flash1.2.11 (https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)进行pair-end双端序列拼接，对连接上的序列通过index完全匹配得到每个样品的有效序列，进行过滤，将高质量的Clean data用于后期数据分析。

通过reads之间的重叠关系将其拼接成Tags，用Qiime1.9.1 (http://qiime.org/install/index.html)按97%的相似度将Tags聚类成操作分类单元(Operational taxonomic units, OTU)，然后用RDP Classifier2.13 (https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)将OTU序列与Greengenes和RDP数据库进行比对和物种注释。1) 应用Mothur1.30.2 (https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)中的summary，single命令进行alpha多样性分析，得到Chao、Ace、Shannon、Simpson指数；2) 用Mothur1.30.2 (https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)中的metastats命令进行物种组成分析，通过颜色梯度反映每组样品在门、属水平上物种组成的相似性和差异性；3) 用Qiime1.9.1 (http://qiime.org/install/index.html)计算Beta多样性距离矩阵，用R语言3.3.1进行PCA分析，其中一个点代表一个样品，颜色相同的点属于一个分组，两点之间的距离越近，说明两个样品的微生物群落组成差异越小。

2.5. 菌斑指数(plaque index, PLI)评分

受试者领取菌斑指示剂片剂，在口中嚼碎并用舌头涂满口腔中的各颗牙齿进行菌斑染色，实验者检查全口牙面，每颗牙检查2个牙面，即远中颊面和舌面。每个牙面取中间和侧边各三个部分的分值，每颗牙的记分为2个牙面记分之和除以6，个人记分为每颗牙记分之和除以受检牙数。

计分标准：0 = 龈缘区无菌斑；1 = 龈缘区的牙面有薄的菌斑，但视诊不可见，若用探针尖刮牙面可见牙菌斑；2 = 在龈缘或邻面可见中等量菌斑，但不超过牙面1/2处；3 = 在龈缘或邻面可见中等量菌斑，超过牙面1/2处；4 = 龈沟内或龈缘区及邻面软垢偏多；5 = 龈沟内或龈缘区及邻面有大量软垢。

2.6. 龋病活跃性试验(caries activity test, CAT)

用专用的消毒棉签采集口腔中一侧上下后牙颊面颈1/3软垢和菌斑的混合体后，将棉签放入1 ml的CAT试剂中，摇匀，震荡1 min，2 h内送入37℃恒温箱中培养48 h后测定pH值。经48 h培养，菌斑内的细菌生长繁殖，分解培养液中的蔗糖产酸，培养液中的pH值指示剂则产生颜色的改变，根据颜色的变化程度，与标准比色板比较并进行评价。

CAT值：0 (龋极低危，pH值5.8~7.2，颜色为蓝色)、1.0 (龋低危性，pH值为5.4 ± 0.3，绿色)、2.0 (龋中危性，pH值4.7 ± 0.3，黄绿色)、3.0 (龋高危性，pH值 < 4.4，黄色)。

2.7. 统计方法

使用Origin 2021对实践结果进行统计学分析，用Wilcoxon符号秩检验比较使用后生元牙膏前、后的PLI值、CAT值变化情况，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3. 结果与分析

3.1. PLI值

Figure 1. Box plots of two groups of PLI values

图1. 两组PLI值箱线图

Silness和Loe在1964年提出菌斑指数(PLI)的概念[26]，即根据牙面菌斑的厚度记分而不根据菌斑覆盖面积记分，用于评价口腔卫生状况和衡量牙周病防治效果。经测定，30位志愿者使用牙膏前(0 d)和使用牙膏后(30 d)的PLI均值分别为3.380和2.233，PLI值显著降低，P < 0.0001 (图1)，说明该后生元牙膏能有效减少牙菌斑。

3.2. CAT值

Cariostat龋易感检测法是日本学者于20世纪70年代开发的龋病风险评估工具，其原理是通过检测牙菌斑的产酸能力，进而测定机体龋病活跃性[27]，近几年开始在我国使用，具有操作安全性高、重复性好、准确度高的优点。经测定，30位志愿者使用牙膏前(0 d)和使用牙膏后(30 d)的CAT均值分别为1.8和0.867，CAT值显著降低，P < 0.0001 (图2)，说明该后生元牙膏能有效降低龋病活跃性，降低患龋病可能性。

Figure 2. Box plots of two groups of CAT values

图2. 两组CAT值箱线图

3.3. 16S rDNA测序结果

通过对16S rDNA的V3-V4区域进行测序，分析序列变异程度以及每种不同序列的丰富度，可以获得环境样本中微生物群组成和结构的信息[28]。该技术现已广泛应用于口腔菌群结构研究[29]。

3.3.1. OTU聚类分析

Figure 3. Venn plot analysis of the number of OTUs in two groups

图3. 两组OTU数量的Venn图分析

对唾液样本菌群进行16S rDNA测序，得到有效序列1,635,960条。根据序列的97%相似性进行OTU聚类，共得到461个OTU。Venn图(图3)显示，同时存在于使用前(0 d)、后(30 d)的OTUs为448，使用前独有的菌种11个，使用后独有的菌种2个，说明使用牙膏后受试者口腔菌群趋于相似。

3.3.2. 菌群组成和相对丰度

在门水平，使用牙膏前(0 d)、后(30 d)的优势菌门均为：变形菌门(Proteobacteria, 0 d: 31%, 30 d: 33%)、厚壁菌门(Firmicutes, 0 d: 30%, 30 d: 28%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 0 d: 24%, 30 d: 26%)、梭杆菌门(Fusobacteria, 0 d: 7%, 30 d: 8%)和放线菌门(Actinobacteria, 0 d: 5%, 30 d: 3%) (图4)；优势菌属均为：链球菌属(Streptococcus, 0 d: 22%, 30 d: 14%)、普氏菌属(Prevotella, 0 d: 12%, 30 d: 19%)、奈瑟菌属(Neisseria, 0 d: 15%, 30 d: 15%)、嗜血杆菌属(Haemophilus, 0 d: 12%, 30 d: 16%)和梭杆菌属(Fusobacterium, 0 d: 6%, 30 d: 7%) (图5)。菌门或菌属的丰度占比已在图中用百分比标出。使用牙膏前后，志愿者优势菌门和优势菌属无显著性差异。

Figure 4. Distribution of dominant Phylam in two groups (legend labeled in proportion from bottom to top)

图4. 优势菌门在两组中的分布情况(图例为从下到上按比例排序标注)

Figure 5. Distribution of dominant Genus in two groups (legend labeled in proportion from bottom to top)

图5. 优势菌属在两组中的分布情况(图例为从下到上按比例排序标注)

3.3.3. Alpha多样性分析

采用Ace指数、Chao指数、Simpson指数和Shannon指数表征群落的Alpha多样性。Ace指数和Chao指数用来估计群落中OTU数目，其值越高，则OTU数目越多；Simpson指数描述的是从一个群落中连续两次抽样所得到的个体数属于同一种的概率，当Simpson指数上升时，表示群落中物种的多样性降低；Shannon指数是一个综合了物种丰富度和均匀度的多样性指数，Shannon指数值越大，表示群落中物种多样性越高。经统计学分析(表1)，使用后的Ace指数和Chao指数值均显著低于使用前(P < 0.0001)，说明使用牙膏后，受试者口腔菌群物种丰富程度显著下降，参考图3的结果，提示我们使用牙膏降低了志愿者菌群的个体差异。Shannon指数值下降，Simpson指数值上升，但均不显著(P > 0.05)，说明使用牙膏后，受试者口腔菌群多样性下降但不显著。

Table 1. Alpha diversity index of two groups

表1. 两组的Alpha多样性指数表

组号	Ace	Chao	Shannon	Simpson
0 d	430.60 ± 75.06	418.62 ± 59.65	3.25 ± 0.35	0.10 ± 0.04
30 d	341.10 ± 60.53	329.57 ± 60.82	3.11 ± 0.34	0.10 ± 0.03
P	3.70E-6	6.49E-7	0.09	0.42

3.3.4. Beta多样性分析

Figure 6. PCA analysis of two groups

图6. 两组的PCA分析图

为了更好了解使用牙膏前后口腔菌群结构变化，我们进行了PCA分析。图6显示，PCA的2个主成分分别占12.54%和8.44%。使用牙膏前，志愿者口腔菌群个体差异较大，数据较为离散；使用牙膏后，志愿者口腔菌群结构趋于一致。造成使用牙膏前后的口腔菌群组成差异的主要贡献者包括二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophaga)、糖单胞菌(Saccharimonadales)、月形单胞菌(Selenomonas)、孪生球菌(Gemella)、毗邻贫养菌(Abiotrophia)等。

4. 结论

在当前的口腔健康研究与应用领域，无细胞上清液(CFS)以及热灭活益生菌等后生元成分，已经作为重要的辅助手段，应用于龋齿等口腔疾病的预防与治疗[30] [31]。这些后生元凭借其独特的益生特性，不仅能够有效促进口腔微生态平衡，还展现出对口腔健康的显著保护作用，在口腔护理领域展现出了巨大的应用潜力和广阔的前景。但是，后生元牙膏对口腔菌群影响的研究数据依然有限。为此，我们招募30名口腔健康志愿者，使用某款后生元牙膏30天后，我们发现志愿者口腔的PLI值和CAT值相较于使用前均显著下降，说明该后生元牙膏能有效清除牙菌斑，降低龋病活跃性，对维持口腔健康有积极作用。Lin等在人体研究中发现，唾液乳杆菌水杨素亚种(Ligilactobacillus salivarius subsp. Salicinius) AP-32和类干酪乳杆菌类干酪亚种ET-66通过提高口腔中IgA、TGF-beta和IL-10基因的表达水平，减少口腔病原菌变形链球菌(Streptococcus mutans)数量，增强口腔健康和免疫力[32]。也有相关实验证明，后生元牙膏对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(ATCC10231)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)有较强的抑菌作用，可以有效减少口腔中引起的口源性口臭的牙周致病菌数量[33]。

进一步，我们对于志愿者唾液微生物组的16S rDNA进行测序，发现优势菌门均为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门，优势菌属均为链球菌属、普氏菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属和梭杆菌属，与前人报道基本一致，证实测序结果可靠[34]。而且，使用牙膏前后，优势菌门和菌属没有显著差异，说明该牙膏不会剧烈扰动口腔菌群。Alpha多样性分析显示，口腔菌群OTU数量显著下降，但是菌群均匀度上升。Beta多样性分析结果，使用牙膏前后菌群结构差异的主要主要贡献者是嗜二氧化碳噬细胞菌、糖单胞菌，月形单胞菌、孪生球菌属等，且使用后生元牙膏后这4种菌属丰度降低。目前已有研究表明，嗜二氧化碳噬细胞菌是口腔鳞状细胞癌的潜在促进剂[35]，以及各种牙周病相关的牙周病原体[36]。糖单胞菌可能与口腔黏膜伴溃疡、生殖器黏膜伴溃疡等疾病相关[37]，但具体作用机制需要进一步研究揭示。月形单胞菌属[38]也是一种重要的牙周病原体，与牙龈炎和牙周炎有关。孪生球菌属是健康人群口腔微生物组的核心菌属，但可能与口腔扁平苔藓等炎症相关[39]。因此，可以推断使用后生元牙膏后，健康人群口腔的致病菌丰度相对下降，说明后生元牙膏对口腔菌群可能具有积极作用。但这种相对下降是否会影响菌群均衡还需要进一步的研究来证实。未来的研究应该关注后生元牙膏对口腔菌群具体组成和多样性的长期影响，以及这种影响与口腔健康之间的关系。同时，在使用后生元牙膏时，也应注意适量、适度，避免过度使用可能带来的潜在风险。

综上所述，该后生元牙膏能有效清除牙菌斑，降低龋病活跃性，有效降低口腔中的致病菌丰度，在调节健康人群口腔菌群方面发挥积极作用。但由于样本和技术有限，未来还需要用不同评估标准进行进一步分析和研究。

基金项目

天津市大学生创新创业训练计划项目，本真–生态化妆品的引领者，编号：202210057038。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。