噪声损伤模型中XIAP对耳蜗毛细胞保护的机制

The Protective Mechanism of XIAP on Cochlear Hair Cells in Noise Damage Model

摘要: 噪声是导致听力损失的常见原因之一。凋亡抑制蛋白XIAP被认为在众多IAPs家族成员中是最有效的细胞死亡调控因子。目前XIAP对耳蜗毛细胞保护的研究有很多，但主要是其抗凋亡作用，对于炎症方面并未进行深入探索。本研究将采用耳蜗毛细胞系进行探索，发现XIAP与炎症具有重要关系，我们发现通过过表达XIAP水平可以缓解炎症，从而减轻耳蜗毛细胞损伤，减少噪声所引起的听力损失，为临床上治疗噪声所引起的听力损失提供了新的靶点和治疗思路。

Abstract: Noise is one of the most common causes of hearing loss. X-linked inhibitor of apoptosis protein is considered to be the most potent regulator of cell death among many IAPs family members. At present, there are many studies on the protection of XIAP on cochlear hair cells, but the anti-apoptotic effect is the main one, and the inflammation aspect has not been deeply explored. In this study, cochlear hair cell lines will be used for exploration, and it is found that XIAP has an important relationship with inflammation. We found that overexpression of XIAP can alleviate inflammation, thereby reducing cochlear hair cell damage and hearing loss caused by noise, providing a new target and therapeutic idea for the clinical treatment of hearing loss caused by noise.

1. 引言

噪声暴露导致的听力损失是世界范围内的一个重大健康问题[1]。噪声性听力损失(NIHL)是一种常见的社会问题。据估计，有13亿人因接触噪音而遭受听力损失[2]。噪声性聋严重影响了人们的生活质量，对患者的心理状况和就业能力产生了严重的负面影响。NIHL主要损伤耳蜗毛细胞，严重者可引起耳蜗神经元及突触的损伤。噪声不仅对耳蜗毛细胞造成直接的物理损伤，还通过多种生物学机制引发细胞死亡[3]-[5]。这些机制包括氧化应激、细胞凋亡和炎症反应等。然而，经过数十年的努力，NIHL的问题仍在继续增长。因为耳蜗毛细胞一旦受损，其再生能力极为有限，因此寻找有效的保护和修复策略至关重要。尽管噪音抑制器可以部分缓解损伤，但许多人对佩戴噪音抑制器有抵制，因其对工作和军事行动有所限制。目前，由于对介导毛细胞死亡和存活过程的研究取得了重大进展。这些过程揭示了耳蜗损伤机制的潜在位点，并且可以进行干预性保护，在保护听力免受噪声损伤方面具有相当大的潜力。先前的研究表明，噪声暴露会增加耳蜗中ROS的水平，随后激活导致细胞死亡的信号通路[6]。在此背景下，XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)作为一种重要的抗凋亡因子，其在耳蜗毛细胞损伤中的作用逐渐受到重视。

2. 材料与方法

本研究主要使用过氧化氢(H₂O₂)来模拟噪声损伤，因为H₂O₂是ROS的一种，而噪声主要的损伤机制是ROS损伤。因此，根据以往的研究，我们使用H₂O₂来处理耳蜗毛细胞，模拟噪声所产生的ROS损伤。然后通过细胞实验和分子实验来观察XIAP与耳蜗毛细胞损伤的相关蛋白表达。细胞实验中，我们采用小鼠耳蜗毛细胞系(House Ear Institute-Organ of Corti 1, HEI-OC1)，该细胞系在研究耳蜗炎症反应和凋亡通路上具有重要的作用。在分子实验中，我们主要进行了western blot实验，观察目的蛋白的表达变化。

2.1. 传代与铺板

我们在37℃培养箱，二氧化碳浓度为5%的环境中培养HEI-OC1细胞，待细胞密度达到90%左右时进行细胞传代和铺板。次日待培养板的细胞密度到达70%左右时，进行H₂O₂加药处理或者进行转染，最后进行收样提蛋白。

2.2. 转染

待培养板密度达到60%~70%时，进行细胞转染。细胞转染是指将外源分子(如DNA，RNA等)导入(真核)细胞的实验技术之一。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染指外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，通常只持续几天，在转染后24~72小时内分析结果，多用于启动子和其他调控元件的分析。稳定转染指外源DNA可以整合到宿主染色体中。我们使用的是瞬时转染，转染的目的是使得基因进入细胞中进行表达，从而影响该基因或者其相关基因的表达，最后通过western blot进行验证蛋白水平。

2.3. 分子实验

分子实验主要进行了western blot，Western blot (也称为蛋白质免疫印迹)是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术，蛋白通过在不同浓度的SDS-Page凝胶中进行分离，分离后的蛋白从胶上转移到PVDF膜上，通过将膜进行一抗孵育和二抗放大蛋白的表达，从而在相应条带位置附近得到目的蛋白，最终通过化学发光法得到目的蛋白的最终表达量，条带的粗细和强度则代表蛋白的表达量。

3. 统计学处理

Western blot中所有的蛋白表达使用imagej进行统计分析，分析后使用EXCEL表格进行整理，使所有的结果进行归一化处理，最后使用单样本T检验，p < 0.05表示差异有显著性意义。

4. 结果

4.1. HEI-OC1细胞中XIAP的表达

XIAP作为凋亡抑制蛋白，在真核生物中具有重要作用，因为其具有抗凋亡作用，因此在本研究中我们猜测XIAP亦可以在耳蜗毛细胞中发挥重要作用。我们使用HEI-OC1细胞系作为噪声损伤模型中的耳蜗毛细胞，使用H₂O₂处理细胞，作为模拟噪声的损伤。我们发现，当HEI-OC1细胞经过H₂O₂处理后，我们经过western blot实验进行分析检测，发现跟未进行H₂O₂处理组相比，XIAP在噪声损伤后表达量降低(图1)。

(a) 表示western blot可见H₂O₂处理后XIAP的表达降低；(b) 是(a)的western blot统计图。

Figure 1. Changes of XIAP expression in HEI-OC1 cells during noise damage induced by H₂O₂

图1. 在HEI-OC1细胞中，H₂O₂诱导噪声损伤中XIAP的表达变化

4.2. HEI-OC1细胞中炎症因子的表达变化

噪声暴露不仅直接导致耳蜗毛细胞的损伤，还通过激活炎症反应加重细胞损伤。噪声诱导的炎症反应涉及多种细胞因子的释放，例如IL-1β、IL-6和TNF-α等。这些因子会刺激内耳组织中巨噬细胞和其他免疫细胞的活化，导致局部炎症的进一步发展。因此在本研究中，我们观察了炎症因子NF-κB、IL-1β的表达变化。我们发现，HEI-OC1细胞经过H₂O₂处理后，炎症因子NF-κB及IL-1β的表达均增加，表明噪声损伤引起的炎症因子表达增加(图2)。

(a) 表示western blot可见H₂O₂处理后IL-1β的表达增加；(b) 表示western blot可见H₂O₂处理后NF-κB的表达增加；(c) 表示(a)的western blot统计图；(d) 表示(b)的western blot统计图。

Figure 2. In HEI-OC1 cells, H₂O₂ induced changes in the expression of inflammatory factors NF-κB and IL-1β in noise damage

图2. 在HEI-OC1细胞中，H₂O₂诱导噪声损伤中炎症因子NF-κB及IL-1β的表达变化

(a) 表示western blot可见过表达XIAP水平后NF-κB的表达降低；(b) 表示western blot可见过表达XIAP水平后IL-1β的表达降低；(c) 表示(a)的western blot统计图；(d) 表示(b)的western blot统计图。

Figure 3. Changes in the expression of inflammatory factors NF-κB and IL-1β in HEI-OC1 cells after overexpression of XIAP level in noise damage induced by H₂O₂

图3. 在HEI-OC1细胞中，H₂O₂诱导噪声损伤中过表达XIAP水平后炎症因子NF-κB及IL-1β的表达变化

4.3. HEI-OC1细胞中过表达XIAP水平后炎症因子的表达变化

由于XIAP作为凋亡抑制因子，具有抗凋亡作用，但对于炎症反应是否有效，目前研究报道仍然较少。因此，我们在耳蜗毛细胞中研究了XIAP是否可以调控炎症因子，减少炎症反应。通过过表达XIAP水平，我们发现跟单独进行H₂O₂处理相比，过表达XIAP水平后，炎症因子NF-κB及IL-1β的表达减少，炎症减轻。表明XIAP可以减轻噪声引起的炎症反应(图3)。

在HEI-OC1细胞中，我们发现由H₂O₂诱导的噪声损伤中，炎症因子NF-κB及IL-1β表达增加，XIAP的表达降低。当我们过表达XIAP蛋白水平后，发现炎症因子NF-κB及IL-1β表达减少，炎症减轻。说明XIAP可以缓解噪声损伤所产生的炎症。

5. 讨论

NIHL是一种复杂的疾病，由遗传和环境因素相互作用所引起，但主要由噪声暴露引起的生物损害程度所决定。噪声可导致Corti器官的破坏，可能由两种机制导致：短时间暴露于极端噪声强度所致的机械性破坏或持续性暴露于温和噪声所致的病理性代谢失代偿[7]。目前的代谢损伤理论集中在过度噪声刺激引起的自由基和谷氨酸兴奋性毒性的形成上，随后激活导致细胞死亡的信号通路。最近，越来越多的研究表明炎症在噪音诱导的耳毒性中起关键作用[8]。当发生听力损失后，在耳蜗中发现代表CD45和Iba1阳性的炎性细胞浸润，尤其是在血管纹中[9]-[11]。这些炎症细胞可以合成和释放多种促炎细胞因子，如白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) [12]。有研究表明核因子kappa B (NF-κB)在炎症调节中起核心作用。研究在噪声损伤中NF-κB信号级联反应被激活，而抑制NF-κB可降低促炎细胞因子的含量[13]。这些研究表明噪声损伤会引起炎症。而IAPs是一种凋亡抑制蛋白，目前已经确定了八个人类IAPs家族，BIRC1 (NAIP)，BIRC2 (cIAP1)，BIRC3 (cIAP2)，BIRC4 (XIAP)，BIRC5 (Survivin)，BIRC6 (Apollon)，BIRC7 (Livin) and BIRC8 [14]。在众多IAPs家族成员中，XIAP被认为是最有效和最多方面的细胞死亡调控因子[15]。XIAP含有3个重复的BIR (BIR1-3)域，一个锌结合体，其可通过蛋白–蛋白的相互作用调节XIAP抑制剂的活性[16]。XIAP还有一个羧基末端RING结构域，具有E3泛素连接酶活性[17]。此外，它还含有一种与泛素化蛋白结合的泛素相关(UBA)结构域[18] [19]。BIR2与caspase 3和caspase 7的IBM结合，BIR3与caspase 9的IBM结合，而这些酶的IBM区域是caspase酶活性所必需的[20]。因此XIAP抑制了caspase 3、caspase 7、和caspase 9的活性。但对于噪声损伤所引起的炎症反应，目前研究仍然较少。因此，在本研究我们通过使用H₂O₂构建了噪声损伤模型，观察噪声损伤模型中确实有炎症因子增加。接着我们探索了XIAP与炎症因子之间的调控，发现XIAP可以减少炎症因子的产生，缓解噪声所产生的炎症，这对于未来临床上噪声损伤的治疗提供了新的靶点和思路。最近有研究表明提出噪声损伤过程中有自噬的参与，促进自噬可以缓解噪声损伤所引起的ROS损伤[21]。而有研究表明XIAP也可促进自噬，但在听力研究中仍然较少。因此，未来的研究中我们将针对XIAP是否可以通过促进自噬缓解噪声所引起的炎症进行更深一步的探索。

6. 结论

凋亡抑制蛋白XIAP可以减轻噪声损伤引起的炎症反应，为临床上噪声损伤的治疗提供了新的靶点。

基金项目

安徽医科大学研究生科研与实践创新项目(编号：YJS20230136)。

NOTES

^*通讯作者。