1. 引言
设施葡萄种植是现代设施农业种植规模相对较大的产业之一，其不适宜的高温与弱光条件均对葡萄生长发育、产量、果实品质产生严重影响，树体可通过增强生理生化水平以适应逆境胁迫条件，从而最大程度减少损失[1]。植物光合碳的固定及还原、蔗糖的合成及光合产物的运输和分配均受到温度变化的影响[2]，这种自我调节能力一方面表现为非生物胁迫，另一方面表现为遗传因素的影响。树体自身相关遗传基因表达调控的结果直接影响其表形及生理生化特性。已有研究表明：植物在高温胁迫时调控相关基因表达量，使淀粉、氨基酸、蛋白质的合成减少，降低脱落酸、抗氧化物质响应，以提高植物耐高温特性[3] [4]。光胁迫是非生物胁迫的一种，亦影响植物的形态、抗性、品质、生理生化等性状[5]。葡萄幼苗受到弱光胁迫后可通过调整光合色素、光反应结构蛋白的表达水平维持体内光合作用的平衡与正常运作[6]。上述研究均是前人针对不同植物分别从高温、弱光两个方向进行了独立研究，而设施条件下短时极端高温与弱光共同胁迫的相关研究少见报道。转录组测序技术已广泛应用于植物代谢通路、基因组注释完善及差异基因功能的筛选分析中[7]。因此，本文研究了设施短时极端花期高温及弱光双重胁迫条件下葡萄叶片转录组差异基因表达分析，以期为逆境胁迫条件下葡萄生长发育的分子机制提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料及环境条件
试验拱棚长80 m，宽12 m，株行距1 m × 1.5 m，以“宁葡1号”为试验材料，试验树龄5年生，选取生长健壮，树势中庸的植株为试材，试验设3个处理，其中处理1 (ZY10)为全植株双层棚膜覆盖，共10株，处理2 (Y10)为全植株单层棚膜覆盖，共10株，拱棚盛花期最高温度41℃左右，持续时间为30分钟，同时以日光温室栽植的“宁葡1号”树体为对照CK(Y109)进行常规管理。各处理在果实成熟后进行叶片采样，经液氮处理后，放置于−80℃超低温冰箱保存备用。
2.2. 样品检测和文库构建
试验样品采集后立即送北京诺禾致源科技股份有限公司提取RNA和测序，采用Agilent 2100 bioanalyzer方式精确检测RNA完整性。利用真核生物大部分mRNA都带有polyA尾的结构特征，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250~300 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5 ng/ul，随后使用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2 nM)。
2.3. 测序及数据分析
把不同文库按照有效浓度汇集后进行Illumina测序。在测序池中加入dNTP、DNA聚合酶和引物进行扩增，通过计算机捕获荧光信号获得待测片段序列信息。
2.4. 差异表达基因的qRT-PCR验证
随机选取了6个代表性差异表达基因进行荧光定量qRT-PCR分析，运用Primer 5.0软件设计荧光定量引物(表1)。反应程序如下：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s共40个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，每15 s升温0.3℃，95℃ 15 s。
Table 1. Fluorescence quantitative primer design
表1. 荧光定量引物设计
引物名称 Primer name |
碱基序列(5'-3') Base sequence |
大小 Size (bp) |
3860 |
F |
CCAAACAGCGGTGAGACTTATGATG |
101 |
R |
TCACGCCACTTGCTCACATAGGA |
740 |
F |
CGCCTCTTCCTACATCCACCGC |
202 |
R |
GCCGATAAGGGCACAAATACCG |
290 |
F |
AGTTCTTCGTCGGCTGTCTCGTT |
170 |
R |
GATGACAATGCCAGTGTTTTGGTTAG |
3890 |
F |
ACTTTAGTTCCACGGATGCGGG |
163 |
R |
GGATTCGGTCTGCCTCTGCTG |
2460 |
F |
ACTTGCTGGTTCTCTTGATTGGA |
121 |
R |
GCCGTCATTCTCTTAGTGATTGC |
4570 |
F |
GGTGTTTCTTGCGTGAGTGTAGTG |
180 |
R |
TCGTATTCCTCCCTATCCCTATTG |
actin |
F |
GATTCTGGTGATGGTGTGAGT |
168 |
R |
GACAATTTCCCGTTCAGCAGT |
3. 结果与分析
3.1. 转录组测序分析
经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查，获得后续分析使用的clean reads，数据汇总如表2所示。
测序数据质控后的总数目与比对到参考基因组上的数目及比例和比对到参考基因组唯一位置的序列数目及比例见表3。
Table 2. Sequencing data quality statistics
表2. 测序数据质量统计表
处理 treated |
原始数据(条) Original data (items) |
过滤后数据(条) Filtered data (items) |
测序错误率% Sequencing error rate (%) |
Phred > 20
碱基比% Base ratio (>20%) |
Phred > 30 碱基比% Base ratio (>30%) |
GC碱基比% Base ratio (GC%) |
Y109_1 |
42,355,012 |
41,926,090 |
0.03 |
96.88 |
91.91 |
46.28 |
Y109_2 |
43,610,632 |
43,070,260 |
0.03 |
97.19 |
92.53 |
46.10 |
Y109_3 |
43,671,044 |
43,073,250 |
0.03 |
97.15 |
92.44 |
45.89 |
ZY10_1 |
43,910,514 |
43,537,742 |
0.03 |
97.30 |
92.74 |
45.46 |
ZY10_2 |
44,317,862 |
43,939,480 |
0.03 |
97.44 |
93.03 |
45.81 |
ZY10_3 |
45,112,894 |
44,668,952 |
0.03 |
97.35 |
92.88 |
45.50 |
Y10_1 |
42,989,942 |
42,520,632 |
0.03 |
97.66 |
93.53 |
45.68 |
Y10_2 |
44,458,970 |
44,095,518 |
0.03 |
97.07 |
92.27 |
45.47 |
Y10_3 |
44,806,724 |
44,371,738 |
0.03 |
97.48 |
93.15 |
45.59 |
3.2. 差异基因分析
基于FPKM值，分析了Y10 vs Y109、ZY10 vs Y109和ZY10 vs Y10的差异表达基因，以|log2(FoldChange)| > 1为筛选标准。由图1可以看出Y10 vs Y109比较组中上调基因1790个，下调基因3702个；ZY10 vs Y109比较组中上调基因1814个，下调基因4009个；ZY10 vs Y10比较组中上调基因513个，下调基因909个。如图2所示，Y10 vs Y109与ZY10 vs Y109比较发现，全部差异基因共7199个，不同处理共有差异
Table 3. Statistics of comparison with reference genome
表3. 参考基因组比对统计表
处理 Treated |
单端序列数目(条) Number of single-end sequences (items) |
比对到参考基因组上的
数目及比例(%) Number and proportion of alignments to the reference genome (%) |
比对到参考基因组唯一位置的
序列数目及比例(%) Number and proportion of sequences aligned to unique positions in the reference genome (%) |
Y109_1 |
41,926,090 |
38,174,320 (91.05%) |
37,324,507 (89.02%) |
Y109_2 |
43,070,260 |
39,619,736 (91.99%) |
38,696,045 (89.84%) |
Y109_3 |
43,073,250 |
39,647,251 (92.05%) |
38,770,687 (90.01%) |
ZY10_1 |
43,537,742 |
40,539,741 (93.11%) |
39,583,153 (90.92%) |
ZY10_2 |
43,939,480 |
40,777,745 (92.8%) |
39,835,204 (90.66%) |
ZY10_3 |
44,668,952 |
41,400,523 (92.68%) |
40,462,857 (90.58%) |
Y10_1 |
42,520,632 |
39,678,360 (93.32%) |
38,686,348 (90.98%) |
Y10_2 |
44,095,518 |
41,059,200 (93.11%) |
40,097,858 (90.93%) |
Y10_3 |
44,371,738 |
41,249,740 (92.96%) |
40,234,157 (90.68%) |
Figure 1. Volcano plot of differentially expressed genes
图1. 差异基因火山图
Figure 2. Venn diagram of differentially expressed genes
图2. 差异基因韦恩图
基因4116个，重叠基因数占57.17%；ZY10 vs Y109与ZY10 vs Y10比较发现，全部差异基因共6477个，不同处理共有差异基因768个，重叠基因数占11.86%；Y10 vs Y109与ZY10 vs Y10比较发现全部差异基因共6153个，不同处理共有差异基因761个，占12.37%。三个比较组合共同比较发现，全部差异基因共7449个，其中三个处理共有差异基因357个，重叠基因数占4.79%。
3.3. 差异表达基因GO富集分析
GO (Gene Ontology)数据库分为生物过程(Biological Process)、细胞组成(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)等3个部分。由图3可知，Y10 vs Y109这两个处理组合在生物过程分类中差异基因显著上调表达，主要集中在细胞壁组织、肉桂酸生物合成过程、铁离子稳态、多糖代谢过程等4个组分；在细胞组成分类中差异基因显著上调表达，主要集中在细胞连接、细胞壁、细胞–细胞连接、外部封装结构、细胞外区域、胞间连丝、共质体等7个组分；在分子功能分类中差异基因既有上调表达也有下调表达，主要集中在血红素结合、铁离子结合、单加氧酶活性、氧化还原酶活性、四吡咯结合、UDP-糖基转移酶活性等6个组分。
由图4可知，ZY10 vs Y10这两个处理组合在生物过程分类中差异基因显著上调表达的组分有细胞壁组织、药物分解代谢过程、葡聚糖代谢过程、催化活性的负调控、分子功能的负调控、多糖代谢过程等；在细胞组成分类中差异基因显著上调表达的组分为细胞外区域、质膜内在成分、质膜部分，下调表达和上调表达均显著的组分为细胞壁和外部封装结构；在分子功能分类中单加氧酶活性组分显著上调表达，在葡萄糖基转移酶活性、水解酶活性、氧化还原酶活性、UDP-葡萄糖基转移酶活性等4个组分均显著上调和下调表达。
由图5可以看出，ZY10 vs Y109这两个处理组合在生物过程分类中差异基因主要集中在细胞壁组织或生物发生、肉桂酸生物合成过程、铁离子稳态、多糖代谢过程等4个组分之间显著上调表达；在细胞组成分类中差异基因主要集中在细胞连接、细胞壁、细胞–细胞连接、外部封装结构、细胞外区域、胞间连丝、共质体等7个组分之间显著上调表达；在分子功能分类中差异基因主要集中在酶抑制剂活性、葡萄糖基转移酶活性、铁离子结合、单加氧酶活性、氧化还原酶活性、UDP-糖基转移酶活性等6个组分之间上调与下调均显著表达。
Figure 3. GO classification statistics of differentially expressed genes between Y10 vs Y109
图3. Y10 vs Y109差异基因的GO分类统计
Figure 4. GO classification statistics of differentially expressed genes between ZY10 vs Y10
图4. ZY10 vs Y10差异基因的GO分类统计
Figure 5. GO classification statistics of differentially expressed genes between ZY10 vs Y109
图5. ZY10 vs Y109差异基因的GO分类统计
3.4. 差异表达基因KEGG富集分析
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。以Y10 vs Y109处理组的差异基因进行KEGG代谢通路分析，共注释获得934个差异基因，注释到117个代谢通路中。通过统计分析筛选出最显著的20个富集通路(图6)，其中差异基因最多的代谢通路主要有氨基糖核苷酸糖代谢(38条)、淀粉和蔗糖代谢(41条)、谷胱甘肽代谢(42条)、植物激素信号转导(78条)、苯丙素生物合成(64条)、昼夜节律–植物(40条)、类黄酮生物合成(52条)等代谢通路。ZY10 vs Y10处理组的差异基因进行KEGG代谢通路分析，共注释获得297个差异基因，注释到103个代谢通路中。通过统计分析筛选出最显著的20个富集通路(图7)，其中差异基因最多的代谢通路主要有氨基糖和核苷酸糖代谢(15条)、淀粉和蔗糖代谢(16条)、植物–病原体相互作用(13条)、植物激素信号转导(25条)、苯丙素生物合成(19条)、昼夜节律–植物(15条)、类黄酮生物合成(20条)。ZY10 vs Y109处理组的差异基因进行KEGG代谢通路分析，共注释获得1002个差异基因，注释到119个代谢通路中。通过统计分析筛选出最显著的20个富集通路(图8)，其中差异基因最多的代谢通路主要有氨基糖和核苷酸糖代谢(41条)、淀粉和蔗糖代谢(42条)、植物–病原体相互作用(65条)、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(35条)、谷胱甘肽代谢(37条)、植物激素信号转导(81条)、苯丙素生物合成(66条)、昼夜节律–植物(42条)、类黄酮生物合成(55条)。
Figure 6. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes between Y10 vs Y109
图6. Y10 vs Y109差异基因KEGG富集分析
Figure 7. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes between ZY10 vs Y10
图7. ZY10 vs Y10差异基因KEGG富集分析
Figure 8. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes between ZY10 vs Y109
图8. ZY10 vs Y109差异基因KEGG富集分析
3.5. 实时荧光定量RT-qPCR验证
随机选择3860、0740、0290、3890、2460、4570等6个差异表达水平显著的转录基因进行RT-qPCR分析，验证转录组测序结果的准确性，结果表明：转录组所得数据真实可靠，获得的RT-qPCR结果与RNA-seq结果相一致(图9)。
Figure 9. Real-time quantitative fluorescence PCR expression analysis
图9. 实时定量荧光PCR表达分析
4. 讨论
对设施花期短时极端高温胁迫条件下葡萄叶片转录组差异表达基因富集分析发现，在细胞壁组织、肉桂酸生物合成过程、铁离子稳态、多糖代谢过程、细胞连接、细胞壁、细胞–细胞连接、外部封装结构、细胞外区域、胞间连丝、共质体、血红素结合、铁离子结合、单加氧酶活性、氧化还原酶活性、四吡咯结合、UDP-糖基转移酶活性等组分影响显著。植物体在高温胁迫后，各类细胞器基因的表达量均会发生变化[8]。相关差异基因的表达直接影响植物形态、生理生化过程，后期植株枝条、叶片、果实等生长表现与其有直接关系。从分析结果来看，设施葡萄高温胁迫影响远大于露地玉米籽粒响应高温胁迫[9]引起的淀粉(蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶)、蛋白质、内源激素(生长素、细胞分裂素)等相关代谢通路关键基因的表达水平变化过程。本研究中转录组分析发现的差异基因远多于火龙果幼苗高温处理后发现的198个差异基因[10]，这可能与高温胁迫条件的不同有一定关系。与药用蒲公英高温胁迫后发生的生物膜系统受损，光合能力下降以及热休克蛋白、WRKY转录因子、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽等基因显著表达相比[11]，设施葡萄高温胁迫差异基因类型的影响范围更大。与高温胁迫下景宁木兰淀粉与蔗糖代谢途径关键基因表达变化[12]相比，葡萄淀粉代谢途径关键基因的表达相对较小，这可能与植物体自身的生物结构特点有关。本研究中未发现差异基因亚精胺和褪黑素的显著调节过程，这与半夏高温胁迫1 h后叶片转录组差异基因提高耐受性有很大不同[13]。
光胁迫亦是植物非生物胁迫的一种，影响植物的形态、抗性、品质等多个性状。本研究对设施高温弱光胁迫下葡萄叶片转录组与高温胁迫条件下差异基因表达相比，发现显著表达的组分有药物分解代谢过程、葡聚糖代谢过程、催化活性的负调控、分子功能的负调控、多糖代谢过程等、质膜内在成分、质膜部分、水解酶活性。弱光条件转录组差异基因表达与日光温室常规条件转录组差异基因表达相比，发现显著表达的组分有酶抑制剂活性、葡萄糖基转移酶活性。与遮光性套袋处理的桃果实经转录组分析结果相比[14]，光合作用和核糖体生物合成通路并没有显著富集，这是完全遮光与弱光条件下的差异表达，其结果与遮光程度有直接关系。与葡萄果实5%转色时使用遮光网处理[15]结果相比，除类黄酮生物合成通路显著富集外，淀粉和蔗糖代谢、植物–病原体相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导、苯丙素生物合成、昼夜节律–植物等代谢通路也显著富集。与弱光环境下适应性不同的番茄生长发育与转录组差异分析结果[16]比较发现，不耐弱光的品种植株生长发育易受到抑制，相关差异基因的表达会显著上调或下调，植物激素信号转导代谢通路会显著富集。本研究结果还发现设施高温弱光与高温条件下葡萄叶片转录组在植物–病原体相互作用代谢通路显著富集，设施高温弱光与日光温室常规条件相比在植物–病原体相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等代谢通路显著富集。这与高温胁迫下菜心和仙客来转录组分析[17] [18]结果略有不同，具体原因还有待进一步研究。
5. 结论
本研究通过对不同处理组合差异基因分析发现，葡萄植株在受到高温弱光胁迫后，植物体自身进行了适应性调节，许多基因的表达量发生了显著变化，环境差异越大其表达量变化也越大。GO功能富集分析发现，拱棚与日光温室相比较生物过程及细胞组成分类基本相同均显著上调表达，其中生物过程主要集中在细胞壁组织、肉桂酸生物合成过程、铁离子稳态、多糖代谢过程等4个组分；细胞组成分类主要集中在细胞连接、细胞壁、细胞–细胞连接、外部封装结构、细胞外区域、胞间连丝、共质体等7个组分；分子功能分类中在血红素结合、四吡咯结合、酶抑制剂活性、葡萄糖基转移酶活性等4个方面存在差异，这可能与遮光及其它因素有关，还需要进一步结合实际情况深入分析。KEGG富集分析发现，拱棚与日光温室相比差异显著的富集通路为植物–病原体相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代谢，其中拱棚遮光处理比不遮光处理显著增加了植物–病原体的相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代谢的差异基因表达。
基金项目
宁夏回族自治区重点研发计划项目(2021BBF03003)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。