1. 引言
肺腺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的组织学类型，占NSCLC的40%~50% [1]。
尽管近年来肺癌的诊断和治疗取得了显著进展，但肺腺癌的发病率和致死率在全球范围内依然居高不下，其早期诊断率低和晚期转移能力强是导致患者预后不良的主要原因之一[2] [3]。研究表明，肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)在肺腺癌的发生、发展和转移中发挥了关键作用，而其中酸性微环境是TME的重要特征之一，其通过促进血管生成、细胞侵袭和免疫逃逸，显著影响肿瘤的进展和转移能力[4] [5]。此外，血小板及其衍生物在调控肿瘤进展方面的作用也引起了越来越多的关注[6]。血小板衍生微粒(platelet-derived microparticles, PMPs)是血小板在激活或凋亡过程中释放的微小膜囊泡，具有复杂的分子组成和多样的生物学功能[7]。血小板微粒(PMPs)在体内的水平被认为与肿瘤的侵袭性及癌症患者的预后密切相关，但其作用机制尚不完全清楚[8]。PMPs携带多种生物分子，包括蛋白质、核酸和脂质，在血栓形成、免疫调控和炎症反应等生理与病理过程中发挥重要功能[9] [10]。其中，通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β (TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF2)和血小板衍生生长因子(PDGF)，PMPs能够显著促进血管生成[11] [12]。这种促血管生成的特性可能间接促进了肿瘤细胞的生长。同时，PMPs还可能通过与肿瘤细胞和内皮细胞的直接相互作用、激活蛋白水解过程、引发炎症反应及规避免疫监视等多种机制，进一步推动肿瘤的生长和扩散[13] [14]。然而，关于PMPs如何影响肺腺癌的生物学行为，特别是其背后的分子机制，目前的研究仍然相对有限，许多问题尚待解答。
本研究旨在系统探讨PMPs对肺腺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响，为进一步理解PMPs在肺腺癌进展中的作用提供实验数据支持。
2. 材料与方法
2.1. 材料
A549非小细胞肺癌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司购买；CCK-8试剂盒，MedChemExpress；人血小板微粒(PMP)酶联免疫分析试剂盒，江苏晶美生物科技有限公司；血小板活性因子酶联免疫分析试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，美国GIBCO公司。
2.2. 血小板衍生微粒的提取方法
1) 将血液样品分装至50 ml离心管中，进行3000 g，20 min离心，去除血细胞。
2) 将去除血细胞的上清转移至新的50 ml离心管中，进行10,000 g，30 min离心，去除多余的细胞碎片。将离心后的上清用0.22 um一次性过滤器进行过滤，去除漂浮在上清液中的细胞碎片。
3) 将上清液使用100 KD的15 ml离心过滤装置使样品体积浓缩至25.6 ml。
4) 将浓缩液转至贝克曼超速离心管中，进行120,000 g，90 min超速离心。
5) 将离心后的样品上清液去除，保留沉淀，使用1*PBS进行吹打，使沉淀完全溶解，将完全溶解后的溶液转移至新的EP管中保存。
2.3. 血小板衍生微粒表征
透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)
(1) 取制备好的PMP悬液样本，用移液器吸取10 µL悬液滴加在铺设于平整表面的封口膜上(封口膜背面固定)。将载膜铜网正面朝下，轻轻置于液滴上，使其自然接触并吸附10~15分钟。吸附完成后，用滤纸小心移除多余液体，并将铜网放置于通风环境中稍加晾干，以备后续操作。
(2) 进行染色处理。用移液器吸取10 µL 2%磷钨酸溶液，滴加于封口膜上。将已吸附PMP的铜网正面朝向染色液，小心倒扣，使其均匀接触染色液，并静置3~5分钟以完成染色。染色结束后，用滤纸吸除多余液体，尽量避免残留液体对观察效果的影响。
(3) 将染色后的铜网置于光源(如白炽灯)下快速晾干。干燥完成后，将样本放置于透射电子显微镜下进行观察，并记录相关图像数据，以便进行后续分析。
2.4 不同乳酸含量对A549细胞影响
(1) CCK8检测方法
使用CCK-8试剂盒测定不同乳酸浓度对A549细胞增殖的影响。取对数生长期的A549细胞，铺板于96孔板中，每孔加入1 × 104个细胞，待细胞贴壁(培养24小时)后，采用不同浓度的乳酸(0、5、15、25 mmol/L)处理细胞，处理时间为48小时。处理完成后，将10 μl CCK-8溶液加入各孔中，在体积分数为5%的CO2、37℃恒温培养箱中孵育2小时。随后，使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值(A)，每组实验重复3次。
(2) 细胞划痕检测
使用划痕实验观察不同乳酸浓度对A549细胞迁移的影响。将对数生长期的A549细胞按照5 × 105个细胞/孔接种于6孔板中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养过夜，使细胞在次日基本覆盖孔板底部。随后，使用无菌10 μL的移液管尖垂直划伤细胞单层，从上至下滑动形成直线划痕。用PBS缓冲液冲洗3次以去除碎片和漂浮细胞。将不同浓度梯度(0、5、15、25 mmol/L)的乳酸溶液加入培养孔，与细胞共同培养。在0小时(0 h)、24小时(24 h)、48小时(48 h)时，分别记录划痕区域的面积。在每次拍照前，使用 PBS再次清洗3次以充分去除漂浮细胞，确保拍摄划痕区域清晰。
2.5. 乳酸环境下PMP对A549细胞影响
(1) CCK8检测方法
使用CCK-8试剂盒测定乳酸调控PMP对A549细胞增殖的影响。取对数生长期的A549细胞，铺板于96孔板中，每孔加入1 × 104个细胞，待细胞贴壁(培养24小时)后，采用等体积的10% FBS DMEM培养液(空白组)、PMP组(100 μg/ml)、Lat组(乳酸，20 mmol/l)以及PMP + Lat组，处理时间为48小时。采用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力。
(2) 细胞划痕检测
用划痕法观察乳酸环境下PMP对A549细胞迁移的影响。取对数生长期的A549细胞，按5 × 105个细胞/孔铺板于6孔板中，在37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，使细胞在第二天基本覆盖孔板底部。采用基础DMEM培养液(空白组)、PMP组(100 μg/ml) Lat组(20 mmol/l)以及PMP + Lat组处理A549细胞，通过细胞划痕法检测各组细胞的迁移能力。
(3) 细胞因子检测(ELISA)
1) 加样：取出Elisa试剂盒，将试剂盒中的标本孔进行分组设定，包括标准孔、空白孔及样本孔，向空白孔加入50 μL灭菌注射用水。
2) 标准品上加样，对需要检测的样品进行加样处理，处理过程当中力量一定要轻柔，不要碰到样品孔侧壁，然后轻轻地摇匀。
3) 温育：用封板膜或者锡箔纸把板孔给封住，然后放在37℃培养箱中，30分钟后再取出。
4) 配液：先对浓缩液按浓缩比例进行稀释，以准备取用。
5) 洗涤：拆掉外面的封板膜，用100 μL移液器把里面的液体去除掉，注意移液过程中不要碰触其他孔，再向孔中加入洗涤液，30分钟之后再丢掉洗涤液，反复重复5次之后将其在吸水纸上拍干。
6) 加酶：向样品孔当中加入酶标试剂，剂量为50 μL，空白孔不需要进行处理。显色：每个孔当中还需要依次加入50 μL的显色剂A及显色试剂B，然后再进行摇晃混匀，在37℃培养箱当中放置10分钟，注意需要避光。
7) 终止：将终止液45 μL加入加样孔之中，此时发现加样孔由蓝色变成棕黄色。测定：在反应结束之后的20分钟之内，测量各个孔的吸光度，OD值为450 nm。
2.7. 统计学方法
数据以平均值 ± SD表示。每次实验至少进行三次。统计分析采用GraphPad Prism 10.1.2 (GraphPad软件公司，加利福尼亚州圣地亚哥)。两组之间的比较采用配对双尾t检验。单因素方差分析(ANOVA)用于多个组之间的比较。重复测量方差分析用于区分重复测量数据。当P < 0.05时，差异被视为显著。
3. 结果
3.1. PMPs表征
通过超高速离心法分离获得的PMPs在透射电子显微镜下展现出其独特的结构特征。在低倍镜观察下(图1(a))，PMPs均匀分布于视野中，呈现为膜结合的小型微粒。进一步使用高倍镜观察(图1(b))，可以清晰看到微粒具有类似于椭圆形的囊泡外形。
3.2. 乳酸对A549细胞活力影响
通过CCK-8检测和细胞划痕实验结果表明，乳酸对A549细胞的增殖和迁移具有显著促进作用。在不同乳酸浓度(0、5、15、25 mmol/L)处理下，随着乳酸浓度的增加，A549细胞的增殖能力和迁移能力均显著增强。CCK-8检测中，乳酸处理48小时后，A549细胞的吸光度值随乳酸浓度增加显著升高，与对照组(0 mmol/L)相比，15 mmol/L和25 mmol/L乳酸组均表现出显著性差异(P < 0.05或P < 0.01)。这提示乳酸能够显著促进A549细胞的增殖(图2(c))。在划痕实验中，乳酸处理后，A549细胞的划痕闭合速度显著加快。与对照组(0 mmol/L)相比，15 mmol/L和25 mmol/L乳酸组在24小时和48小时的迁移率均显著提高(P < 0.05 或 P < 0.01)。这些结果表明乳酸能够显著促进A549细胞的迁移能力(图2(a)，图2(b))。
(a) (b)
Figure 1. Transmission electron microscopy (TEM) images of PMPs
图1. PMPs透射电子显微镜(TEM)图像
(a)
(b) (c)
Figure 2. Photographs (a) and quantification (b) of the migration of different lactic acid concentrations at different time points, (c) Survival of A549 cells by lactic acid as determined by CCK8; ns: P > 0.05, the difference was considered not statistically significant; *: P < 0.05 compared to the blank group; **/***: P < 0.01 compared to the blank group; ##/###: P < 0.01
图2. 不同乳酸浓度在不同时间点迁移情况的照片(a)及定量(b)，(c)通过CCK8测定乳酸对A549细胞的存活率；ns：P > 0.05，认为差异无统计学意义；*：相较于空白组，P < 0.05；**/***：相较于空白组，P < 0.01；##/###：相较于空白组，P < 0.01
3.3 乳酸环境下PMPs对A549细胞活力影响
通过CCK-8检测和细胞划痕实验结果表明，在乳酸调控下，PMP对A549细胞的增殖和迁移能力具有显著的促进作用。图3(c)显示，CCK-8检测中，各处理组(PMP组、Lat组和PMP + Lat组)与空白组相比，细胞的增殖能力显著增强。其中，PMP + Lat组的细胞增殖能力显著高于单独处理的PMP组或Lat组，差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，表明乳酸与PMP协同促进了A549细胞的增殖。图3(a)，图3(b)显示，划痕实验中，各处理组(PMP组、Lat组和PMP + Lat组)在24小时和48小时时的划痕闭合率均显著高于空白组(P < 0.05或P < 0.01)。尤其是PMP + Lat组，迁移率显著高于单独处理的PMP组或Lat组，表明乳酸环境增强了PMP对A549细胞迁移能力的促进作用。
(a)
(b) (c)
Figure 3. Photographs (a) and quantification (b) of the migration of A549 cells at different time points after the action of PMP in lactic acid environment, and (c) Survival rate through A549 cells; ns: P > 0.05, the difference was considered not statistically significant; *: P < 0.05 compared to the blank group; **/***: P < 0.01 compared to the blank group; ##/###: compared to the blank group. P < 0.01
图3. 乳酸环境下PMP作用后A549细胞在不同时间点迁移情况的照片(a)及定量(b)，(c)通过A549细胞的存活率；ns：P > 0.05，认为差异无统计学意义；*：相较于空白组，P < 0.05；**/***：相较于空白组，P < 0.01；##/###：相较于空白组，P < 0.01
3.4. 乳酸环境下PMPs作用后A549细胞上清液中生长因子浓度曲线
实验结果通过统计学分析表明，乳酸环境下，PMPs显著促进A549细胞释放VEGF和TGF-β (P < 0.01)。在VEGF中，PMP组释放量最高，其次为PMP + Lat组和Lat组，均显著高于CON组。在TGF-β中，Lat组释放量最高，其次为PMP + Lat组和PMP组，均显著高于CON组。结果证明乳酸环境下PMPs对VEGF和TGF-β的释放具有显著促进作用(图4)。
(a) (b)
Figure 4. PMP action significantly affected the concentration levels of VEGF and PDGF cytokines in the supernatant of A549 cells under lactic acid environment. ns: P > 0.05, the difference was considered not statistically significant; *: P < 0.05 compared to the blank group; **/***: P < 0.01 compared to the blank group
图4. 乳酸环境下，PMP作用显著影响了A549细胞上清液中VEGF和PDGF细胞因子的浓度水平。ns：P > 0.05，认为差异无统计学意义；*：相较于空白组，P < 0.05；**/***：相较于空白组，P < 0.01
4. 讨论
综上所述，本研究系统探讨了乳酸环境下血小板衍生微粒(PMPs)对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及生长因子释放的影响，同时分析了不同浓度乳酸对A549细胞增殖和迁移的独立作用。结果表明，乳酸不仅通过直接作用显著促进了A549细胞的增殖和迁移能力，而且在与PMPs的联合作用下进一步增强了对细胞生物学行为的促进效果。本研究的结果支持了乳酸作为肿瘤微环境重要调控因子的观点，揭示了PMPs在乳酸环境下对肿瘤细胞行为的显著促进作用，并强调了乳酸浓度梯度在肿瘤细胞增殖和迁移中的调控潜力。这不仅加深了对肿瘤微环境复杂作用机制的理解，还为开发基于乳酸和PMPs调控的靶向治疗策略提供了理论基础。然而，本研究仍存在一定局限性，例如对乳酸与PMPs协同作用的具体分子机制尚未深入解析，尤其是在信号通路层面的相互作用仍需进一步研究。未来工作可以结合多组学技术，系统探讨乳酸和PMPs在肿瘤微环境中调控肿瘤进展的分子机制，为临床干预和治疗策略的优化提供明确方向。
NOTES
*通讯作者。