靶向二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用

Application of Targeted Second-Generation Sequencing Technology in the Diagnosis of Infectious Diseases

摘要: 感染性疾病发病率、死亡率仍位居全球前列。早期、精准明确致病病原体对该疾病临床工作诊治尤为关键。传统病原学检测技术耗时长，且敏感度及特异度均低，容易遗漏某些常见病原体。因此为更好满足当今感染性疾病诊治的临床需求，需要寻找更敏感、高效、适用性强的病原学检测方法。靶向二代测序技术相对于传统检测技术而言，具有通量高、耗时短、无偏倚、成本较低等独特优势，能真实获得检出病原体的拷贝数，在感染性疾病诊断中具有重要参考价值。本文就靶向二代测序技术在感染性疾病诊断中应用进行综述。

Abstract: The incidence rate and mortality rate of infectious diseases are still among the highest in the world. Early and accurate identification of the pathogenic pathogen is particularly critical for clinical diagnosis and treatment of the disease. Traditional etiological detection techniques are time-consuming, with low sensitivity and specificity, and are prone to missing certain common pathogens. Therefore, in order to better meet the clinical needs of diagnosis and treatment of infectious diseases, it is necessary to find more sensitive, efficient, and applicable etiological detection methods. Compared with traditional detection technology, targeted next-generation sequencing technology has unique advantages such as high throughput, short time consumption, no bias, and low cost. It can truly obtain the copy number of pathogens detected, and has important reference value in the diagnosis of infectious diseases. This article reviews the application of targeted next-generation sequencing technology in the diagnosis of infectious diseases.

1. 引言

感染性疾病如今仍是全球死亡率及发病率最高的疾病之一，研究表明死于感染性疾病的人数全球每年约有1300~1500万人[1]。由于感染性疾病因细菌、病毒、真菌等病原微生物侵袭引起，具有特异性，因此，早期明确致病病原微生物并积极采用敏感有效治疗方案对感染性疾病诊治至关重要。传统病原学检测技术耗时长，且敏感度及特异度均低，容易遗漏某些常见病原体。因此为更好满足当今感染性疾病诊治的临床需求，需要寻找更敏感、高效、适用性强的病原学检测方法。

二代测序技术(next generation sequencing, NGS)又称高通量测序技术，能同时进行数百万到数十亿个单独的测序反应[2]。因具有通量高、检测时效短、无偏倚、成本较低等独特优势使其为病原学诊断打开了新大门，并应用在临床各领域疾病诊疗中[3]。其中靶向二代测序技术(Targeted next generation sequencing, tNGS)针对特定病原体基因序列进行高通量测序，真实获得检出病原体的拷贝数，而且能完美避开人类基因组及背景菌的影响。本文就靶向二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用进行综述。

2. 感染性疾病病原体检测现状

病原体检测标本主要包括呼吸道标本(如痰液、鼻咽分泌物、肺泡灌洗液、胸腔积液)、脑脊液、外周血、尿液等。常见检测方法有涂片染色镜检、分离培养、免疫学检测、分子生物学诊断等。其中“分离培养”仍是病原体诊断的金标准，但其检测耗时长、易受外在环境及药物使用影响，从而导致病原体阳性检出率低、缺乏敏感性，且病毒以及不典型病原体如支原体等不能经体外培养检出，使其不利于临床疾病的早期诊治[4]。涂片染色镜检主要应用于细菌及真菌检测，但在病毒检测方面具有局限性。免疫学检测方法包括免疫荧光试验、补体结合试验、凝集实验、酶联免疫测定等，其关键短板在于检测存在窗口期，易导致假阳性的发生。分子生物学诊断方法包涵核酸杂交、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)、基因芯片、测序技术[5]。核酸杂交、PCR以及基因芯片均依赖已知病原体的基因序列，在未知病原体检测方面具有局限性[6]。初代测序技术步骤繁琐，因难以实现自动化从而不能大规模应用。二代测序技术的出现，因其自身通量高的独特优势迅速取代初代测序技术并快速发展起来[7]。

3. 靶向二代测序技术简介

直至2005年，大规模平行DNA测序技术的应用标志着高通量测序时代正式开启[8]。随着测序仪的普及以及使用成本的降低使得该项技术得到广泛应用。NGS最常见的几种测序方式包括靶向二代测序(tNGS)、宏基因组二代测序(Metagenomic next generation sequencing, mNGS)、全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)等。其中tNGS技术是将超多重PCR扩增与高通量测序结合的新一代测序技术，通过对临床样本中数十种乃至数百种已知病原微生物、毒力和/或耐药基因直接进行富集、高通量测序，再通过与数据库进行对比分析，最后根据得到的序列信息判断样本中包含的病原微生物种类[7] [9]。其流程主要包括：(1) 核酸提取：从患者样本中提取包括人类、致病菌以及定植菌的DNA和/或RNA。(2) 文库构建：过程包涵合成cDNA、目标区域富集、文库扩增、文库纯化及质控[10]。常见方式有两种，其中超多重PCR扩增又称为扩增子测序，主要通过PCR方法，利用引物与目标基因特异性结合从而得到大量扩增的目标基因进行高通量测序；而靶向捕获则是利用设计的探针和目标基因序列杂交，将目标基因从基因组中富集出来，这是两种方式的不同之处[11] [12]。(3) 测序：利用高通量测序平台测序从而获得富集后的核酸序列信息。(4) 生信分析及报告解读：将测序数据与病原体数据库进行比对，从而识别出样本中的病原体种类。在操作过程中需注意实验前要完成相关消杀工作。在核酸提取过程中若出现液体溅出，应立刻予以纸张吸附，并用75%乙醇湿润后的吸水纸擦拭，擦干台面、更换手套后继续后续相关操作；若手套不小心误碰管盖内侧，则需立即更换新手套并将实验体系转管。在文库构建过程中加入磁珠、80%乙醇纯化时需小心吹打混匀，确保管盖盖紧，PCR完成后样本需短暂离心再开盖行下一步操作，并在每次开盖后更换新的八连管盖。实验结束后需分别对实验台、生物安全柜以及空气进行消毒。为确保检出率，针对重要病原体引物需设计5~7对(其中结核需7对)。为确保结果准确性，需使用特异性接头、质控和内参评估监控以及全流程拍照记录并双人核对。而针对最后报告解读，若单一标本仍无法判定是否为致病菌时，在条件允许时可结合多个不同类型标本的检测结果判断[13] [14]。相较于mNGS而言，tNGS针对特定病原体以及耐药基因信息进行超多重PCR扩增，同时兼顾DNA及RNA检测流程，大幅度降低了检测耗时及成本，并且排除了人源及背景菌群基因片段的干扰，真实反映出病原体的拷贝数[15] [16]。正是因为tNGS具备上述优势，且更易实现自动化、后期分析数据更简易，使得其在常规临床病原体检测中得到广泛应用，并在科研领域取得重大突破[17]。

4. tNGS在感染性疾病病原体诊断中的临床应用

4.1. tNGS在肺部感染中的应用

肺部感染常由单一或多种病原体侵袭引起，在全球发病率及死亡率仍居高位，因此及早明确致病病原体对疾病的诊治尤其重要[18]。王樱璇[10]等研究了132例感染肺炎的住院患儿，通过对比tNGS与常规微生物检测情况，发现在细菌(67.43% vs 8.33%)、病毒(83.32% vs 37.83%)、不典型病原体(92.42% vs 48.85%)以及混合感染(69.70% vs 5.30%)检出方面，前者均优于后者，同时指导了13例tNGS结果显示肺炎支原体耐药基因临床病例的二线用药。Lin R [19]等对47例肺部感染儿童肺泡灌洗液标本进行tNGS检测，与常规培养和抗菌药敏试验金标准检测做比较，发现tNGS敏感性(84.4%)及特异性(97.7%)均高于传统培养，同时以抗菌药敏试验为标准，发现tNGS检测出红霉素、四环素合格率分别为89.5%、79.0%。证明了tNGS在难以培养的病原体检测方面以及预测上述两种抗生素耐药性方面的优势。Sun W [20]等通过研究85例肺炎感染者肺泡灌洗液标本，指出在细菌及真菌检测方面tNGS (40.00%、10.00%)与mNGS (47.13%、18.85%)检测性能相仿，但在DNA病毒检出方面，如人类疱疹病毒，tNGS检出率总是优于mNGS。Huang Z [21]等对99例肾移植术后感染患者进行病因分析，发现93例均为肺部感染，通过行支气管镜检查留取其肺泡灌洗液进行tNGS、mNGS和传统病原学检测比较，发现在细菌、真菌检出方面，tNGS、mNGS阳性率均高于传统检测方法，传统方法未能检出病毒，mNGS病毒检出阳性率明显高于tNGS，但是总体来说这两种高通量检测技术阳性率相似。然而在敏感性方面mNGS明显优于tNGS (100% vs 93.55%)，且均比传统检测手法敏感性强。Yu L [22]等报告了首例通过tNGS技术诊断艾滋病患者感染耐热分枝杆菌的病例。该患者间断发热1月余、咳嗽黑便9天，入院后24天内抗HIV抗体呈强阳性，痰液送镜检及培养均阴性，最后通过行tNGS检测在4天内结果回报示耐热分枝杆菌1 × 10*⁶拷贝数，同时检测出无抗体突变，并予以敏感性药物对症治疗后，大幅度缩短了患儿治疗时间。传统抗酸染色法培养时间长，假阴性较多，而且无法区分结核与非结核分枝杆菌属。由此说明tNGS检测阳性率及精确度均胜于传统检测手法，在明确病原体效率及速度方面均具有重大优势。Zhang P [23]等对5例重症肺炎复杂感染患者进行病原学分析，发现未被培养物检测到的细菌及真菌在tNGS检测中呈阳性，提示tNGS敏感性更高，tNGS与mNGS相比检测结果约有80%的一致率高达90%，但相比而言前者能在检测过程中同时获得耐药基因数据。

4.2. tNGS在中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)感染中的应用

CNS常见感染致病病原体包括细菌、病毒、真菌、螺旋体以及寄生虫等，现如今明确其感染的病因仍是临床工作中常需面对的挑战，>50%的病例无法明确感染源[24]。Chen W [25]等对152例疑似传染性脑炎/脑膜炎患者取脑脊液同时行tNGS与mNGS检测，研究发现tNGS总体准确率(65.1%)高于mNGS (47.4%)，尤其在病毒检出中tNGS更加优于mNGS (65.2% vs 46.4%)，灵敏度也优于mNGS (64% vs 43.4 %)，这一结果表明tNGS将成为临床工作中明确CNS感染病原体颇有前景的检测方法。贾梦涵[26]等报道了81例病毒性脑炎/脑膜炎患者脑脊液病原体检出情况，指出tNGS、mNGS阳性率分别为25.93% (21/81)、40.00% (20/50)，两种高通量测序技术检测方法无明显差异，但均优于传统检测方法(8.64%)。通过对脑脊液蛋白、细胞数含量以mRS评分进行分组，表明为提高病原体检出率，CNS轻度感染者更推荐脑脊液细胞数含量高者行tNGS。Li J [27]等对35例遭遇颅脑创伤或疑似手术后颅内感染的患儿进行临床对照研究，比较tNGS与传统的脑脊液培养、涂片结果，发现前者敏感性和特异性分别为81.8%、76.9%，而传统脑脊液培养敏感性和特异性分别为13.6%、100%，表明tNGS检测高度准确性可以弥补传统检测敏感性低的不足，从而作为临床诊断颅内感染的一种良好辅助诊断方法。

4.3. tNGS在血流感染病原体诊断中的应用

一旦血流感染，病情往往易进展至重症，死亡率较高，因此为改善预后及降低病死率，尽早明确病原体并予以敏感性治疗至关重要[28]。李祥[29]等报道1例不明原因持续高热疑似血流感染的病例，入院后完善常规感染指标、肺部影像学、风湿结缔组织病等相关检查均未明确病因，联合抗生素运用下患儿体温仍控制不佳，后行血液tNGS检测，在入院第3天结果回报示布鲁菌属，并积极指导抗生素用药后患儿病情得到控制，于入院第7天传统检测结果才显示布鲁菌IgG抗体阳性、试管凝集试验1:400、平板凝集试验(+)，这证实了tNGS技术与传统方法相比检测精度、时效均更胜一筹。Lang X M [30]等报道了3例持续发热、淋巴结肿大、皮肤散在焦痂病例，完善常规病原学检测均提示阴性，较长时间联合抗感染治疗效果欠佳，通过采集血液样本进行tNGS检测最终明确羌虫病，立即予以奥玛环素治疗3~5天后好转出院，此结果表明tNGS检测敏感性优于常规检测方式，且能有效指导临床病原体诊治工作，从而缩短疗程、改善预后。Cai S [31]等通过对80名疑似血流感染患者同步完善血液tNGS、mNGS检测和血培养，最后得出tNGS敏感性(91.3%)均优于后两者(69.6%、23.2%)，而且tNGS周转时间相较于血培养、mNGS更快，但在检测特异性方面，tNGS与mNGS无明显差异(100% vs 81.8%)。Xu J H [32]等针对137名恶性血液病疑似感染患者完善tNGS及常规微生物检测明确致病菌，发现前者在敏感性、病原体谱检测准确性方面均优于后者(69.7% vs. 35.9%、66.5% vs 56.5%)，正因如此，它可作为常规病原学检测辅助手段，从而精确调整临床应用抗生素，减短治疗周期以及降低耐药率发生。

4.4. tNGS在其他部位感染中的应用

姚晓伟[33]等针对108例疑似骨关节布氏菌病患者取其病灶组织样本行tNGS，并进行病原体培养和清试管凝集试验，发现tNGS敏感性和特异性(76.92%和100%)均优于后者(32.05%和100%、64.10%和76.67%)，而且其检测耗时短、自动化可降低实验人员感染风险。Lv H [34]等通过对76例脊柱感染患者取组织病检，发现tNGS与mNGS检出情况均优于传统检测方式，且诊断时间均值显著小于细菌培养(1.65天vs 3.07天)，tNGS在结核病诊断方面，其敏感性和准确性(80%、87.5%)比mNGS (50%、68.8%)更突出。靳优[35]等研究表明慢性子宫内膜炎检测手段中tNGS与细菌培养、宫腔镜相比灵敏度更高，在罕见病原体检出方面优势更大。Poulsen S H [36]等研究表明在疑似腹内脓肿感染病例中，与传统标本培养(18%)相比，tNGS真阳性率(32%)更高，同时检测到致病菌种类更多，并且混合感染更常见。

5. tNGS存在的问题及展望

现如今，tNGS技术在临床明确病原学方面诊断价值越来越重要，应用也越来越广泛。但其应用方面也存在某些实际问题需要解决。首先由于tNGS针对的是已知病原体及耐药基因进行检测，所以它更适用于已知病原体的深层次研究或者针对特定临床场景进行精准诊断。而mNGS能无差别检测样本中所有微生物核酸，在发现罕见病原体方面要优于tNGS，甚至还能发现新发病原体[37]。更是有多项国内外专家共识指出，在危急重症、罕见疑难病方面更推荐使用mNGS，它在处理未知感染、复杂多重感染以及新兴传染病方面崭露头角[15] [38] [39]。其次，tNGS结果判读仍需结合临床，针对检测到的病原体，无法证实是致病菌、定植菌还是污染菌，临床还未针对所有微生物建立统一结果判读标准[40]。该项技术的运用还不能完全取代现有传统检测技术，但其可以与传统检测技术相互补充，尤其在疑难重症方面，更好为临床精准治疗保驾护航[41]。最后相比mNGS费用，若同时检测DNA和RNA需要花费数千元，而tNGS费用仅为mNGS的1/5至1/6，价格更便宜[7]。但相比于传统检测费用依旧偏高，需送至第三方检测机构，而且尚未纳入我国医疗保障系统，无法大规模应用于临床工作中。因此，传统检测方法基于价格更加便宜且易于操作，现依旧用于日常临床工作中，尤其在资源有限情况下。

但tNGS相对于目前其他检测技术而言优点十分突出，起初其结果分析需等待数天，相比于简单血清学检测数小时完成而言时间较长，但随着技术进步，如今基本可在24小时内获得序列报告，比传统培养时间更短。

相信在今后通过不断提高该项技术操作全自动化、分析数据简便性，降低检测成本，能越来越广泛地应用于感染性疾病的诊断工作中，从而更早实现感染性疾病精准治疗，缩短治疗周期，提高治愈率以及改善预后。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。