胃癌组织中PD-L1与肿瘤相关成纤维细胞表达的关系

Relationship between the Expressions of PD-L1 and Tumour-Associated Fibroblasts in Gastric Cancer

摘要: 以往的研究主要集中在肿瘤细胞在免疫逃逸中的变化，而对肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)对免疫逃逸的影响知之甚少。肿瘤相关成纤维细胞(tumor-associated fibroblasts, TAFs)是TME的重要组成部分，具有特殊的生理生化特性，但其具体机制尚不清楚。为了研究TAF对胃癌细胞PD-L1表达的影响，通过transwell将胃癌细胞株MNK45、SGC7901与TAFs非接触共培养1、3、7 d。采用qRT-PCR和流式细胞仪检测PD-L1 mRNA和蛋白表达。然后选择95例胃癌组织，通过免疫组化检测PD-L1和TAFs的表达。结果显示，实验组PD-L1 mRNA和蛋白表达量均显著高于对照组。胃癌中PD-L1的表达与大量淋巴细胞浸润、弥漫性/混合性组织学和瘤内TAFs有关。综上所述，TAFs通过提高PD-L1的表达促进胃癌细胞株的生长。

Abstract: Previous studies have focused on the changes of tumour cells in immune escape, and less is known about the effect of the tumour microenvironment (TME) on immune escape. Tumour-associated fibroblasts (TAFs) cells are an important part of the TME and have special physiological and biochemical characteristics, but the specific mechanism has not been clarified. In order to investigate the effect of TAFs on the expression of PD-L1 in gastric cancer cells, gastric cancer cell lines MNK45, SGC7901 were non-contact coculturing with TAFs 1, 3 and 7 d via transwell. PD-L1 mRNA and protein expression were detected using qRT-PCR and FCM. Then, 95 cases of gastric cancer tissues were selected and PD-L1 and TAFs expressions were determined by immunohistochemical examination. The results showed that the mRNA and protein expression of PD-L1 in the experiment group were significantly higher than that in the control group. PD-L1 expression was associated with massive lymphocyte infiltration, diffuse/mixed histology and intratumoral TAFs in gastric cancers. In conclusion, TAFs promoted the growth of gastric cancer cell lines by increasing the PD-L1 expression.

1. 引言

胃癌(Gastric cancer, GC)是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，尤其是在韩国、日本和中国等东亚国家[1]-[3]。晚期GC的预后是严重的，即使使用化疗或其他辅助治疗[4]-[6]。肿瘤细胞可以逃避免疫监视。以往的研究主要关注肿瘤细胞在免疫逃逸中的变化，但对肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)对免疫逃逸的影响知之甚少[7]-[9]。

肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts, TAFs)是微环境基质中最重要的宿主细胞，参与细胞外基质构建和肿瘤集落发育[10] [11]。与正常组织成纤维细胞相比，TAFs具有明显不同的形态和蛋白表达模式[12]。例如，TAFs表达a-SMA和vimentin，分泌TGF-b、PDGF、FGF、VEGF、IL-11、IL-6和细胞外基质成分，可促进癌细胞生长，诱导肿瘤血管生成，增强转移和侵袭[13]-[15]。现在很清楚，不仅在肿瘤细胞和免疫细胞之间，而且在其他基质细胞(如TAFs和免疫细胞)之间也存在持续地串扰。由于它们在肿瘤微环境中的优势，TAFs最近被研究作为免疫细胞募集和功能调节剂的功能。

程序性死亡因子1 (Programmed death factor 1, PD-1)及其配体PD-L1/PD-L2是负调控因子，在肿瘤逃逸宿主免疫应答中起着非常关键的作用[16]-[20]。PD-L1在肿瘤患者中的表达与浸润深度、淋巴转移、病理类型及总生存期有关。PD-L1单克隆抗体在黑色素瘤和非小细胞肺癌等肿瘤中疗效良好，但对消化系统肿瘤疗效较差[21]-[23]。最近，有报道称PD-L1在TAFs [24]中表达。TAFs可以通过产生生长因子和趋化因子影响肿瘤生长[25] [26]。

为了阐明肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞对肿瘤细胞免疫特性的影响，我们通过构建胃癌细胞系与胃癌相关纤维细胞共培养体系，观察免疫抑制分子PD-L1的表达，进而观察胃癌临床病理参数与TAFs相关PD-L1表达的关系。

2. 材料与方法

2.1. 组织样本和细胞系

收取来自毓璜顶术前未接受放疗或化疗的胃癌组织及邻近正常组织95例。所有这些组织在手术后立即在液氮中快速冷冻。本研究获得毓璜顶医院伦理委员会批准(2016081206)。

2.1.1. 细胞培养

人胃癌细胞系(SGC7901和MNK45)购自中国科学院(中国上海)型培养库，保存在添加10%胎牛血清(FBS; Hyclone, USA)，100 U/mL青霉素和100 ng/mL链霉素，温度37℃，温度5%，空气95%。

人胃TAFs来源于95例GC患者的手术组织。TAFs来源于肿瘤胃壁，正常成纤维细胞来源于非肿瘤胃壁。新鲜标本用含有100 U/mL青霉素和100 lg/ mL链霉素的PBS洗涤三次，切成小块，用胶原酶i消化，离心后用PBS冲洗细胞，将微球重新悬浮在添加10%FBS的DMEM中，转移到100 mm的培养皿中。这些细胞系在含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640或DMEM中培养。在共培养实验中，细胞系在RPMI 1640中培养。

2.1.2. 细胞共培养模型

人胃癌细胞(SGC7901和MNK45)和TAFs通过transwell (康宁生命科学公司，Acton，MA，USA)进行非接触体外共培养。两个腔室由孔径为0.4 lm和4.5 cm²的半透膜(BD Biosciences)隔开。人胃癌细胞(SGC7901和MNK45)以3 × 10⁵ cells/ml在transwell插入物的上腔中10⁵ cells/ml。下腔在TAFs细胞中以5 × 10⁵ cells/ml或含有正常成纤维细胞，密度为5 × 10⁵ cells/ml (对照组)。

2.1.3. 细胞增殖试验

alamarBlue法检测细胞增殖情况。培养1、3、7 d后，更换培养基为培养基1640 (GIBCO, Carlsbad, CA, USA)，培养基中添加10% FBS和10% alamarBlue。细胞在5% co₂ v的湿化气氛中37℃孵育4 h，用微孔板阅读器(MQX200)在570 nm处读取培养基的光密度(OD)。

2.1.4. 逆转录和实时荧光定量PCR

使用TRIzolVR试剂(Invitrogen, CA, USA)根据制造商的说明从细胞中提取总RNA。使用Prime Script RT Reagent Kit (TaKaRa，大连，中国)进行定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析。PD-L1引物为：forward，5-0-AAATGGAACCTGGCGAAAGC-30；相反，5-0-GATGAGCCCCTCAGGCATTT-30；GAPDH mRNA引物为：正向，5-0-acggattttggtcgtatggg-30；相反，5-0-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-30。

2.1.5. PD-L1蛋白表达

FCM分析实验组和对照组PD-L1的表达。收集共培养或对照培养的细胞，用FCM缓冲液(含5% FBS和0.1% NaN₃的PBS)洗涤两次。用荧光素标记抗体或同型对照抗体在4℃下孵育30分钟后，用FCM缓冲液洗涤细胞，并在Beckman coulter FC500上使用submit5.2软件(Beckman coulter, USA)进行分析。

2.1.6. 免疫组织化学染色

按照常规方案[27]进行免疫组化。石蜡包埋的标本切片，厚度为4 lm，在63℃的干炉中孵育1 h，然后进行脱石蜡和补液。切片用以下一抗孵育：兔抗人PD-L1 (克隆ab82059，abcam，UK；1:100)，单克隆小鼠抗人a-sma (克隆4B12，Dako，丹麦；1:80)，室温处理1 h。阴性对照用小鼠IgG同型抗体替代特异性抗体(Sigma, St. Louis, MO, USA)。

2.2. 统计分析

所有统计分析使用SPSS 18.0软件进行。所有数值均表示为每组至少三次重复个体实验的平均值 ± 标准差。两组差异采用t检验分析，PD-L1表达与其他临床病理特征的相关性采用person’s卡方检验和Fisher’s精确检验。当p < 0.05时，认为差异显著。

3. 结果

3.1. TAFs和NFs原代培养及其特性

免疫荧光染色法测定成纤维细胞标志物、纤维连接蛋白(FN)和a-平滑肌肌动蛋白(SMA)。结果显示FN在TAFs和NFs细胞中均呈阳性表达。此外，a-sma在TAFs中高表达，是肌成纤维细胞的生物标志物(图1)。进一步分析表明，与TAFs共培养的胃癌细胞比对照组生长更快(图2)。

Figure 1. Characterization of tumur-associated fibroblasts (TAFs) and normal fibroblasts (NFs). The primary cultures of TAFs and NFs were isolated from the Tumour tissue and the adjacent norma lgastric mucosa. Fibronectin (FN), the fibroblast biomarker, is universally expression in TAFs and NFs.a-smooth muscle actin (a-SMA), the biomarkr of the activate fibroblast is a high level expression in TAFs and weak expression in NF

图1. 肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)和正常成纤维细胞(NFs)的表征。从肿瘤组织和邻近的正常胃黏膜中分离TAFs和NFs原代培养物。纤维连接蛋白(FN)是成纤维细胞的生物标志物，在TAFs和NFs中普遍表达。a-平滑肌肌动蛋白(a-sma)是激活成纤维细胞的生物标志物，在TAFs中高表达，在NF中表达较弱

3.2. PD-L1在胃癌细胞中的表达

我们进一步利用qRT-PCR和流式细胞术评估PD-L1表达对共培养胃癌细胞系的影响TAFs组和对照组结果显示，与TAFs共培养的胃癌细胞株中，PD-L1 mRNA的表达呈时间依赖性显著升高。同样，PD-L1的蛋白表达也表现出类似的结果(图3)。

3.3. PD-L1在胃癌组织中的表达

评价PD-L1在胃癌组织中的表达水平，并分析其与胃癌患者临床及病理的关系。PD-L1水平与性别(p = 0.845，表1)、肿瘤部位(p = 0.123，表1)、肿瘤侵袭(p = 0.634，表1)、转移(p = 0.476，表1)和肿瘤–淋巴结–转移(TNM)分期(p = 0.675，表1)之间无显著差异。PD-L1表达与年龄呈正相关(p = 0.023，表1)，PD-L1表达与肿瘤淋巴结状态呈负相关(p = 0.035，表1)。

Figure 2. The gastric cancer cells grew faster when co-cultured with TAFs. The proliferation of SGC7901 (A) and MNK45 (B) cells were tested by a lamarBlue assay at 1, 3 and 7 d of culture. There was a significant increase in the viability of gastric cancer cells at 3 and 7 d of co-cultured with TAFs

图2. 与TAFs共培养时，胃癌细胞生长更快。培养1、3、7 d时，采用alamarBlue法检测SGC7901 (A) 和MNK45 (B) 细胞的增殖情况。在与TAFs共培养的第3天和第7天，胃癌细胞的活力显著增加

3.4. PD-L1表达与TAFs密度的关系

53例(82%) TAFs PD-L1阳性，细胞质内呈散点状染色。肿瘤内TAFs密度与肿瘤细胞PD-L1表达呈显著正相关(p = 0.027，表1)，TAFs与年龄(p = 0.013，表2)、TNM分期(p = 0.025，表2)也呈正相关。

Figure 3. The PD-L 1mRNA and prote in expression in SGC7901cell (A, C) and MNK45 cell (B, D). The expression of PD-L-1 of gastri cancer cells when co-cultured With TAFs were significantly increase dinatime-dependent compared with the control groups

图3. PD-L1 mRNA和蛋白在SGC7901细胞(A, C)和MNK45细胞(B, D)中的表达。与对照组相比，与TAFs共培养时胃癌细胞PD-L1的表达呈时间依赖性显著增加

Table 1. Correlation between PD-L1 expression and clinicopathological factors.

表1. PD-L1表达与临床病理因素

Characteristics	N	PD-L1		p
		PD-L1 (+)	PD-L1 (−)
Gender				0.845
Male	57	37	20
Female	38	28	10
Age				0.023^*
≤60	50	40	10
>60	45	25	20
Tumour site				0.123
Antral	60	42	18
Proximal	35	23	12
Invasion				0.634
T1	25	18	7
T2	20	17	3
T3	26	13	13
T4	24	17	7
Nodal status				0.035^*
N0	42	26	16
N1	13	9	4
N2	21	15	6
N3	19	15	4
Metastasis				0.476
Yes	5	4	1
No	90	61	30
TNM staging				0.675
I	32	25	7
II	26	17	9
III	30	17	13
IV	7	6	1
Lauren classification				0.032^*
Intestinal type	40	25	15
Diffuse/mixed type	55	40	15
Tumour-associated fibroblasts				0.027^*
Low	30	12	18
High	65	53	12

Table 2. Correlation between PD-L1 expression and density of ATFs

表2. PD-L1表达与ATFs密度的相关性

Characteristics	N	PD-L1 on tumor-associated fibroblasts		p
		Positive	Negative
Gender				0.645
Male	37	17	20
Female	28	18	10
Age				0.013^*
≤60	40	30	10
>60	25	5	20
Tumour site				0.323
Antral	42	22	20
Proximal	23	13	10
Invasion				0.634
T1	18	10	8
T2	17	7	10
T3	13	7	6
T4	17	11	6
Nodal status				0.635
N0	26	12	14
N1	9	7	2
N2	15	7	8
N3	15	9	6
Metastasis				0.476
Yes	4	2	2
No	61	33	28
TNM staging				0.025^*
I	25	20	5
II	17	9	8
III	17	3	14
IV	6	3	3
Lauren classification				0.132
Intestinal type	25	10	15
Diffuse/mixed type	40	25	15

4. 讨论

胃癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，特别是在东亚国家比如韩国、日本和中国。肿瘤细胞可以逃脱免疫监视。以往的研究主要关注肿瘤细胞在免疫逃逸中的变化，对肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)对免疫逃逸的影响知之甚少[28]-[30]。

在癌症发展的早期阶段，肿瘤基质中各种类型的细胞阻止肿瘤生长。相反，这些基质细胞中的大多数在晚期阶段促进肿瘤进展[31]。TAFs通过分泌多种可溶性因子发挥关键作用[32]-[34]。已有研究表明，TAFs的患病率与胃癌转移的可能性密切相关[35]。此外，成纤维细胞产生的TGF-b和FGF-7可增加胃癌细胞的增殖和侵袭性[36] [37]。一些报道也表明，TAFs与癌细胞共培养时表达MCP-1/CCL2，并诱导细胞存活和免疫抑制[26] [38]。总之，相关结果表明，在肿瘤发生的初始阶段，TAFs首先由免疫细胞调控，但随着肿瘤的进展，它们获得招募和调节免疫细胞的能力，最终达到与疾病进展相容的免疫抑制。然而，在TAFs与癌细胞之间的直接相互作用中，癌症免疫逃逸的重要因素仍然未知。

免疫耐药是多种人类癌症有效肿瘤生物治疗选择的主要障碍之一。PD-L1是肿瘤微环境中的关键蛋白，可能促进肿瘤细胞的免疫逃逸[39]。目前已知，PD-L1在癌细胞中的过表达可诱导肿瘤逃避宿主T细胞[40] [41]。据报道，阻断PD-1/PD-L1相互作用或下调PD-L1在癌细胞中的表达可促进抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长[41]。PD-L1表达的调控在很大程度上仍然未知。在本研究中，我们报道了共培养的TAFs能够以时间依赖性的方式上调人胃癌细胞系中PD-L1的表达，并诱导癌细胞增殖。瘤内TAFs密度与肿瘤细胞PD-L1表达呈显著正相关(p = 0.027)。结合以往的结果，这表明TAFs在癌细胞中诱导PD-L1表达是一种常见的效应。

既往研究表明，免疫组化PD-L1在102例人胃癌中呈强阳性表达，在腺瘤样本中呈弱阳性表达，在正常胃组织[42]中呈完全阴性表达。此外，PD-L1的表达与更高的淋巴结转移数量、更大的肿瘤大小、更大的浸润深度和更差的总生存期显著相关。同样的结果显示，在研究过程中开发的一种抗PD-L1单克隆抗体可显著减少PD-L1过表达[43]诱导的t细胞凋亡。

多项临床试验表明，用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1通路具有抗肿瘤作用[44] [45]。在浸润性导管癌(p = 0.012) [45]、尿路上皮癌(p < 0.001) [29]和肝内胆管癌(p < 0.001) [29]中，肿瘤细胞过表达PD-L1。在我们的研究中，PD-L1的表达与年轻(p = 0.023)和弥漫性/混合型(p = 0.032)显著相关。PD-L1表达与肿瘤淋巴结状态呈负相关(p = 0.035)。然而，PD-L1的表达与性别、肿瘤部位、肿瘤侵袭转移及TNM分期无统计学关系。可能的原因是PD-L1阳性病例相对较少。相似结果显示，在非小细胞肺癌中，PD-L1的表达与临床分期/生存率之间没有统计学关系[46] [47]。

在正常人体中，PD-1和CD28处于动态平衡状态，但PD-1及其配体在肿瘤患者[45]中高表达。高表达PD-L1的肿瘤细胞抑制cd8 + T细胞的增殖和功能。同时，PD-L1的高表达也抑制NK细胞和B细胞的增殖和功能[48]。在PD-L1刺激下，Treg细胞增殖能力增强，功能上调[49]。上述所有发现都导致肿瘤逃避免疫监视，促进肿瘤生长。因此，为了充分阐明PD-L1与GC患者预后的关系，未来需要进一步探索其潜在机制。

总之，我们已经证明，PD-L1的表达在与TAFs共培养的胃癌细胞系中以时间依赖性的方式显着增加。大多数GC患者(68%)发现pd-l1阳性肿瘤细胞，并且与TAFs密度相关(82%)。此外，我们的研究发现PD-L1表达与GC中大量淋巴细胞浸润、弥漫性/混合性组织学和瘤内TAFs有关。综上所述，阻断肿瘤PD-L1有望增强免疫治疗的效果。

伦理审批和同意参与

本研究经山东大学(济南，中国)机构动物护理与使用委员会批准。

数据和材料的可获得性

本研究中使用和/或分析的数据集可应通讯作者的合理要求获得。

基金项目

山东省医药卫生科技发展计划项目(202104010626)支持。

NOTES

^*通讯作者。