1. 引言
CAG是慢性胃炎的一种类型，指多种病因导致胃黏膜上皮在反复损伤后，尤其是幽门螺旋杆菌感染后，导致固有腺体减少，并可能伴随纤维组织替代、肠腺化生和/或假幽门腺化生的慢性胃部疾病[1]。这种状况会导致胃酸分泌减少，影响消化功能，并可能引发一系列腹痛、反酸、腹胀、上消化道出血等症状和并发症[2]。CAG的治疗期望是延缓或阻止病变进展，降低癌变风险，并改善患者的临床症状。西医治疗主要集中在改善胃黏膜炎症，延缓疾病进展。根据临床症状使用促动力药物、消化酶制剂和抑酸药来缓解症状。对于有明显精神因素的患者，可加用抗抑郁或抗焦虑药物。对于幽门螺杆菌(HP)感染阳性的患者，根除HP仍然是治疗CAG和肠化最基本的方法。对于确诊为高级别上皮内瘤变的患者，应采取内镜下治疗或手术治疗[3]。
中医古籍中并无CAG病名，据其症状可归属于“胃痞”“胃痛”“吐酸”“嘈杂”等范畴。其病因多与饮食失宜、情志失调、劳逸失常、先天禀赋不足及外感六淫相关，气机升降密切关联[4]。砂仁为姜科植物阳春砂仁、绿壳砂仁和海南砂仁的成熟时实或种子，《本草求真》称为醒脾调胃之要药，《本草纲目》提及砂仁为“和脾行气，消食逐寒，除霍乱，止恶心，消胀满……治脏寒之泻……”，《本草汇言》：“砂仁，温中和气之药也”，《中国药典》中提出辛，温。归脾、胃、肾经，有化湿开胃，温脾止泻之功效[5]。白蔻为姜科植物白豆蔻或爪哇白豆蔻的干燥成熟果实。《本草求真》称“肺家散气要药；其辛温香窜，流行三焦，温暖脾胃”《本草求原》：“理脾胃元气”，《中国药典》中提出辛，温。归肺、脾、胃经，有化湿行气，温中止呕，开胃消食之效[6]。《证治准绳·女科》中翻胃吐食可用太仓丸，由白豆蔻 二两、砂仁 二两、丁香 一两、陈仓米(土炒) 一升组成，主治：脾胃虚弱，不进饮食。反胃呕吐。
2. 方法与材料
2.1. 收集药物中的活性成分及其潜在靶点
运用中药系统药理数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)进行药物组成药物的活性成分的筛选。以药物“砂仁、白蔻”为检索词，根据药代动力学特征ADME (吸收、分配、代谢和排泄)，设定筛选条件：以口服生物利用度(OB) ≥ 30%，类药性指数(DL) ≥ 0.18，将砂仁、白蔻的有效活性成分及其作用靶点统一整合，得到砂仁、白蔻有效成分及其相关靶向基因及其作用的靶点[7]。
2.2. 药物治疗CAG靶点的相关基因筛选
通过GeneCards数据库，以“Chronic Atrophic Gastritis，CAG”作为关键词检索，获取所有CAG疾病靶点基因。使用R语言Venn包，将药物作用靶点基因与CAG的相关基因取交集，即得到药物治疗CAG形成的目标靶点基因。
2.3. 蛋白互作网络构建及核心靶点基因的筛选
将砂仁、白蔻治疗CAG的目标靶点基因导入String数据库，设置以下参数：物种为“Homosapiens (人类)”，最低作用分数设置为0.7，并且隐藏所有孤立蛋白节点，即得到砂仁、白蔻治疗CAG的蛋白互作网(Protein-Protein Interaction Network, PPI)。
2.4. 药物–成分–靶点–疾病互作网络的构建
将药物–有效活性成分–靶点基因–疾病形成数据导入Cytoscape 3.9.1软件，利用Cytoscape软件中的NetworkAnalyzer工具计算网络的拓扑学性质，经调整得到“有效活性成分–靶点基因–CAG”网络调控关系图。
2.5. GO和KEGG富集分析
将砂仁、白蔻与CAG的相关靶点使用R clusterProfiler4.6.2包分别进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，GO富集分析以P < 0.05为筛选条件，选取结果中P值小于0.05的前10个生物学条目绘制条形图。KEGG富集分析同样以P < 0.05为显著富集筛选条件，选取P < 0.05的前20条信号通路绘制气泡图进行可视化分析。
2.6. 分子对接
一般而言，在一个网络中Degree值越高，它的地位也就越重要。也就是说在蛋白相互作用网络中Degree值越靠前的蛋白在药物治疗CAG中发挥着重要作用。利用AutoDock Vina (1.1.2)对活性成分和关键靶点进行分子对接，验证其相互作用活性。具体方法如下：1) 从TCMSP官网下载mol2格式的化合物，然后倒入Chembio3D进行能量最小化，然后导入AutodockTools-1.5.6加氢、计算电荷、分配电荷、设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式；2) 从PDB (http://www.rcsb.org/)数据库下载关键靶点蛋白(人源蛋白优先，原始配体与要对接的活性成分结构相似度高的优先，选取分辨率高的)；3) 将蛋白倒入PyMoL (2.3.0)去除原始配体和水分子，然后将蛋白导入AutoDocktools (v1.5.6)进行加氢、计算电荷、分配电荷、指定原子类型并保存为“pdbqt”格式；4) 使用POCASA 1.1预测蛋白结合位点，格点盒子的大小设定为60 × 60 × 60 (每个格点的间距为0.375Å)，其余参数为默认设置。5) 利用PyMOL2.3.0进行相互作用模式分析[8]。
3. 结果与分析
3.1. 砂仁、白蔻活性成分的筛选
通过TCMSP检索砂仁、白蔻的化学成分，经过筛选后，以口服生物利用度(OB) ≥ 30%，类药性指数(DL) ≥ 0.18，有效成分见下表(表1)。
Table 1. Main active components of Amomi Fructus—Amomi Fructus Rotundus in treating CAG
表1. 砂仁–白蔻药对治疗CAG的主要活性成分
活性成分ID |
英文全称 |
MOL000130 |
CAM |
MOL000196 |
L-Bornyl acetate |
MOL000118 |
(L)-alpha-Terpineol |
MOL007536 |
Stigmasta-5,22-dien-3-beta-yl acetate |
MOL000125 |
(-)-alpha-Pinene |
MOL000199 |
Safrol |
MOL000126 |
(-)-nopinene |
MOL003975 |
icosa-11,14,17-trienoic acid methyl ester |
MOL000449 |
Stigmasterol |
MOL000119 |
ZINC02040970 |
MOL001973 |
Sitosteryl acetate |
MOL000198 |
(R)-linalool |
MOL000122 |
1,8-cineole |
MOL007514 |
methyl icosa-11,14-dienoate |
MOL001771 |
poriferast-5-en-3beta-ol |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
MOL001755 |
24-Ethylcholest-4-en-3-one |
MOL000019 |
D-Camphene |
MOL007535 |
(5S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R,4R)-4-ethyl-1,5-dimethylhexyl]-10,13-dimethyl-2,4,5,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,6-dione |
MOL007180 |
vitamin-e |
MOL000193 |
(Z)-caryophyllene |
MOL000117 |
Cymol |
MOL000128 |
NERYLACETATE |
MOL000105 |
protocatechuic acid |
MOL000197 |
Myrcene |
MOL000130 |
CAM |
MOL000196 |
L-Bornyl acetate |
MOL000118 |
(L)-alpha-Terpineol |
MOL007536 |
Stigmasta-5,22-dien-3-beta-yl acetate |
MOL000125 |
(-)-alpha-Pinene |
MOL000199 |
Safrol |
3.2. 活性成分及疾病相关靶点收集
将PERL转化得到的砂仁、白蔻靶基因，与GeneCards数据库挖掘到的CAG的靶基因进行筛选去重，获得10个砂仁、白蔻与CAG的交集靶点，绘制韦恩图如下(图1)。
Figure 1. Venn diagram of Amomi Fructus—Amomi Fructus Rotundus-CAG intersection target
图1. 砂仁–白蔻药对与CAG交集靶点韦恩图
3.3. “药物–成分–主要靶点–通路–疾病”网络
将砂仁、白蔻主要靶点及疾病和相关通路导入Cytoscape 3.9.0中进行可视化处理，构建“药物–成分–靶点–疾病”网络图(图2)。其中同一活性成分可能对应不同靶点，不同活性成分也可能对应同一靶点，这表明砂仁、白蔻是通过多成分多靶点作用于CAG。
Figure 2. Chinese medicine-active ingredient-target network diagram
图2. 中药–活性成分–靶点网络图
3.4. PPI网络图构建及关键靶点筛选
将10个交集靶点导入String数据库进行分析，得到PPI蛋白互作图，如图(图3、图4)。
Figure 3. PPI network diagram of potential targets of Amomi Fructus—Amomi Fructus Rotundus in the treatment of CAG
图3. 砂仁–白蔻药对治疗CAG的潜在靶点PPI网络图
Figure 4. Key targets of Amomi Fructus—Amomi Fructus Rotundus in the treatment of CAG
图4. 砂仁–白蔻药对治疗CAG的关键靶点
3.5. 对药物治疗CAG交集靶点的GO分析结果
使用R软件将筛选出的核心靶标基因转化为ID，在R软件中输入ID文件，进行GO富集分析，从而获得相关生物学过程及信号通路，使用R软件将富集分析出的结果转化为条形图，如图(图5)。
Figure 5. GO functional enrichment analysis of potential targets of Amomi Fructu—Amomi Fructus Rotundus in the treatment of CAG
图5. 砂仁–白蔻药对治疗CAG的潜在靶点GO功能富集分析
3.6. KEGG代谢通路富集分析
对靶点进行KEGG通路富集分析，纵坐标为不同KEGG通路，气泡大小为基因个数，横坐标为fold enrichment，颜色深浅同样为−lg(P)，本研究选取下载结果中P < 0.05，前20条通路绘制气泡图进行可视化分析，如图所示(图6)。
Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of Amomi Fructus—Amomi Fructus Rotundus in the treatment of CAG
图6. 砂仁–白蔻药对治疗CAG的KEGG通路富集分析
3.7. 活性成分–靶蛋白分子对接分析
根据前文的分析可知选取前5个重要靶点与度值较高的化合物进行半柔性对接，通过结合能(affinity)来表示小分子与靶蛋白结合的好坏，结合能小于0代表小分子与靶蛋白可自由结合，值越小结合的可能性也就越高[9]。
对接结果表明小分子均能进入靶蛋白的活性中心，选取与每个蛋白对接最好的小分子作图进行展示；beta-sitosterol与BCL2的GLN-79形成氢键，氢键的长度为2.2Å；Stigmasterol与CASP3的PHE-250形成氢键，氢键的长度为3.1Å；beta-sitosterol与CASP9的LYS-398、TYR-397、ILE-396形成氢键，氢键的长度分别为2.2Å、2.6Å、2.5Å；Stigmasterol与PGR的LYS-731形成氢键，氢键的长度为2.4Å；beta-sitosterol与PTGS1的ARG-83形成氢键，氢键的长度为2.3Å、1.9Å，对接结果详见下表(表2，图6~图11)。
Table 2. Docking results of core small molecules and core target proteins
表2. 核心小分子与核心靶蛋白对接结果
靶点 |
PDB ID |
化合物 |
结合能(kcal/mol) |
靶点 |
PDB ID |
化合物 |
结合能(kcal/mol) |
BCL2 |
5FCG |
MOL000126 |
−5.7 |
CASP3 |
4JJE |
MOL000126 |
−5.7 |
|
|
MOL000193 |
−6.5 |
|
|
MOL000193 |
−6.6 |
|
|
MOL000198 |
−5.1 |
|
|
MOL000198 |
−4.7 |
|
|
MOL000358 |
−7.5 |
|
|
MOL000358 |
−7.4 |
|
|
MOL000449 |
−7.4 |
|
|
MOL000449 |
−7.5 |
CASP9 |
1NW9 |
MOL000126 |
−4.9 |
PGR |
1SQN |
MOL000126 |
−5.8 |
|
|
MOL000193 |
−5.5 |
|
|
MOL000193 |
−7.8 |
|
|
MOL000198 |
−4.4 |
|
|
MOL000198 |
−5.3 |
|
|
MOL000358 |
−7 |
|
|
MOL000358 |
−8.5 |
|
|
MOL000449 |
−6.9 |
|
|
MOL000449 |
−8.6 |
PTGS1 |
6Y3C |
MOL000126 |
−5.2 |
|
|
|
|
|
|
MOL000193 |
−6.8 |
|
|
|
|
|
|
MOL000198 |
−5.9 |
|
|
|
|
|
|
MOL000358 |
−8.8 |
|
|
|
|
|
|
MOL000449 |
−8.3 |
|
|
|
|
Figure 7. Analysis of interaction pattern between beta-sitosterol and BCL2 protein
图7. beta-sitosterol与BCL2蛋白相互作用模式分析
Figure 8. Analysis of interaction patterns between Stigmasterol and CASP3 protein
图8. Stigmasterol与CASP3蛋白相互作用模式分析
Figure 9. Analysis of interaction pattern between beta-sitosterol and CASP9 protein
图9. beta-sitosterol与CASP9蛋白相互作用模式分析
Figure 10. Analysis of interaction patterns between Stigmasterol and PGR proteins
图10. Stigmasterol与PGR蛋白相互作用模式分析
Figure 11. Analysis of interaction pattern between beta-sitosterol and PTGS1 protein
图11. beta-sitosterol与PTGS1蛋白相互作用模式分析
4. 小结
根据“药物–活性成分–作用靶点”网络、PPI网络及分子对接结果，发现BCL2、CASP9、PTGS1、CASP3、PGR等在网络中具有重要的地位，推测砂仁–白蔻药对可能通过这些靶点起到治疗CAG的作用。
BCL2家族调节蛋白中的创始成员，可通过诱导凋亡(促凋亡)或者抑制凋亡(抗凋亡)来调节细胞凋亡。CASP9和CASP3是caspase家族的成员，该家族的蛋白酶在细胞凋亡信号传导途径中扮演关键角色。CASP9和CASP3可产生级联反应，一旦CASP9被激活，它会进一步激活执行者CASP3，这些执行者会切割细胞内的关键蛋白质，导致细胞结构和功能的破坏，最终导致细胞凋亡。CAG伴肠化是常见的癌前病变，砂仁–白蔻药对可能通过BCL2、CASP9、CASP3等靶基因，起到抑制肠化生向胃癌进展的作用。PGR是一种与孕激素结合并在体内发挥生物学效应的蛋白质。大量研究表明，雌激素在调节胃肠功能和影响胃癌发生发展中发挥重要作用。PTGS1也被称为环氧化酶1 (Cyclooxygenase-1, COX-1)，是编码催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶之一的基因。在胃黏膜中表达较高，产生的前列腺素有助于保护胃黏膜免受损伤。在肿瘤进展过程中，PTGS1可能促进细胞增殖，因此其在癌症治疗中的潜在也是一个研究热点。
根据GO分析，大多数靶点集中在激素调控和代谢过程相关的生物学过程中，这些过程与炎症、免疫及神经递质水平调节密切相关。KEGG通路富集分析显示，前20条通路主要涉及神经调节、免疫炎症及内分泌调节。
本研究通过网络药理学和分子对接技术对白蔻－砂仁药对治疗CAG的潜在物质基础和分子机制、作用通路进行了探讨，体现了其多成分、多靶点、多途径治疗的特点，为进一步深入探究白蔻－砂仁药对的药理作用机制提供了新思路，但其结果仍需后续的基础研究进行验证。
NOTES
*通讯作者。