Alisol A抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭

Alisol A Inhibited the Proliferation, Migration, and Invasion of Nasopharyngeal Carcinoma Cells

摘要: 目的：Alisol A是从泽泻中分离得到的具有生物活性的三萜类化合物，具有抗癌潜能。本研究旨在探讨Alisol A对鼻咽癌细胞生长的影响。方法：MTT实验、集落形成实验、流式细胞术、transwell实验、伤口愈合实验分别检测细胞活力、增殖、细胞周期、迁移、侵袭。结果：Alisol A可抑制鼻咽癌细胞的活力、增殖、迁移和侵袭。Alisol A对C666-1和HK1细胞的生长有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性。Alisol A处理显著降低了鼻咽癌细胞中细胞周期相关基因的蛋白表达。在Alisol A处理的细胞中，鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力降低。Alisol A处理显著降低了鼻咽癌细胞中MMP2和MMP9的蛋白表达。结论：Alisol A抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Alisol A可能是治疗鼻咽癌的靶点。

Abstract: Purpose: Alisol A is a bioactive triterpenoid isolated from the Rhizoma alismatis, which has anticancer potential. In this study, we explored the effect of Alisol A on the growth of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Methods: MTT assay, colony formation assay, flow cytometry, transwell assay, wound healing assay were used to assess cell viability, proliferation, cell cycle, migration, invasion, respectively, in vitro. Results: Alisol A inhibited the viability, proliferation, migration, and invasion of NPC cells. Alisol A significantly inhibited the growth of C666-1 and HK1 cells in a time- and concentration-dependent manner. Alisol A treatment significantly reduced the protein expression of cell cycle-related genes in NPC cells. The migration and invasion abilities of NPC cells were reduced in Alisol A-treated cells. Alisol A treatment significantly reduced the protein expression of MMP2 and MMP9 in NPC cells. Conclusion: Alisol A inhibited the proliferation, migration, and invasion of NPC cells. Alisol A may be a potential therapeutic target for nasopharyngeal.

1. 引言

鼻咽癌(NPC)常见于东南亚国家和中国南部[1]。NPC与多种危险因素相关，包括Epstein-Barr病毒感染[2]、宿主遗传[3]和环境[4]。有创手术、放疗和化疗有助于鼻咽癌的恢复[5]。顺铂Cisplatin是鼻咽癌最常用的化疗药物，但其急性毒性往往难以耐受[6]。因此，新药的开发对于改善鼻咽癌患者的临床结局至关重要。

天然产物具有潜在的有效性和低毒性，是新型抗癌药物的宝贵来源[7] [8]。泽泻[泽泻的干根茎(Sam.)]在中国、韩国和日本广泛使用[9]。泽泻的提取物具有多种药理作用，包括降血脂[10]、降血糖[11]、抗炎[12]、保肝[13]、抗乙型肝炎病毒[14]、抗菌[15]和抗癌[16]。Alisol A是从泽泻中分离出来的一种三萜类物质[17]。以前的研究表明，Alisol A抑制乳腺癌细胞的生长[18]。然而，目前还没有关于Alisol A对鼻咽癌细胞作用的报道。

本研究以HK1和C666-1细胞为实验对象，功能学角度检测Alisol A对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

2. 材料和方法

2.1. 细胞培养

鼻咽癌细胞株(C666-1和HK1)购自上海汇英生物技术有限公司(中国上海)。将细胞置于含有10% FBS、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素(HyClone, Logan, UT, USA)的RPMI-1640中，37℃，5% CO₂培养箱中培养。Alisol A购自Taotu生物技术有限公司(中国上海)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中。

2.2. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT)

MTT法是一种常用的细胞存活率和增殖评估方法。其原理是利用细胞中活性酶将MTT (3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物)还原为不溶的紫色结晶Formazan，进而通过溶解和分光光度计检测吸光度来间接测量细胞的活性。MTT法被广泛应用于评估细胞毒性、药物敏感性和增殖能力。

C666-1和HK1细胞(2 × 10⁴)接种于96孔板中，分别用Alisol A (10、20、40 μM)或顺铂(DDP, 10 μM)处理24 h。在24、48、72 h时，在96孔板的每孔中加入20 µL (5 mg/mL)的MTT溶液，在37℃下处理4 h。将形成的甲氮杂晶体溶解于100 µL DMSO中。用酶标仪(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在570 nm处测定吸光度。数据表示如下：抑制率(%) = [1 − (od570处理 − od570空白)/(od570对照 − od570空白)] × 100%。

2.3. 集落形成试验

集落形成法主要用于评价细胞增殖和克隆形成能力。通过在培养皿中接种细胞后观察其集落形成情况，该方法可以直接反映单个细胞的存活能力和增殖潜力，尤其适合于肿瘤细胞研究，用于评估抗癌药物对细胞增殖的影响。

C666-1和HK1细胞(1 × 10³)接种于6孔板。在37℃条件下，用10、20、40 μM的Alisol A或10 μM的顺铂处理细胞8天。培养基每2天更换1次。0.1%结晶紫溶液染色，倒置显微镜下计数菌落。一个细胞集落应包含≥50个细胞团。

2.4. 流式细胞术分析细胞周期

流式细胞术在细胞周期分析和细胞凋亡检测中扮演重要角色。通过检测荧光标记的细胞核染色剂的染色强度，流式细胞术可精确区分G0/G1、S和G2/M期细胞，帮助研究者了解细胞周期分布情况。此外，该技术还可以结合不同的荧光标记物，评估细胞的多项特性如凋亡、表面标志物的表达等。

C666-1和HK1细胞(3 × 10⁵)接种于6孔板，用10、20、40 µM的Alisol A处理24 h。收集固定后，碘化丙啶染色。用流式细胞仪(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)分析样本。流式细胞术(Flow Cytometry)

2.5. 伤口愈合试验

伤口愈合法用于观察细胞迁移。实验通过在培养皿中人为刮除一条“伤口”，然后记录细胞迁移填充伤口的速度。该方法简单易行，适合大规模筛查细胞迁移能力的影响因素，在癌症转移和组织修复等领域具有重要应用。

C666-1和HK1细胞(3 × 10⁵)接种于6孔板，用10 µM、20 µM和40 µM的Alisol A处理细胞24 h，用无菌的10 µL移液管尖端划痕单层细胞。24 h后使用倒置显微镜(Nikon, Melville, NY, USA)对创面进行拍照。

2.6. 细胞迁移和侵袭分析

Transwell法分为迁移和侵袭两种，主要用于评估细胞的迁移和侵袭能力。迁移实验通过无基质胶的Transwell腔测定细胞跨膜迁移，而侵袭实验则在膜表面添加基质胶来模拟基底膜结构，从而评估细胞穿透能力。该方法常用于癌症转移研究，以分析不同处理对细胞迁移和侵袭能力的影响。

Transwell小室涂有或不涂Matrigel (BD Biosciences)。用100 μL无血清培养基接种于细胞顶部的小室。细胞用结晶紫染色。在5个随机区域内计数细胞数量。

2.7. 统计分析

所有分析使用SPSS 22.0程序(IBM Corp., Armonk, NY, USA)进行。以p < 0.05为差异有统计学意义。

(A) 阿利醇A的二维化学结构；(B) 阿利醇A的三维化学结构；(C) MTT法检测细胞抑制率；(D) 克隆形成实验计数集落数。数据以三个独立实验的平均值 ± SD表示(与对照组相比，^*p < 0.05，^**p < 0.01，^***p < 0.001)。NPC，鼻咽癌。

Figure 1. Alisol A inhibits the growth of NPC cells

图1. Alisol A可抑制鼻咽癌细胞的生长

3. 结果

3.1. Alisol A抑制鼻咽癌细胞增殖

Alisol A的二维(图1(A))和三维化学结构(图1(B))。Alisol A对C666-1和HK1细胞的生长有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性。Alisol A的抑制率低于DDP (图1(C))。我们发现Alisol A以浓度依赖的方式抑制C666-1和HK1细胞的集落形成。顺铂对克隆形成的抑制作用强于Alisol A (图1(D))。

3.2. Alisol A诱导鼻咽癌细胞周期阻滞于G0/G1期

G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显减少(图2(A))。此外，我们发现Alisol A处理显著降低了鼻咽癌细胞中细胞周期相关基因的蛋白表达，包括cyclin D1，cyclin E1，CDK2和CDK4 (图2(B))。细胞周期阻滞于G0/G1期。

(A) 流式细胞术检测细胞周期分布；(B) western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。数据以三个独立实验的平均值 ± SD表示(与对照组相比，^*p < 0.05，^**p < 0.01，^***p < 0.001)。NPC，鼻咽癌。

Figure 2. Alisol A induces cell cycle arrest in G0/G1 phase of NPC cells

图2. Alisol A诱导鼻咽癌细胞周期阻滞于G0/G1期

3.3. Alisol A可抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

在Alisol A处理的细胞中，鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力降低(图3(A)~(C))。此外，Alisol A处理显著降低了鼻咽癌细胞中MMP2和MMP9的蛋白表达(图3(D))。

(A) 划痕实验检测细胞迁移；(B) Transwell实验检测细胞迁移。(C) Transwell实验检测细胞侵袭能力。(D) Western blot检测MMP2和MMP9的表达。数据以三个独立实验的平均值 ± SD表示(与对照组相比，^*p < 0.05，^**p < 0.01，^***p < 0.001)。NPC，鼻咽癌。

Figure 3. Alisol A inhibits the migration and invasion of NPC cells

图3. Alisol A可抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

4. 讨论

中医已经实践了几千年，并被广泛接受作为癌症的一种替代疗法[19]。近年来，泽泻中的生物活性化合物因其抗肿瘤作用而被广泛阐明。Alisol A可抑制乳腺癌的进展。Alisol B抑制乳腺癌细胞的增殖[20]。Alisol B23-乙酸盐诱导人肺癌细胞[21]和肝癌细胞凋亡[22]。我们的研究揭示了Alisol A对鼻咽癌细胞的抗癌活性。

癌症的特征是细胞周期不受控制[23]。细胞周期蛋白D/E和CDK2，CDK4对于细胞从G1进入S期至关重要[24]。细胞周期停滞常见于鼻咽癌[25]。龙葵碱调节前列腺癌中细胞周期蛋白的表达，包括细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1、CDK2和CDK4 [26]。在本研究中，Alisol A处理的C666-1和HK1细胞中cyclin D1，cyclin E1，CDK2和CDK4的表达显著下调。类似的报道发现[18]，Alisol A通过调节乳腺癌细胞中CDK4/cyclin D1和CDK2/cyclin E1的表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期。我们的研究表明，Alisol A在体外通过诱导G0/G1期阻滞来抑制C666-1和HK1细胞的增殖。

MMPs与癌细胞的转移过程有关[27]。细胞外基质(ECM)的降解是细胞转移的一个重要过程[28]。MMP2和MMP9参与细胞外基质的降解[29]。Alisol A 24-乙酸盐降低MMP2和MMP9的表达，并缩短细胞迁移距离[30]。我们的结果表明，Alisol A处理通过抑制MMP2和MMP9的表达来抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。

5. 研究的局限性和未来方向

体外实验为主，缺乏体内验证：研究主要基于细胞模型，可能无法完全反映体内复杂的肿瘤微环境。缺乏体内动物模型或临床样本的验证限制了其实际应用的转化价值。

构建鼻咽癌的动物模型，观察Alisol A对肿瘤迁移、侵袭以及转移的实际抑制作用。进一步探索药代动力学和毒理学特性，以评估其在动物和人体中的安全性和有效性。利用多组学技术(如转录组、代谢组或蛋白质组)系统性解析其作用靶点和网络效应。聚焦Alisol A对肿瘤微环境中其他细胞(如免疫细胞、成纤维细胞或内皮细胞)的调控作用。特别分析其对肿瘤相关炎症因子和免疫逃逸的影响。

6. 结论

综上所述，Alisol A抑制鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭，为治疗鼻咽癌提供了机制。

NOTES

^*通讯作者。