NRF2在肺纤维化中作用机制及相关治疗的研究进展

Research Progress on the Mechanism of Action of NRF2 in Pulmonary Fibrosis and Related Therapies

摘要: 肺纤维化(Pulmonary fibrosis, PF)是一种致死性高、几乎不可逆转的肺部疾病，目前发病机制不是十分明确，且治疗手段极其匮乏，因此寻找新的治疗策略成为当务之急。核因子E2相关因子2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2)是细胞内调节抗氧化应激、炎症反应及众多生理过程的关键转录因子，近年来的研究表明，众多药物可以通过作用于NRF2相关机制发挥抗PF的功效。本文就NRF2的结构与功能、参与PF的作用途径及相关治疗作一简要综述，以期深入发掘NRF2作为治疗PF靶点的潜力。

Abstract: Pulmonary fibrosis (PF), a pulmonary disorder characterized by high lethality and near-irreversibility, has an incompletely elucidated pathogenesis at present, and the available treatment modalities are severely limited. Consequently, the pursuit of novel therapeutic strategies has emerged as an urgent necessity. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), a pivotal transcription factor within cells, is responsible for modulating antioxidant stress, inflammatory responses, and a multitude of physiological processes. Recent investigations have demonstrated that numerous drugs can exert anti-PF effects by acting on NRF2-related mechanisms. This article presents a concise review of the structure and function of NRF2, its pathways involved in PF, and related treatments, with the aim of deeply exploring the potential of NRF2 as a therapeutic target for PF.

1. 引言

肺纤维化是一种以肺间质纤维化为主要病理特征的慢性、进行性、致死性的间质性肺疾病。这类患者的肺组织被形象地称为“丝瓜肺”或“蜂窝肺”，是因其在病理上可见正常的肺泡结构被破坏，代之以纤维瘢痕组织，形成类似于丝瓜瓤或者蜂窝样结构，然后导致肺换气功能逐渐下降，进而出现呼吸衰竭。在临床中，患者往往表现出进行性加重的呼吸困难、顽固性干咳、乏力等症状[1] [2]。引起PF的病因是多样性的，主要包括环境因素(如长期吸入粉尘、有害气体等)、病原微生物感染(如细菌、病毒、真菌等)、药物及放射性损伤(如博来霉素、环磷酰胺、胺碘酮、吉非替尼等)、自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等)以及特发性因素(不明原因所致的特发性肺纤维化) [3] [4]。由于目前PF患者3~5年的中位生存期以及治疗手段的局限性，其又被称为“不是癌症的癌症”。迄今为止，对于PF具体发病机制尚不明确，现有的研究表明其发生机制可能包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡与自噬、铁死亡、免疫失调、上皮–间充质转化、内质网应激、成纤维细胞和肌成纤维细胞的激活、内皮细胞功能障碍、遗传易感性、肠道菌群紊乱等[5] [6]。在这些机制中被认为同时存在众多信号通路及相关因子的参与，如TGF-β/Smad信号通路是肺纤维化中细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)沉积和上皮–间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程的重要诱因，PI3K-AKT-mTOR信号通路可以调节细胞增殖、分化以及EMT，Wnt/β-catenin信号通路在成纤维细胞生长、增殖和凋亡中起着重要作用，NRF2-KEAP1-ARE信号通路着重于减轻肺纤维化过程中早期的氧化应激和炎症反应[7] [8]。而其中，NRF2因子被众多研究人员认为是影响PF进程的重要信号因子之一，在诸如肝、心肌、肾脏、肠等多种器官纤维化疾病中表达上调而发挥抗纤维化作用[9]。故靶向该因子相关信号通路有望用于治疗肺纤维化。因此，本文综述了NRF2在PF中作用机制及相关治疗的研究进展，以期为PF疾病的深入研究提供参考。

2. NRF2的结构及功能

NRF2属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族中的一员，定位于人染色体2q31.2位置，是一种蛋白分子量约为68 kDa的转录因子。其包含多个结构域，如N、C端分别为转录激活结构域、抗氧化反应元件结合结构域，中间包含Neh1-Neh7 7个不同功能的同源结构域[10]，其中Neh1是NRF2与DNA结合及与其他转录因子形成二聚体的必要条件，Neh2可通过蛋白酶对NRF2的泛素化降解从而实现NRF2活性的负性调节，Neh3、Neh4、Neh5与维持和增强NRF2转录活性密切相关，Neh6可通过磷酸化自身特定丝氨酸残基从而促进NRF2的降解[11]，Neh7被认为和9-顺式维甲酸(RA)之间的相互作用可以抑制NRF2的细胞保护作用[12]。

NRF2主要存在于细胞质中，其分布和功能与伴侣分子Kelch样ECH相关蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1, KEAP1)关系密切。在NRF2的经典激活途径中，机体处于生理状态时，NRF2与KEAP1结合并定位于细胞质中，结合后的KEAP1会促进NRF2的泛素化，随后被蛋白酶体降解，使得NRF2处于低活性水平状态；而当细胞受到如氧化应激等外界刺激时，KEAP1发生构象变化，导致NRF2与KEAP1亲和力降低从结合状态相互解离，从而使NRF2发生核转位进入细胞核，NRF2与小Maf蛋白(Musculoaponeurotic fibrosarcoma)形成异二聚体，这种NRF2-Maf异二聚体可进一步与核内的抗氧化反应元件(ARE)结合，共同激活如细胞抗氧化剂、II期解毒酶以及转运蛋白等一系列下游基因的转录[13] [14]。此外，NRF2亦被证明可通过如蛋白激酶C及AMPK激活介导的磷酸化、P65或DPP9竞争性结合KEAP1等非经典激活途径被激活，从而启动上述下游基因的表达[15]-[17]。在这些下游基因的参与下，NRF2在细胞抗氧化、抗炎、解毒、凋亡与自噬调控、细胞分化、能量代谢、免疫调节、肿瘤等多方面均发挥了重要的生物学功能。

3. NRF2参与肺纤维化的作用途径

3.1. 抗氧化应激、抑制炎症反应

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，机体内氧化和抗氧化系统失衡，导致活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等氧化物在体内蓄积的状态，ROS和RNS的大量蓄积会对肺泡上皮细胞造成严重损伤[18]。一方面这些氧化物可以激活基质金属蛋白酶(MMPs)和抑制其组织抑制剂(TIMPs)，使得ECM的降解和重塑失去平衡，导致ECM过度沉积；另一方面，受损的细胞会释放多种细胞因子和趋化因子，如转化生长因子-β (TGF-β)、白细胞介素-8 (IL-8)等，从而吸引炎症细胞浸润，此外这些氧化物可以激活炎症细胞中的关键转录因子(如NF-κB)进入细胞核，启动一系列炎症相关基因的表达[19]-[21]。而NRF2被公认为是氧化应激的关键调节因子，并且在各种实验模型中被证实在抵消NF-κB驱动的炎症反应中起重要作用[22]。有研究发现[23]，在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中，干预组小鼠相较于模型组小鼠，前者的肺组织结构和胶原沉积显著改善，研究人员认为原因可能是s-烯丙基巯基-n-乙酰半胱氨酸通过干扰NRF2/NOX4信号通路逆转了抗氧化物谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平从而减轻氧化应激，同时通过上调NRF2阻断了NF-κB信号通路，减少炎性细胞和炎性细胞因子TNF-α、IL-6的数量而发挥抗炎作用，这表明NRF2可以通过对抗氧化应激、减轻炎症来减轻BLM诱导小鼠肺纤维化。

3.2. 抑制上皮–间充质转化

上皮–间质转化(EMT)是一种完全分化的上皮细胞在外界特定的生理和病理情况下逐渐转变为间充质细胞，并失去上皮细胞原有功能的过程。在正常状况下，上皮细胞通过细胞之间粘附机制紧密连接；EMT过程中，相邻细胞之间分离性增强。具体表现为上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白表达降低；间质细胞标志物如成纤维细胞特异蛋白、N-钙黏蛋白、和α-平滑肌肌动蛋白表达升高[19] [24]。该过程在现有的研究中被认为主要与TGF-β相关信号通路有关，但也有研究认为NRF2相关信号通路或可间接参与EMT的调节。如有研究人员在二氧化硅(SP)诱导的小鼠肺纤维化组织中观察到，花青素-3-半乳苷(C3G)处理组的小鼠表现为SP诱导后的E-钙粘蛋白mRNA的表达量相较于模型组显著增加，而α-SMAmRNA的表达量降低。这表明C3G可能通过抑制NRF2/HO-1通路抑制TGF-β/mTOR信号通路，从而减轻SP诱导的肺EMT [25]。

3.3. 调节免疫失调

免疫机制对组织损伤和修复过程至关重要，国内外研究均强烈支持免疫失调在促进肺纤维化发展中的重要作用这一观点，大家一致认为众多免疫细胞参与了这一过程，其中“巨噬细胞的极化”被认为是影响肺纤维化的关键进程[26]。“巨噬细胞极化”指巨噬细胞在不同的刺激条件下，获得不同的功能和表型的过程。在PF的早期阶段，巨噬细胞主要极化为M1型，这类巨噬细胞通过分泌促炎症因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)和效应分子(如ROI和RNS)来促进炎症反应；在PF的晚期阶段，巨噬细胞则倾向于极化为M2型，这类巨噬细胞主要负责组织修复和再生，它们通过分泌抗炎因子(如IL-10和IL-4)和促纤维化因子(如TGF-β)来促进抗炎和组织纤维化修复过程[27]。有研究发现[28]，NRF2可以通过阻止促炎细胞因子的转录来抑制巨噬细胞的炎症反应，在该研究中，作者先是利用促炎(M1-)激活和抗炎(M2-)激活的巨噬细胞探索了炎症状态下的NRF2靶基因，然后根据微阵列和NRF2染色质免疫沉淀方法(ChIP)-seq分析显示NRF2可与包括IL-6和IL-1β在内的促炎细胞因子的编码基因邻近结合，干扰了RNA聚合酶II (Pol II)对IL6和IL1b基因座的招募，从而抑制脂多糖(LPS)诱导的这些基因的表达。另有研究发现[29]，衣康酸(4-OI)以NRF2依赖的方式减轻BLM诱导的PF，其减轻PF的作用机制部分是通过间接抑制M2巨噬细胞介导的EMT来实现。

3.4. 调节细胞死亡

细胞死亡是生物体中一个复杂且关键的生理过程，死亡方式包括坏死、自噬、凋亡、铁死亡、铜死亡、焦亡、免疫杀伤、有丝分裂、套亡、胀亡等，其中部分死亡方式被认为可能与肺纤维化的发展有密切联系[30]。

细胞自噬被认为是机体的一种自我保护机制，它是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器在自噬相关基因(Autophagy associated gene, ATG)的调控下形成自噬溶酶体，并利用水解酶对蛋白质和细胞器进行消化降解的过程[31]。有充足的证据表明自噬在肺纤维化过程中发挥了重要作用，陈凤等人[32]总结了其中的机制可能包括自噬参与了肌成纤维细胞的增殖分化、缓解肺上皮细胞功能障碍、促进成纤维细胞活化、调节上皮间充质转化、抗细胞凋亡、介导内质网应激等。目前有研究证据表明NRF2可以上调ATG的表达，如ATG4、ATG5，NRF2的敲除会导致ATG的表达减少，这些基因在自噬体的形成过程中发挥关键作用[33]。Bingyu Shen等人[34]发现紫檀芪可通过促进NRF2表达进一步上调自噬相关基因(ATG)的表达，促进微管相关蛋白1轻链3I (LC3I)向LC3II的转化，激活机体的自噬反应，从而改善非酒精性脂肪性肝病。Mingyu Wu [35]等人研究发现丹参酮IIA通过激活Sqstm1-Sesn2轴介导的Keap1自噬降解，保护NRF2免受KEAP1介导的降解，有效地阻止了肌成纤维细胞活化并减少了ECM的合成，从而有效缓解PF。

细胞凋亡也被称为程序性细胞死亡，是指为维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡方式[36]。现有研究认为，机体可以通过抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达从而诱导成纤维细胞凋亡，阻断肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化来逆转PF的发展[37]。另有研究[38]表明七氟烷通过激活抗氧化通路Keap1/NRF2来减少LPS诱导的ROS产生，从而抑制LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡。陈适团队的研究发现[39]，与矽肺模型组相比，鸦胆子苦醇干预下的低、中剂量组小鼠肺组织胶原沉积明显改善，细胞凋亡过程中关键的执行蛋白Cleaved-caspase3的表达及转录水平下降，部分机制可能是因为通过抑制KEAP1-NRF2通路减轻矽肺小鼠肺组织中的细胞凋亡，延缓矽肺纤维化的进展。

铁死亡是一种新型程序性细胞死亡形式，为铁依赖性脂质过氧化物的积累所导致(具体过程为：铁的积累导致细胞内反应性氧分子(ROS)的生成，进而引发脂质过氧化，破坏细胞膜结构，最终导致细胞死亡)。铁死亡发生机制主要与铁代谢紊乱、抗氧化系统失衡、脂质过氧化物集聚有关[40]。铁死亡被证实在肺纤维化的进程起重要作用。一项实验表明，在BLM和脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的PF和肺损伤模型中，铁死亡抑制剂Lip-1以及铁螯合剂去铁胺均缓解了BLM或LPS所引发的PF症状；此外，该实验对小鼠成纤维细胞中转铁蛋白受体蛋白1 (TFRC)的基因进行特异性敲除后发现，与对照组小鼠相比，敲除小鼠在博来霉素诱导后的PF症状减轻[41]。同时有研究表明，月经血来源的间充质干细胞外泌体(MenSCs-Exo)可在小鼠肺上皮细胞中结合转录因子Sp3并抑制后者表达，使得Sp3对组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)的募集作用减弱，进一步让HDAC2对NRF2的脱乙酰化束缚被解除，从而促使NRF2途径得以强化，这一系列过程最终降低了PF的铁死亡，延缓了氧化损伤和肺上皮细胞死亡的病理过程[42]。这表明，NRF2可以通过Sp3/HDAC2/NRF2信号通路抑制铁死亡改善PF。

4. 通过NRF2治疗肺纤维化的药物及相关技术

4.1. 中草药提取物及方剂

中医古籍《金匮要略》中记载的“肺痿”病症与现代医学中的PF部分症状相似[43]，后世许多医家及研究人员亦在临床实践和研究中发现，中药提取物及部分方剂可通过上调NRF2因子表达对PF有一定的治疗作用。如Yun Wei等人的研究发现[44]，麦味养肺汤能够明显改善PF小鼠肺组织的病理损伤和纤维化，显著上调干预组小鼠细胞核内NRF2表达水平，同时NRF2下游抗氧化靶基因CAT、HO-1的表达水平以及抗氧化物质SOD也表现为上调趋势[44]。常玉骞等人总结了包括黄酮类、萜类、酚类、生物碱类等4大类中药提取物以及包括当归补血汤、加味补肺汤、补阳还五汤在内的3种中药方剂对PF的潜在药用价值[45]；它们被认为均可通过上调细胞内NRF2因子的表达，从而在不同程度上发挥抗炎、抗氧化、抑制胶原沉积作用，从而发挥抗PF的功效。目前对中药提取物和方剂治疗PF的作用机制了解还不够深入，未来需要借助如基因组学、蛋白质组学和代谢组学等来揭示中药成分与NRF2信号通路、基因表达调控之间的关系，明确NRF2在分子水平上是如何影响PF的发展。

4.2. 西药再利用

目前被获批用于临床上治疗PF的西药仅有两种：吡非尼酮(PFD)和尼达尼布(Nintedanib)，两者被证明分别主要通过抑制TGF-β介导的信号传导途径、抑制“VEGFR、FGFR和PDGFR等激酶”阻断纤维化过程[46]，但也有研究表明PFD可通过上调TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞和博莱霉素诱导的PF小鼠肺组织中NRF2、Ho-1和Gpx1的mRNA和蛋白表达，起到抗氧化、抗PF作用[47]。本文搜寻到了一部分原本用于治疗其他疾病的药物，但一些研究表明它们可能通过影响NRF2因子对肺纤维化有潜在的治疗作用。

恩格列净(Empagliflozin, EMPA)是一种钠–葡萄糖协同转运蛋白2 (Sodium-Glucose Cotransporter 2, SGLT2)抑制剂，通过抑制SGLT2受体减少肾脏对葡萄糖的重吸收，广泛用于2型糖尿病患者降低血糖水平。但最新的一项动物实验表明[48]，与仅用BLM处理的大鼠相比，对BLM处理的大鼠同时施用EMPA能显著上调该组大鼠肺组织中NRF2相对表达水平，展现出EMPA具有改善BLM诱导的PF作用。褪黑素(Melatonin, MT)是一种含吲哚环的化合物，主要由哺乳动物和人类的松果体合成与分泌，在以往的研究中认为该物质主要与调节睡眠–觉醒周期有关，但Lan YJ等[49]人的研究发现MT可以通过激活NRF2和抑制半乳糖凝集素-3 (Galectin-3, Gal-3)的表达来阻断“成纤维细胞向肌成纤维细胞分化”(Fibroblast-myofibroblast differentiation, FMD)的发生，从而显著减轻BLM诱导的小鼠PF。富马酸二甲酯(Dimethyl Fumarate, DMF)是一种用于治疗多发性硬化症和银屑病的免疫调节药物，在Mahmoudi Z等人[50]构建的以百草枯(Paraquat, PQ)致PF模型中发现，PQ降低NRF2蛋白的表达量，但DMF增加其表达，病理结果也反映了DMF对PQ诱导的肺损伤具有抗炎和抗纤维化活性。此外，还有许多其他药物经研究发现可通过NRF2因子发挥潜在抗PF作用，如三环类抗抑郁药阿米替林、伤口愈合剂及抗衰老剂衍生物甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸-铜复合物(GHK-Cu)、吸入性全身麻醉药七氟烷、人源化单克隆抗体托珠单抗模拟表位、脑血管扩张药长春西汀、细胞膜稳定剂色苷酸钠、M胆碱受体拮抗剂山莨菪碱(654-2)、质子泵抑制剂埃索美拉唑、抗疟药氯喹、调节月经周期的关键激素雌二醇、抗癌药物三氧化二砷及来那度胺、大环内酯类免疫抑制剂雷帕霉素、降脂药他汀类药物等[51]。

随着对PF发病机制的深入了解，以及对相关信号通路和信号因子的发掘，NRF2及相关信号通路在西药领域亦展现出对PF治疗的巨大价值。对现已研发的具有潜在抗PF作用的“药物再利用”以及基于NRF2 靶点的精准合成新药研发可能是一个有前景的研究方向。

4.3. 干细胞治疗

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，被誉为“生命之源”，能够分化成多种细胞类型的细胞，具有组织修复功能、免疫调节、旁分泌功能等众多功能。源于骨髓、脂肪、脐带等多种组织的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是干细胞治疗PF研究中的常用类型之一，目前认为NRF2可能增强了干细胞的归巢迁移和旁分泌功能，而干细胞的植入则会增强NRF2的表达[52]。Eun Joo Lee等人[53]在BLM诱导的老年小鼠PF模型中发现，注射MSC的干预组主要通过PERK-NRF2途径有效地将BLM诱导内质网应激标志物——热休克蛋白(BIP)降低至基线水平。另有Wenfeng Hu等人[54]的研究表明人胚胎干细胞衍生的MSC样免疫和基质调节细胞(Human embryonic stem cell-derived MSC-like immune and stromal regulatory cells, hESC-MSC-IMRC)能够抑制BLM诱导的小鼠肺组织中ROS和促炎细胞因子表达，并伴随着Nox4、NRF2、Ho-1表达降低，这些结果为间充质干细胞治疗PF提供了概念证明，部分机制是由NRF2的抗氧化和抗炎作用介导。干细胞目前被认为是治疗PF的一种有前景的细胞类型，但关于干细胞治疗纤维化疾病的机制仍有很多未知之处，此外对于干细胞来源和质量控制、探索最佳的移植途径和剂量、受体发生免疫抑制潜在风险以及对于干细胞移植后PF病人的长期疗效和安全性将会是未来研究的方向。

4.4. 基因治疗和纳米技术

基因治疗是一种利用分子生物学技术对人类基因进行操作，以纠正或改善疾病相关基因表达或功能的前沿医学技术，主要包括基因增强、基因沉默、基因编辑、基因替换和补充技术等[55]。在基因治疗中，必须有适合的载体才能介导靶细胞中的基因转染，主要分为病毒和非病毒载体两大类[56]。有研究发现[57]，通过给BLM诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠模型注射某种慢病毒载体，该载体搭载了高迁移率族蛋白B1的短发夹RNA (Short hairpin RNA of high mobility group box 1 protein, shRNA-HMGB1)，shRNA-HMGB1能够从基因层面显著降低干预组小鼠体内HMGB1基因的表达，进一步部分逆转由BLM诱导的NLRP 3炎性小体激活，同时可以促进体内细胞NRF2核转位，上调HO-1表达，从而改善小鼠PF。另有一项关于基因与药物联合治疗PF的研究发现[58]，通过加入具有高转染效率的脂质纳米粒作为pNRF2和吡非尼酮(Pirfenidone, PFD)的共负载体，可以显著增强pNRF2的高表达、减轻肺泡II型上皮细胞(Alveolar Epithelial Cells Type II, AECs II)氧化应激和抑制细胞内炎症通路的异常激活、增强PFD的治疗效果。无独有偶，另一个研究团队也通过类似的基因转染实验发现[59]，在纤维化肺中吸入搭载了NRF2激动剂富马酸二甲酯(DMF)的脂质纳米粒载体可明显促进巨噬细胞中NRF2和下游血红素加氧酶-1 (HO-1)的表达，并抑制TGF-β和ROS的产生，从而减少NIH-3 T3细胞的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和胶原的产生。由此可见，尽管目前治疗肺纤维化的药物往往存在生物利用度较低、靶向性差等问题，但未来的基因研究可以通过构建病毒载体、纳米技术、脂质体包裹等新型药物递送技术来帮助这些药物提高治疗的精度和疗效。

5. 总结与展望

NRF2是PF过程中的重要信号因子，其机制主要包括抗氧化应激、抑制炎症反应、抑制EMT、调节免疫、调节细胞死亡等。目前发现与NRF2相关的具有抗PF发展潜力的药物和技术包括中药提取物及方剂、原有西药的药物再利用、干细胞治疗、基因治疗及纳米技术，尽管其中大部分尚处在实验室研究或临床试验阶段，但可以预见的是，这些药物和技术将来不可避免会成为PF治疗的新趋势。此外，近年来发展势头迅猛的单细胞测序技术也将助力NRF2因子在PF治疗上解析新的发病机制、探索新的治疗靶点、精确评估药物疗效，加速药物研发过程。随着对NRF2信号因子的研究不断深入，以NRF2为核心靶点，未来将有望为PF的治疗开发出更加有效、安全的治疗方案。

致 谢

感谢湖南医药学院总医院呼吸与危重症医学科全体工作人员的支持与奉献。

基金项目

本文获得湖南省人民医院医联体专项基金项目“侗药九马方通过抑制氧化应激/内质网应激及其信号通路治疗大鼠肺纤维化”的资金支持。

NOTES

^*通讯作者。