3D生物打印在牙周炎组织再生中的研究进展

Research Progress of 3D Bioprinting in Periodontal Tissue Regeneration

摘要: 牙周炎疾病具有累及组织广泛、缺损形状特异等特点，在临床上再生难度较大。3D生物打印技术具有快速成型、个性化、高仿生的特点，在牙周再生方面的研究及应用日渐增多。本论文就3D生物打印技术在口腔内牙周炎组织再生领域的研究现状、应用潜力与展望进行综述，包括牙周韧带再生、牙槽骨再生及牙龈再生方面的研究及应用。3D生物打印技术在牙周炎组织再生领域具有广阔的研究和应用前景。

Abstract: Periodontitis is characterized by extensive tissue accumulation and specific defect shapes, making it difficult to regenerate clinically. 3D bioprinting technology has the characteristics of rapid prototyping, personalization, and high biomimicry, and its research and application in periodontal regeneration are increasing day by day. This paper reviews the current research status, potential applications, and prospects of 3D bioprinting technology in the field of periodontal tissue regeneration in the oral cavity, including research and applications in periodontal ligament regeneration, alveolar bone regeneration, and gingival regeneration. 3D bioprinting technology has broad research and application prospects in the field of periodontal tissue regeneration.

1. 引言

牙周炎是一种发生在牙周组织的慢性炎症性疾病，该病在人群中发病率高达90% [1]。它的病因复杂，若未及时治疗，往往会导致牙周附着的逐渐丧失、深牙周袋的形成、牙槽骨的破坏等结果[2]。随着牙周炎病情的加重，最终可能导致牙齿的脱落[3]，因此，有效引导牙周组织再生是治疗牙周炎的关键。

目前临床上对于牙周炎的治疗主要包括两个方面：一是消除或调节导致牙周炎出现和发展的因素，二是尽可能地恢复牙周软硬组织的缺失[4]。其中，牙周组织的恢复对于病人的咀嚼、美观、发音功能及提高病人的生活质量至关重要。研究表明，成功的牙周再生要求包括了牙槽骨重建、牙骨质形成、牙周纤维形成与附着以及牙龈再生[5]。目前临床上通过技术手段实现了牙周组织再生，例如使用或不使用骨移植物的引导组织/骨再生(GTR/GBR) [6] [7]。然而，这些方法对于组织的再生能力有限，并不足以恢复牙周炎破坏后所需的功能性牙周组织[8]。

现如今，随着三维(3D)打印技术在再生医学和组织工程的应用，越来越多学者开始关注这一热点，目前主流的3D打印技术主要有三种类型：喷墨式、挤压式、光固化式，如图1所示[9]。据文献显示，3D生物打印在精准医学、药物载体、再生医学和组织工程等方面均有应用[9]。

Figure 1. Schematic diagram of main 3D printing technologies [9]: (a) Inkjet printing; (b) Extrusion printing; (c) UV curable printing

图1. 主要3D打印技术的示意图[9]：(a) 喷墨式打印；(b) 挤出式打印；(c) 光固化式打印

3D生物打印是在3D打印基础上，以“逐层打印”的方式将细胞、材料和生物活性因子精确放置到预定义的位置，具有快速成型的特点[10]，如图2所示。与传统的组织工程方法相比，3D生物打印支架具有诸多优点，例如高保真度、个性化设计和高打印效率[11]。目前，3D生物打印已经取得了巨大的发展，为牙周组织再生提供了新的突破，已被大量应用于牙周领域，牙周韧带、牙槽骨、牙龈等组织再生的可能性也得到了验证[12] [13]。

本文聚焦于3D生物打印在牙周炎组织再生中的应用与潜力，总结了3D生物打印技术在口腔内牙周炎组织再生领域的研究进展，包括牙周韧带再生、牙槽骨再生及牙龈再生方面的研究及应用。

Figure 2. Schematic diagram of 3D bioprinting technology [14]

图2. 3D生物打印技术的示意图[14]

2. 3D生物打印在不同牙周组织再生中的应用

牙周组织是由牙周膜、牙骨质、牙槽骨和牙龈组成的复杂结构。而牙周炎往往造成包含了两种及两种以上的不可逆的牙周组织丢失[1]。大量研究表明[15] [16]，最初的非手术治疗即牙周基础治疗并不能再生其已经丧失的牙周组织，临床医生目前面临的最大挑战是重建牙周组织[17]。在目前的临床应用中，引导组织再生治疗和生物活性因子治疗大多局限于三壁牙周缺损[18]，因此，标准的牙周再生技术在恢复牙周组织的功能和结构完整性方面存在很大局限性。为解决这一难题，诸多学者致力于替代方法如组织工程的探索[19]。

2.1. 牙周韧带再生

牙周韧带(PDL)是牙骨质(覆盖牙根的一层矿化组织)和牙槽骨之间的结缔组织界面[1]。PDL通常由1型胶原蛋白组成，除了作为牙齿的支撑结构外，PDL还参与修复受损组织，提供营养，并在牙槽骨的体内平衡中发挥作用[20]。Hurng等人[20]利用牙周组织中的间充质干细胞，证明了PDL的修复和重塑是可能的。因此，PDL再生是牙周炎组织再生的重要组成部分。

根据研究显示[21]，3D网络中存在微股且可以精确控制细胞位置，因此，3D生物打印具有可形成高度排列的胶原纤维的内在优势。同时，与单纯进行细胞接种的胶原相比，通过生物打印的载有细胞的胶原在钛植入物的表面上可形成更多的牙周韧带样软组织[21]。

目前的治疗方法虽然可以在一定程度上修复牙周硬组织[12]，但牙周膜具有高度的方向性，是由多组不同方向和功能的牙周膜组成[20]，因此，重建牙周膜具有一定的难度。Yue Ma等人[22]将3D生物打印技术应用于牙周膜再生，采用仿生牙周膜补丁(BPPs)进行微型连续数字光投影生物打印，其再生组织的“三明治结构”与天然牙周组织非常相似，特别是纤维可以在牙根的不同区域显示出不同的和特定的取向，同时，其再生的牙周组织在正畸力的作用下可以实现牙齿的稳定移动，且无明显不良后果。总体而言，BPPs促进了牙周组织的功能和复杂微结构的重建，为临床中牙周组织功能性治疗提供了新的解决方案。

此外，纤维定向性差和骨–韧带界面融合不匹配一直困扰着牙周组织缺损的细胞支架修复。Yang Xueting等人[13]使用甲基丙烯酸酯明胶/脱细胞细胞外基质(GelMA/dECM)成功搭载细胞，这种生物墨水的设计具有高结构完整性的3D生物打印仿生牙周模块。该模块通过高精度的地形线索呈现出良好的机械性能和方向引导，并提供有利于调节封装细胞行为的生化环境。dECM具有强大的免疫调节活性，可减少M1巨噬细胞释放促炎因子，并减少Sprague道利大鼠的局部炎症。在临床相关的临界尺寸牙周缺损模型中，生物打印模块显著增强了比格犬混合牙周组织的再生，特别是骨–韧带界面的锚定结构、排列良好的牙周纤维和高度矿化的牙槽骨。这证明了3D生物打印结合牙囊特异性dECM生物墨水用于牙周组织再生的有效性和可行性，为未来的临床实践提供了新的途径。

2.2. 牙槽骨再生

牙槽骨丢失通常由牙周炎或种植体周围炎症引起，严重时甚至会导致牙齿的脱落。在临床上，牙槽骨再生既是牙周治疗的目标之一，也是种植修复的前提。与其他颅颌面骨结构相比，牙槽骨支架作为牙齿支持组织，由于其结构的复杂性和牙根面几何形状的适应性，其设计和制造仍是一个挑战。

为了解决牙槽骨再生的难点，在骨组织工程有着至关重要作用的生物陶瓷，被学者应用于牙槽骨重建，取得了良好效果。如Qin等人[23]探索了不同孔径(480、600和720 μm)对生物陶瓷支架的机械性能、生物活性离子释放和生物溶解的影响。研究表明，600 μm组在兔下颌骨缺损模型中显示出最大的新骨形成。在另一项研究中，由羟基磷灰石和α-TCP组成的Osteoink^TM被用于开发用于牙槽骨重建的基于磷酸钙(CaP)的生物陶瓷支架。打印的支架具有高度的准确性，以适应它们被设计用于相应的临床缺陷[24]。

除生物陶瓷外，GelMA作为另一种成熟的牙槽骨重建材料，同样具有类似于细胞外基质和可调节的理化性质，在牙周再生领域应用广泛。据研究显示，3D打印的PCL/GelMA混合支架在体外可产生细胞活力、DPSC的成骨分化和矿化[25]。同时，勒义官等人证实了[26] XGMA作为生物墨水封装BMSCs三经3D打印可在体内外可诱导成软骨分化并修复缺损。其机械性能和孔径大小可通过调整MA的接枝率来调节以满足组织工程各种不同的需求，从而达到修复牙槽骨缺损的目的。

为更进一步探索牙槽骨再生，Yu Guang-Tao等人[27]设计了一种可定制的多功能3D打印模块，其具有甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)修饰的ε-聚-L-赖氨酸(EPLGMA)负载牙周膜干细胞(PDLSC)和髓源性抑制细胞膜囊泡(MDSCs-MV)生物墨水(EPLGMA/PDLSC/MDSCs-MV，缩写为EPM)，用于牙周炎源性骨缺损修复。该材料具有良好的力学性能和理化特性，为骨再生提供了适宜的微环境。在体外实验中，EPMs对牙周致病菌的有效杀灭依赖于EPL的天然抗菌特性。同时证实MDSCs-MV通过CD 73/CD 39/腺苷信号通路抑制T细胞，发挥抗炎作用。此外，PDLSC的种子细胞为成骨细胞提供了充足的供应。MDSCs-MV能显著增强PDLSCs源性成骨细胞的矿化能力。在大鼠牙周骨缺损模型中，micro-CT和组织学染色结果表明，该支架在体内同样具有良好的抗炎和骨再生功效。

然而，临床上牙槽骨的修复并不稳定，为了改善这个问题，Miao G，Liang L [12]等人制备了一种由GelMA，海藻酸钠(SA)和生物活性玻璃微球(BGM)组成的多组分水凝胶，打印能力不受细胞或生长因子的影响，3D生物打印的水凝胶支架能够模拟加载生长因子的生物效应。该双功能支架具有良好的牙周组织再生能力，可促进Beagle犬牙周缺损模型牙槽骨的修复和牙龈组织的愈合，证明了这种新型墨水应用于牙槽骨再生的潜力与可能。

为了使3D生物打印支架达到更好的生物学特性，还有学者将生长因子、肽和其他生物活性物质补充进生物墨水中[28]，例如抗菌肽KSL-W [29]、重组人促红细胞生成素(rh-EPO) [30]和氧化石墨烯[31]等。仿生和多功能的3D打印生物墨水为牙周炎衍生的骨缺损修复和未来的临床应用开辟了新的途径。

2.3. 牙龈再生

牙龈是口腔软组织的另一个关键组成部分，对口腔结构完整性和牙齿美观至关重要。虽然自体牙龈移植已被广泛用于逆转牙龈退缩和增加牙周软组织，但供体组织来源的缺乏、手术过程的复杂性、以及术后的疼痛和麻木仍然阻碍了良好的预后[32]。因此，组织工程策略是一个再生口腔软组织的新的选择。Tang [33]沿着他的团队开发了一种由藻酸盐、明胶和可注射富血小板纤维蛋白(i-PRF)组成的生物墨水，它可以释放各种修复相关的生长因子。在体内实验中，具有50% i-PRF的3D打印结构与没有i-PRF的组织相比显示出其有更多的胶原蛋白形成与宿主组织相互浸润。在他们的最新研究中，他们生物打印了基于脱细胞真皮基质(ADM)的水凝胶复合材料，并在比格犬中进行了体内植入，证明了载有GF的ADM支架显著促进角化牙龈再生。

3. 总结与展望

3D生物打印技术在牙周炎组织再生领域是一个很有潜力的方向。3D打印具有构建几何拓扑结构的固有优势，而这些几何拓扑结构不仅可以影响细胞行为，还可以实现复制复杂的微观结构以模拟天然组织或器官的生物学特性的功能。

目前，单一组织的再生已不能满足功能性牙周重建的需要，因此，牙周组织的多组织生物修复成为一个备受关注的研究领域。前文已经讨论了采用仿生牙周膜补丁(BPPs)的功能性牙周再生进行微型连续数字光投影生物打印，其再生的组织在“三明治结构”方面与天然牙周组织非常相似，然而，以这种方式制造的支架不仅缺乏组织间的凝聚力，还可能导致打印的构建体的稳定性受损。为了更好地模拟天然牙周组织，实现功能性牙周重建，需要在几个方面进行进一步的研究。一是开发具有更高打印分辨率的新型3D生物打印技术。到目前为止，基于基础的3D打印凭借材料易得、成本低廉等优势，是组织工程领域使用最多的打印技术，但打印精度无法与激光辅助打印相比。其次，需要进一步探索细胞外基质的生物力学特性对干细胞命运的调控，使打印架构中的细胞–基质相互作用发挥最佳效果。

据研究显示，3D打印结构的免疫调节也是未来的一个发展方向。生物材料支架易在体内触发宿主免疫排斥，从而导致慢性炎症和再生失败[34]。少数研究[35]还报道了3D生物打印支架的免疫作用，包括炎症因子和巨噬细胞极化的调节。

虽然当前的研究在不同程度上实现了牙周组织的再生，但仍存在需要解决的挑战，例如新生牙周组织的血管化、神经化以及支架与组织的内部整合。此外，能够承受强机械载荷的脱细胞硬组织的长期矿化和支架降解之间的平衡仍然是一个难题。同时，尽管关于3D生物打印促进牙周炎组织再生的实验结果有利于治疗，但它们缺少临床实践。为了缩小实验室和临床应用之间的差距，目前迫切需要进一步的安全性和功能测试。总之，3D生物打印技术在牙周炎组织再生方面显示出了巨大的治疗潜力，为临床的再生医学奠定了坚实的实验基础。

NOTES

^*通讯作者。