miRNAs在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

The Role of miRNAs in the Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

摘要: 间充质干细胞(MSC)，也称为多能基质细胞，是一种首次在骨髓中发现的非造血干细胞群，目前已从各种成体组织来源中分离出来，是能够分化为多种间充质组织(如脂肪和骨骼)的成熟细胞的多能细胞。MicroRNAs (miRNA)是一种高度保守的内源性非蛋白质编码RNA，通过翻译抑制或降解其靶标来调节基因表达，在调节BMSC分化中起主要作用。本文探讨了miRNAs骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。

Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs), also known as pluripotent stromal cells, are a population of non-hematopoietic stem cells first discovered in the bone marrow that have been isolated from various adult tissue sources and are pluripotent cells capable of differentiating into mature cells of a variety of mesenchymal tissues, such as fat and bone. MicroRNAs (miRNAs) are highly conserved endogenous non-protein-coding RNAs that play a major role in regulating BMSC differentiation by translating inhibition or degradation of their targets to regulate gene expression. This article explores the role of miRNAs in osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

1. 引言

骨骼是一种坚硬的器官，为身体的各种重要器官提供支持和物理保护。成骨与破骨使得骨骼处于动态平衡状态，据估计，在成年人体内，整个骨骼每7年更新一次[1]。成骨细胞的骨形成和破骨细胞的吸收是负责持续骨重塑的严格调节过程。破骨细胞起源于骨髓分化谱系的造血干细胞前体(HSC)；而成骨细胞来源于具有脂肪细胞的共同祖细胞，即骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSC)，骨髓间充质干细胞最初在骨髓中被发现，Friedenstein等[2]发现BMSC可以分化成类似于小面积骨或软骨的聚集体。经过多年的研究发现，BMSC能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至成肌细胞，被认为是多能细胞，目前已成为基因治疗、组织工程、细胞替代疗法和再生医学的重要种子细胞来源。MicroRNA (miRNA)是一种大小为19到25个核苷酸的内源性非蛋白质编码RNA [3]，MiR通过碱基配对靶向mRNA的3'端，在调节细胞分化中发挥作用，从而降解或诱导翻译沉默[4]。经过多年研究，miRNAs在BMSCs的成骨分化中起着重要作用。本文深入研究了miRNAs在BMSCs成骨分化过程中的作用，为骨组织工程和临床治疗提供了新的理论和实验依据。

2. miRNA的形成及作用机制

1993年，Lee等[5]首次发现秀丽隐杆线虫中存在微小RNA，随着研究的深入，已经发现了1000多种miRNA，每种miRNA都调节多种mRNA，并参与生物过程的调节[6]，miRNA的产生是一个非常复杂的生物过程，编码miRNA的基因被细胞核内的RNA聚合酶II转录成初级miRNA (pri-miRNA)，接下来，pri-miRNA由一种核酸酶核糖核酸酶III (DroshaIII)微切割，并加工成miRNA前体(pre-miRNA)，之后，在Ran-GTP的帮助下将pre-miRNA转运到细胞质中，再由另一种DroshaIII切割成双链体结构，其中包含约19~23 nt的miRNA和miRNA*，miRNA*会被水解酶水解。miRNA通过与argonaute蛋白结合形成成熟的miRNA，成熟的miRNA碱基配对靶向mRNA的3'端，从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因[7]，miR-125b是第一个据报道通过调节MSC增殖来影响成骨的miRNA [8]。

3. 骨髓间充质干细胞成骨分化的信号通路

成骨受多种信号通路控制，例如骨形态发生蛋白(BMP)、Notch、Hedgehog、神经表皮生长因子样1蛋白(NELL-1)和Wnt/β-catenin信号传导，而miRNAs则通过干扰转录因子像Runx2、Osterix (Osx)、远端无同源盒5 (Dlx5)、TWIST、Msh同源盒2 (Msx-2)、激活转录因子4 (ATF4)和O型叉头盒(FOXO)成员，再通过与各种信号通路的相互作用诱导BMSCs的成骨谱系的分化。而这之中，Runx2是成骨的主要调节因子，活跃在很多信号通路之中。下面将介绍几个经典的信号通路。

3.1. Wnt/β-Catenin信号通路

经典的Wnt通路通常通过自分泌/旁分泌方法将细胞外Wnt配体与膜受体结合而高度保守和激活。一旦被激活，典型的Wnt通路会诱导β-Catenin的稳定性并将其转移到细胞核，并与TCF/LEF转录因子结合，诱导下游基因转录，最终促进参与细胞增殖、存活、分化和迁移的基因的表达，Wnt/β-Catenin通路受到miRNA种因素影响，例如，在人成骨细胞中，miR-483-3p直接与DKK2结合，增加β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1的表达，并通过影响成骨细胞增殖、成骨细胞前分化为成熟成骨细胞和新骨基质形成来影响骨形成过程[9]。在BMSC和成骨细胞前MC3T3-E1细胞中，miR-376b-3p直接靶向结合YAP1来抑制YAP1表达，circ_0024097作为ceRNA通过吸收miR-376b-3p来拯救YAP1，导致Wnt/β-catenin信号通路的激活和细胞分化，从而减轻骨质疏松症。在成骨细胞系中，YAP稳定β-连环蛋白并促进核β-连环蛋白介导的成骨[10]。miR-19b的上调和KLF5/β-catenin信号传导的激活可能是治疗骨折的临床上可行的靶点。更重要的是，间充质干细胞来源的外泌体miR-19b通过Wnt/β-catenin信号通路抑制WWP1或Smurf2的表达，并提高KLF5的表达，从而促进骨折愈合[11]。此外Feng Y等人发现，抑制miRNA-139-5p通过NOTCH1靶向Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的成骨分化[12]。MiR-291a-3p靶向DKK1激活Wnt/β-catenin通路，从而促进地塞米松诱导的骨质疏松症中的BMSCs分化[13]。

3.2. TGF-β/BMP/Smad信号通路

TGFβ超家族由30多个成员组成，包括TGFβ、BMPs、生长分化因子(GDF)和激活素，BMP是TGFβ超家族中最大的分支，由近30种人类蛋白质组成，BMP信号转导的中断会导致各种骨骼和骨骼外异常[14]。TGFβ家族配体与细胞膜中的异源四聚体受体复合物结合，可启动典型信号转导的激活。该受体复合物由两个1型受体和两个2型受体组成。配体结合后，2型受体磷酸化并激活1型受体，1型受体募集并磷酸化R-SMAD：TGFβ受体和配体的SMAD2和3；以及用于BMP受体和配体的R-SMADs 1、5和8。这种磷酸化使R-SMAD具有活性，并能够与普遍存在的SMAD4形成异寡聚体复合物。该复合体的形成促进了核易位。进入细胞核后，R-SMAD/SMAD4复合物与其他转录因子和辅因子结合，诱导或抑制基因转录[15]。例如，Sun等[16]发现自体氧释放纳米仿生支架复合miR-106a诱导BMSCs通过调节BMP-2增强成骨细胞转化并促进骨修复。有研究表明：血清miR-125a-3p水平升高和血清BMP-2水平降低与骨质疏松性椎体压缩性骨折(OVCF)术后延迟愈合密切相关；二者都是独立影响因素，但抑制miR-125a-3p也可靶向缺口1信号通路上调BMP-2表达，二者共同作用对OVCF术后延迟愈合有一定预测价值，BMP-2是BMP家族中最具活性的成员，能够诱导未成熟的间质细胞聚集于骨形成中心并促使其向骨系细胞分化，从而在骨形成中发挥重要作用[17]。MiR-34a通过直接靶向BMP3促进BMSC的成骨分化，其中BMP3是BMP家族中最丰富的成员，约占总含量的65% [18]

3.3. p38 MAPK信号通路

p38 MAPK通路已被证明在控制成骨细胞分化和骨骼生成方面至关重要。MAPK的通路组成是保守的三能级激酶模式，包括MAPK激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，即MAP3K-MAP2K-MAPK链。这三种激酶可以依次被激活，p38有p38α、p38β、p38γ和p38δ 4种亚型，由MKK3和MKK6激活，激活后使p38磷酸化，进而参与转录因子的表达，然后参与BCMCs成骨分化过程。例如Qi [19]等发现miR-150-5p通过抑制FNDC5表达阻断p38/MAPK通路传导，从而抑制BMSCs在体外的成骨分化。Guo [20]等人发现miR-214的下调会增加BMSC中p38蛋白的表达，而miR-214过表达后则抑制了p38表达，从而降低了碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)基因表达，反而促进了成脂分化。Zhu等人发现，miR-217靶向Runx2的3' UTR通过细胞外信号调节激酶(ERK)和p38信号通路抑制BMSC的成骨分化[21]胡等人通过蛋白质印迹实验发现抑制mir-205增加了ERK和p38 MAPK的磷酸化，而miR-205的过表达抑制了ERK和p38 MAPK在成骨诱导过程中的活性，同样通过抑制Runx2和SATB2的表达负调控成骨分化[22]。

3.4. Notch信号通路

Notch信号通路高度保守，与细胞命运决定、自我更新潜力和细胞凋亡有关。Notch信号通路在各种组织的胚胎发育和成体稳态过程中反复使用，在相邻细胞之间传递旁分泌信号，哺乳动物Notch受体家族由四个成员组成，即Notch1到Notch4，而Notch配体家族由五个成员组成：Jagged1、Jagged2和Delta 样配体1 (DLL1)、DLL3和DLL4。Notch受体是单程跨膜蛋白。在生理条件下，在一个细胞上表达的配体与在相邻细胞上表达的Notch受体结合，该受体被γ分泌酶复合物蛋白水解切割，导致形成NICD (Notch的细胞内切割片段)，其易位到接收细胞的细胞核，从而激活下游转录因子[23]。miRNA-34b参与hBMSCs 的成骨分化，在过表达miRNA-34b后，ALP活性降低、Runx2蛋白表达水平及Notch信号通路活性降低，钙盐结节减少，表明miRNA-34b可通过抑制Notch信号通路的活性抑制hBMSCs成骨分化[24]。miR-34a的过表达在体外抑制hMSCs的成骨。靶点预测分析和实验测试证实Jagged1 (Notch信号通路的关键转录因子成分)是miR-34a的靶点。在临床模型中，miR-34a在hMSC中的过表达使异位骨形成减少了60%，而miR-34a的敲低使体内骨形成增加了200%。所有这些结果表明，miR-34a的组织特异性抑制是增强体内骨形成的潜在新型治疗策略[25]。

需要强调的是，上面讨论的信号通路不是孤立的。BMSC的谱系是由各种信号通路的网络决定，这些信号通路可以被特定微环境中的刺激同时激活，其中，TGF-β/BMP和Wnt/β-catenin通路发挥着关键的相互关联作用。miRNA可以直接增加或减少编码信号通路成分和/或参与成骨分化的TF的基因的表达，最终对成骨产生刺激和抑制作用，不同的miRNA可以通过影响一种特定的转录因子复合物来协同调节共同的信号通路，下面将简述miRNA对BCMC成骨分化的影响。

4. miRNA与BCMCs成骨分化

人骨髓间充质干细胞(hBMSC)具有多谱系分化能力，有证据表明hBMSC的这种能力与细胞外载体分泌有关。小细胞外囊泡(sEV)是与多囊泡体的细胞膜融合产生的细胞外囊泡，它们的直径在30到150 nm之间，含有丰富的功能成分，例如蛋白质和microRNA，MicroRNA是hBMSC-sEV的主要成分，他们在骨髓间充质干细胞多谱系分化起着至关重要的作用，大多数miRNA已在不同的研究中进行了研究，证实了它们在成骨分化中的作用，存在或促进或抑制的作用，而抑制作用又包括生理性抑制或病理性抑制，病理性抑制成骨的同时又促进了成脂分化，这就导致了骨质疏松症。

4.1. miRNA促进BCMCs成骨分化

Zhou [26]等去除C57BL/6J小鼠(n = 24)的双侧卵巢以构建骨质疏松症模型；分离培养BMSCs，用miR-21模拟物、NC模拟物、miR-21抑制剂和NC抑制剂转染BMSCs，而后采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-21、成骨/成脂基因和抑癌基因(PTEN)的表达。采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红及油红O染色检测BMSCs中钙结节和脂滴的形成，Western blot检测PTEN的表达，结果发现miR-21在骨质疏松小鼠中显著下调。BMSCs成骨诱导后miR-21表达显著上调，脂肪诱导后miR-21表达显著下调。miR-21的过表达显著促进了BMSCs的成骨分化，抑制了BMSCs的成脂分化。miR-21抑制剂转染的BMSCs中的PTEN表达更为显著。从而得出结论：MiR-21可通过负调控PTEN促进BMSC的成骨分化并抑制其成脂分化。Zhao[27]等通过miR-129-5p模拟物、miR-129-5p抑制剂和阴性对照慢病毒转导BMSC。结果发现miR-129-5p的过表达显著促进了BMSCs在体外的成骨分化。此外，与体内对照对应物转导的BMSC相比，用miR-129-5p模拟物转导的BMSC表现出更好的骨再生。荧光素酶和蛋白质印迹数据显示，Dickkopf3 (Dkk3)是miR-129-5p的靶基因，在miR-129-5p模拟物转导的BMSC中Dkk3的表达受到抑制，但在miR-129-5p抑制剂转导的BMSC中增强，故总结出：miR-129-5p通过抑制Dkk3促进BMSC的成骨分化和骨再生，miR-129-5p/Dkk3轴可能是治疗骨缺损和骨质流失的新潜在靶点。Lin等人报道，miR-130a通过负调控Smurf2表达促进BMSC的成骨细胞分化，通过靶向PPARγ抑制BMSC的成脂分化，为年龄相关性骨质流失的临床治疗提供了新的靶点[28]。Cao等人报道：miR-344d-3p促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)和MBMSC的成骨分化。它抑制了3T3-L1和MBMSCs的脂肪形成分化。此外，Dnmt3a可能是miR-344d-3p的靶基因[29]。miR-486-3p的表达在OP患者的骨髓中显著下调，通过研究表明miR-486-3p通过靶向抑制CTNNIBIP1的表达和激活Wnt/β-catenin通路，故得出miR-486-3p是BMSC成骨分化的正调节因子[30]。

4.2. miRNA抑制BCMCs成骨分化

Bmal1 (Brain and Muscle Arnt-Like)是一种转录因子，它的表达随年龄的增长而下降，而miR-155-5p的表达增加。miR-155-5p和Bmal1相互抑制对方的表达，miR-155-5p靶向Bmal1。此外，miR-155-5p抑制BMSCs的增殖和成骨分化，促进细胞凋亡和衰老[31]。Tang等人观察到在BMSCs成骨分化过程中，ALP活性、骨钙素(OC)分泌、osterix蛋白水平(Sp7)和Runt相关转录因子2 (Runx2)显著升高，而miR-124的表达呈时间依赖性降低。在BMSC中通过转染miR-124模拟物过表达miR-124后，Runx2蛋白表达和 ALP活性显著降低。相比之下，抑制miR-124表达导致ALP活性和Runx2表达增加，观察到Sp7是直接靶标[32]。有研究表明miR-10a-5p可作为hBMSCs成骨细胞分化的负调节因子，并可能对脂肪生成产生积极影响。此外，miR-10a-5p的功能抑制加速了hBMSCs的成骨分化，并促进了体内骨形成[33]。OP患者miR-23的相对表达显著上调，而MEF2C的相对表达则呈相反趋势，miR-23通过靶向MEF2C抑制p38MAPK激活，从而负向调节hBMSC的成骨分化[34]。Yang [35]等人报道miR-1271-5p在骨质疏松性小梁骨组织中表达较高，通过下调其靶标FOXO1以及RUNX2、ALP和OCN的表达来抑制BMSCs的成骨分化。

5. 展望

MiRNA在BMSC的成骨分化中起关键作用，但其具体作用机制尚不完全清楚。事实上，由于不同的miRNA通过影响不同的靶点来促进或抑制BMSCs的成骨分化，因此进一步研究miRNA靶基因的功能特异性和miRNA之间的相互作用对于阐明它们的作用机制具有重要意义。随着研究的进展，靶向miRNA靶基因的基因治疗将使患者受益。此外，随着生物医学的不断发展，BMSCs成骨细胞分化的分子机制将日益阐明，从而为骨组织工程和临床治疗提供新的理论和实验依据。尽管许多报告表明miRNA参与MSC向成骨细胞分化的调节，但更多细节仍有待阐明，并且要更好地应用miRNA，仍有许多问题有待解决。目前有大量研究在骨折大鼠模型外周血中发现了多种miRNA有差异表达，但外周血中miRNA含量较少，且PCR法因易受到外在掺杂杂质如实验人员操作污染影响，导致检测结果不够严谨。除此之外，miRNA实际的临床应用仍存在一定难点。首先，当前主流研究集中在动物实验阶段，而临床患者的实验数据相对较少；再者，动物外周血中检测到的miRNA是否也可在人体中检测到，因老年人发生骨折后的一系列疗养治疗，如药物、手术、功能锻等这些影响因素在动物模型中都是无法同等程度模拟的。其次，老年骨折患者因各种并发症可能服用多种不同种类的药物，但目前没有相关研究证明这些药物是否影响潜在生物标志物的分泌或消除。最后，目前研究miRNA大多聚集在单纯骨折患者，而人群患病常合并多种严重并发症，尤其老年人常合并高血压、糖尿病、心脑血管疾病等，但关于研究miRNA在多种合并症中的作用尚存在欠缺，仍需研究者进一步深入研究。相信在不久的未来，随着生物医学技术的与时跟进以及研究者们不断地深入研究，越来越多miRNA的调控机制及生物学功能研究日趋成熟，届时通过检测miRNA表达水平即可确定骨折患者严重程度及预后情况，并根据生物标志物的分子生理病理机制研发出靶向药物延缓甚至逆转疾病进展，成为未来骨折疾病诊疗的新靶点。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。