基于网络药理学和分子对接技术探讨恒古骨伤愈合剂促进骨折愈合的作用机制

Mechanism of Osteoking in Promoting Fracture Healing Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

摘要: 目的：采用网络药理学以及分子对接技术分析恒古骨伤愈合剂促进骨折愈合的机制。方法：通过检索TCMSP等数据库获得恒古的主要化合物成分和靶点及疾病靶点。将药物和疾病共有靶点制作成韦恩图，建立PPI网络，对PPI网络进行拓扑分析，MC0DE版块进行聚类分析，筛选出核心基因。构建成分–疾病–靶点网络图。使用R4.0.3软件进行GO功能富集和KEGG信号通路富集分析，之后构建成分–疾病–通路–靶点网络。采用AutoDockTools 1.5.7软件将关键活性成分和核心靶点进行分子对接，运用PyMOL对对接结果进行可视化。结果：获得恒古相关药物化合物成分106个，相关靶点946个；骨折愈合靶点2519个，疾病和药物共有靶点164个。PPI网络中有164个节点，3347条边。拓扑分析总共筛选出个82关键靶点。MCODE聚类分析总共得到6个基因簇和5个核心基因，成分–疾病靶点拓扑分析筛选出5个关键成分。GO富集总共富集到2474条生物过程，160项分子功能相关，91项细胞组成相关。KEGG通路富集总共富集到168条信号通路。分子对接结果显示，恒古的活性成分与骨折愈合的靶点基因有着很好的结合作用。结论：恒古骨伤愈合剂促进骨折愈合具有多通路、多成分、多靶点、多机制的特点。

Abstract: Objective: To analyze the mechanism of Osteoking promoting fracture healing by network pharmacology and molecular docking technology. Methods: By searching TCMSP, Batman-TCM, NCBI and other databases, the main compounds, targets and disease targets of Osteoking were obtained. The selected common targets of drugs and diseases were made into Wayne diagram, and then imported into STRING database to obtain PPI network. The PPI network was imported into Cystoscape3.8.0, and the Network Analyzer tool was used for topology analysis, and MC0DE was used for cluster analysis to screen out the core genes and construct the component-disease-target network diagram. AutoDockTools1.5.7 software was used to make molecular docking between key active ingredients and core targets, and PyMOL was used to visualize the docking results. Results: 106 components and 946 related targets of Osteoking related drugs were obtained. There are 2519 targets for fracture healing, and 164 targets for diseases and drugs. There are 164 nodes and 3347 edges in PPI network. A total of 82 key targets were selected by topological analysis. A total of 6 gene clusters and 5 core genes were obtained by MCODE cluster analysis, and 5 key components were selected by component-disease target topology analysis. GO enriched a total of 2474 biological processes, 160 related to molecular functions and 91 related to cell composition. KEGG pathway is enriched to a total of 168 signal pathways. The results of molecular docking show that the core target protein has a strong binding ability with the corresponding main components, which indicates that the active components of Osteoking have a good binding effect with the target genes of fracture healing. Conclusion: Osteoking has the characteristics of multi-pathway, multi-component, multi-target and multi-mechanism in promoting fracture healing.

1. 背景

骨折在骨科十分常见[1]，加快骨折愈合具有十分重要的意义，能有效减少骨折不愈合率，降低内固定失败等相关并发症。有数据显示，美国每年大约有2000万名骨折患者[2]，约10%的患者发生了骨折延迟愈合甚至不愈合，这些患者产生了更长的住院时间，花费了更多的医疗费用，导致了断钉、断板等各种并发症，严重的患者甚至可能死亡，造成了巨大的社会经济负担[3]-[6]。因此临床选择合理有效的治疗手段促进骨折愈合，如何能安全、高效、经济地加快骨折患者骨组织修复速度越来越受到人们的关注[7]。云南彝药恒古骨伤愈合剂是由三七、红花、陈皮等药物制成(以下简称恒古，赛灵药业科技集团股份有限公司市售产品)，在骨科应用广泛，能起到消肿止痛的作用，对股骨头坏死也有一定的疗效，特别在促进骨折愈合上有独到的疗效，其在加速骨折修复、促进骨折愈合方面具有显著疗效[8]。服用方式：成人一次25 mL，六至十二岁一次12.5 mL，每二日服用1次。应用中药促进骨折愈合具有安全、经济的特点，符合国人用药习惯，应用前景广阔。但是恒古促进骨折愈合的具体作用机制尚不清楚，本研究采用网络药理学以及分子对接技术对恒古促进骨折愈合的机制进行研究，探讨其可能作用的通路、靶点，为进一步研究恒古提供基础。

2. 方法

2.1. 成分靶点信息查询

在TCMSP [9]检索恒古中药成分的化合物成分和靶点，筛选条件为：OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18。由于TCMSP未收录鳖甲，鳖甲的化合物成分使用Batman-TCM数据库[10]进行检索，选取得分 > 20分的成分靶点纳入。所有靶点经uniprot数据库[11]校正，只保留人类相关靶点。

2.2. 疾病靶点查找

以“Fracture healing”为关键词，在GeneCards [12]、NCBI [13]，OMIM数据库[14]进行检索。

2.3. 韦恩图

将筛选出来的“骨折愈合”相关靶点和恒古靶点制作成为韦恩图。

2.4. PPI网络构建

使用String数据库[15]进行PPI网络构建。

2.5. 拓扑分析

使用Cystoscape 3.8.0 [16]进行拓扑分析，并通过degree排序，选取关键靶点。选取方式：将String数据库中所得的TSV文件导入Cystoscape，并使用CytoNCA插件对各靶点进行评分，得到评分(BC, CC, DC, EC, LAC, NC)并取各评分中位值以上的靶点，以同样的方式进行多次筛选最终取得适量关键靶点。

2.6. MCODE聚类分析

使用MCODE分析[17]进行核心基因的筛选，筛选方式：节点度数degree阈值设置大于等于2，移除只有一个链接的点，Node Score Cutoff值设置为0.2，K-core值设置为2，Max depth值设置为100。

2.7. 成分-疾病靶点网络构建

在Cytoscape 3.8.0软件中进行网络图的绘制。

2.8. 关键成分筛选

将上述网络图，导入Cytoscape 3.8.0中进行拓扑分析。

2.9. GO富集分析

将药物疾病共有靶点进行GO富集，引用String数据库，将校正P值 < 0.05的项目进行筛选。使用R 4.0.3软件，安装并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，进行柱状图和气泡图绘制。

2.10. KEGG通路富集

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，绘制柱状图和气泡图。

2.11. 成分–疾病–通路–靶点网络构建

使用Cytoscape 3.8.0绘制通路网络图。

2.12. 分子对接

在PubChem数据库下载活性成分的2D结构，使用相应软件进行结构优化，作为对接配体。在PDB数据库中下载核心靶点蛋白结构，对靶点蛋白去除水分子、原配体、增加氢键等相关操作后保存为pdbqt格式文件，作为对接受体。将获得的配体、受体载入AutoDockTools 1.5.7，通过设置Grid Box格点中心位置坐标，定义盒子大小，获得相关数值。进行分子对接，并可视化处理。

3. 结果

3.1. 药物成分靶点(表1)

Table 1. Constituent target

表1. 成分靶点

中药	化合物成分	靶点
陈皮	5	65
杜仲	28	198
红花	22	203
黄芪	20	194
人参	22	111
三七	8	173
鳖甲	1	2

3.2. 疾病靶点

在GeneCards数据库获得2518个相关靶点；NCBI数据库得到59个；OMIM数据库获得7个。筛选之后，得到2519个“骨折愈合”的相关基因。

3.3. 共同靶点

经过Venny 2.1处理，得到164个共有靶点(图1)。

Figure 1. Wayne diagrams for common targets

图1. 共同靶点韦恩图

3.4. PPI网络

得到的PPI网络中有164个节点，3347条边，平均度值为40.8，其中节点颜色和大小根据度值调整，度值越大，颜色越红，线条越粗，edge betweenness越大(图2)。

Figure 2. Network diagram for PPI

图2. PPI网络图

2.5. 拓扑分析

拓扑分析总共筛选出个82关键靶点，将前20个靶点使用R 4.0.3进行图片绘制，横坐标为靶点的度值(图3)。

Figure 3. Key target prediction

图3. 关键靶点预测

3.6. MCODE聚类分析

MCODE聚类分析总共得到6个基因簇和5个核心基因，核心基因为PON1，SERPINE1，RXRA，VDR，NFKBIA (表2)。

Table 2. MCODE cluster analysis details table

表2. MCODE聚类分析详细信息表

Cluster	Network	Nodes	Edges	Node IDs
1		60	1346	MAPK3, CRP, PGR, NR3C1, IL4, IFNG, APP, IL2, TGFB1, CDK2, TIMP1, HMOX1, ADIPOQ, CREB1, IL6, CASP1, CDK4, FOS, MDM2, AKT1, CDKN1A, CASP3, MAPK14, ALB, CCND1, EGFR, IL10, ESR1, NFKBIA, MAPK1, HIF1A, IKBKB, PTEN, PPARA, MCL1, MAPK8, SPP1, MMP9, HSP90AA1, CASP8, JUN, STAT1, RELA, PTGS2, CTNNB1, CASP9, SELE, NOS2, NFE2L2, CXCL8, MMP3, VCAM1, CYCS, MYC, PPARG, CXCL10, ICAM1, IL1B, BCL2L1, IL1A
2		19	54	AR, RB1, RAF1, HSPB1, NCF1, NFATC1, CASP7, MET, GSK3B, MMP1, PARP1, ESR2, MPO, SERPINE1, NOS3, MMP2, RUNX2, KDR, PLAU
3		5	8	CYP1A1, CYP1B1, CYP3A4, PON1, NR1I2
4		14	20	BIRC5, IGF2, CAV1, E2F1, SLC2A4, NQO1, CYP19A1, AHR, BCL2, IGFBP3, SOD1, ERBB3, GSR, VDR
5		3	3	OLR1, LDLR, APOB
6		3	3	NCOA2, NCOA1, RXRA

3.7. 在Cytoscape 3.8.0中绘制成分–疾病靶点网络图(图4)

Figure 4. Component-disease-target network diagram

图4. 成分–疾病–靶点网络图

3.8. 关键成分筛选

拓扑分析完成后，将成分进行degree排序，此处仅罗列前5个关键成分(表3)。

Table 3. Key ingredient list

表3. 关键成分表

ID	Name	Average Shortest Path Length	Betweenness Centrality	Closeness Centrality	Degree
MOL000098	quercetin	1.863636	0.170678	0.536585	106
MOL000006	luteolin	2.384298	0.033252	0.419411	47
MOL000422	kaempferol	2.334711	0.038665	0.428319	47
MOL002714	baicalein	2.549587	0.012716	0.39222	27
MOL005828	nobiletin	2.541322	0.014345	0.393496	27

3.9. GO富集分析

GO富集总共富集到2474条生物过程，160项分子功能，91项细胞组成，绘制气泡图如下(图5)。

Figure 5. GO enrichment

图5. GO富集

3.10. KEGG通路富集

KEGG通路富集总共富集到168条信号通路，并绘制气泡图(图6)。

Figure 6. KEGG enrichment

图6. KEGG富集

3.11. 成分–疾病–通路–靶点网络构建

构建成分–疾病–通路–靶点网络图，以便更直观地展示中药多成分–多靶点的作用特点(图7)。

Figure 7. Component-disease-pathway-target network diagram (note: top 20 most prominent pathways in green, diseases in orange, TCM in purple)

图7. 成分–疾病–通路–靶点网络图(注：绿色为最显著的前20条通路，橙色为疾病，紫色为中药)

3.12. 分子对接结果

分子对接结果显示，槲皮素，木犀草素，山奈酚，黄芩素，川陈皮素与ALB，AKT1，IL6，JUN，IL1B均存在结合位点，其对应的最低结合能见表4，对接结果显示主要化合物与核心靶点的结合能均 < −5.0 kJ/mol，对接结果表明了恒古的活性成分与骨折愈合的靶点基因有着很好的结合作用。其中部分活性成分与关键靶点氢键连接情况见图8。

Table 4. Docking of major compounds to core targets (kcal/mol)

表4. 主要化合物与核心靶点对接情况(kcal/mol)

靶点/化合物	Quercetin	luteolin	kaempferol	baicaletin	nobiletin
ALB	−8.683	−9.285	−8.854	−9.639	−7.05
AKT1	−6.345	−6.314	−6.039	−6.803	−5.848
IL6	−6.742	−7.082	−6.665	−6.907	−5.772
JUN	−6.594	−6.487	−6.427	−6.422	−6.05
IL1B	−7.291	−7.74	−7.067	−7.461	−6.322

Figure 8. Molecular docking graph

图8. 分子对接图

4. 讨论

良好的骨折复位、有效的固定是骨折愈合的必要条件，但是很多患者在固定之后依然发生骨折延迟愈合。骨折的生长、愈合过程是一个动态的过程，需要经历不同的时期，涉及多因素、多靶点、多通路、多个生物机制[18]-[20]，骨折延迟愈合甚至不愈合在骨折患者十分常见，骨折部位因为各种因素出现不愈合的情况，会对内固定物带来更多的应力，时间过长后，内固定物容易发生断裂、拔出等并发症，患者的肢体功能不能得到有效恢复，有的患者病程较长，带来沉重的经济负担和心理压力，对生活质量造成严重的负面影响[21]-[23]，在世界范围内都是骨科关注的重点。恒古具有活血益气、接筋续骨等功效，可改善骨折局部微循环，增加骨折的血供，促进骨痂形成，能有效促进骨折愈合[24]。但是恒古作为一个中药制剂，其中含有多味中药，含有多种有效成分、对许多靶点、通路都能产生影响，其促进骨折愈合的机制还需要进一步研究，本研究通过网络药理学和分子对接的技术对恒古促进骨折愈合的机制进行了初步探讨。

本次研究得到的潜在靶点有ALB、AKT1、IL6、JUN、IL1B、CASP3、CTNNB1、EGFR、MAPK3、PPARg等，其中很多靶点在促进骨折愈合方面发挥了重要作用。

PI3K/AKT/mTOR是一个重要的细胞内信号转导系统，涉及细胞活动的各个方面。近年来研究表明，某些植物提取物能够控制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而激活自噬，刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时，PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂在阻断传导后，可以显著降低破骨细胞的发育，减少骨溶解。自噬在对调节骨折愈合具有重要作用，AKT1是该通路的关键传导环节，Tang等[25]发现，β-蜕皮甾酮可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而激活成骨细胞自噬，增加ALP活性，上调RunX2表达，并且减少成骨细胞凋亡，达到促进骨折愈合的目的。脑源性神经营养因子(BDNF)有促进骨折愈合的作用，但是既往对其研究较少，最新的研究显示，BDNF/TrkB轴可能通过调节ERK1/2和AKT相关信号通路，上调大鼠MC3T3-E1细胞中整合素β1的表达和增加成骨细胞迁移，从而促进骨折愈合[26]。IL-6在骨折的初期表达较高，说明其可能在骨折修复的炎症阶段发挥作用，IL-6基因敲除小鼠在应力性骨折后骨形成更为活跃，表明IL-6可能对膜内成骨有抑制作用[27]。JUN可以促进骨髓间充质的成骨分化，c-Jun可以调节的RUNX2表达，RUNX2是成骨的主要转录因子，c-Jun可以将乙酰转移酶p300募集到RUNX2启动子，促进组蛋白3在K27位点的乙酰化，从而激活RUNX2基因转录，促进成骨[28] [29]。

但是在这些靶点中，也有部分靶点尚未被证实与促进骨折愈合具有明显相关性，如：ALB，这些靶点可能是未来的研究方向，也有可能是网络药理学研究的不足之处和局限性。

关键成分显示：槲皮素具有增加成骨细胞活性，抑制破骨细胞，并且能够诱导破骨细胞凋亡，促进骨折愈合的功能[30]，并且最新研究发现，槲皮素能够抑制IL-17诱导的RAW264.7细胞定向分化破骨细胞的形成过程[31]。有文章显示，木犀草素能上调小鼠成骨细胞MC3T3-E1 ALP及骨钙素的表达[32]，在适宜浓度下能促进牙周膜细胞群的增殖和骨向分化，对于骨折的愈合具有促进作用。

山柰酚具有骨保护特性，山奈酚补充剂在新生大鼠、糖皮质激素诱导的骨质疏松模型，卵巢切除的骨质疏松模型以及骨折模型中显示出促进骨形成、抗骨质疏松作用。其作用机制是通过调节雌激素受体、骨形态发生蛋白-2、核因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶和雷帕霉素靶点介导的mTOR信号通路来实现的，还可以通过抑制炎症、氧化应激，调控破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，同时激活成骨细胞自噬，在骨折愈合中起正向作用[33]。

毕磊等报道了黄芩素可能通过调节Nrf2/NF-κB/NFATc1信号通路抗炎、抗氧化应激反应，达到降低牙槽骨吸收度的目的[34]。付方胜等人使用黄芩素干预RANKL诱导的破骨细胞分化过程，观察到黄芩素不仅可以抑制破骨细胞的形成，还可以负向调节破骨细胞的骨吸收功能[35]。

GO富集显示：恒古通过调控细胞对化学应激、氧化应激、营养水平、类固醇激素等的反应以及调控DNA结合转录因子、细胞因子活性、转录因子活性、DNA聚合酶活性等生物过程来促进骨折愈合。KEGG富集显示：恒古可以作用于AGE-RAGE，IL-17，肿瘤坏死因子等信号通路来干预骨折愈合。其中AGE/RAGE可以通过调控炎症和氧化损伤直接影响骨组织，并且还可以导致多种信号的激活，包括PKC、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、MAPK/ERK、Src/RhoA、JAK/STAT、NAD和TGF-β等[36]。这些通路最终都会对骨折愈合产生影响，但是其机制较为复杂，AGEs最初可以增加人成骨细胞中osterix的表达，促进成骨细胞生长和细胞碱性磷酸酶活性，但在后期主要通过与RAGE相互作用，激活caspase-3信号通路，诱导成骨细胞凋亡细胞死亡，增加细胞内ROS的产生，降低碱性磷酸酶活性和MAPK的活化[37]。AGEs对osterix、碱性磷酸酶和RANKL产生不同结果的原因可能与AGEs对细胞功能的评估时机AGE的剂量相关。目前的研究大多认为AGE/RAGE主要对骨折愈合产生不利影响，其可以上调破骨细胞分化以及其活性，需要进一步探索和研究[38]。除此之外还可以作用于脂质和动脉粥样硬化，人巨细胞病毒感染、肝炎病毒等，但是这部分结果的意义可能不大。

分子对接显示：恒古活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、诺比列汀与关键靶点ALB、AKT1、IL6、JUN、IL1B的具有可靠的结合能力，5个主要活性成分与5个关键靶点间均存在结合位点，最低结合能 < −5.0 kJ/moL，主要存在氢键连接等分子间结合力。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术，证明了恒古促进骨折愈合的有效性，表明恒古促进骨折愈合具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，分析了恒古促进骨折愈合的有效化学成分，预测了可能的作用机制、靶点等，为之后进一步探索恒古促进骨折愈合的作用机制提供了参考方向和依据。

NOTES

^*通讯作者。