1. 引言
肝细胞肝癌是肝脏最常见的恶性肿瘤，在全球范围内位居恶性肿瘤发病率第五位，其致死率较高，并且近年来发病率呈现上升趋势。尽管手术切除被认为是治疗原发性肝癌的最有效手段，但术后复发和转移率较高，对于无法进行手术切除的患者，缺乏有效的治疗选项。原位肝移植被认为是治疗终末期肝病的理想选择，但由于供体短缺、高昂的手术费用以及长期使用免疫抑制剂的需求等因素，限制了其在临床上的广泛应用。随着干细胞研究的不断深入，该领域取得了显著进展，并为肝癌治疗提供了新的思路。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为一种治疗手段，相较于传统方法具有多项优势：首先，它们易于获取，可以直接从患者体内提取；其次，BMSCs能够在体外进行培养、扩增，并可被诱导分化为特定的细胞类型，之后重新输回患者体内；此外，BMSCs具有较高的安全性，不会引起异体排斥反应，并避免了与胚胎干细胞研究相关的伦理问题。本文旨在对BMSCs在肝癌治疗领域的研究进展进行综述。
2. BMSCs的生物学特征
2.1. BMSCs的来源及生物学特性
间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，属于基质细胞类别，具备显著的再生潜力和免疫调节能力，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，但也可以从其他组织中获取，如脐带血、脂肪组织[1]，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞是骨髓腔内骨膜表面基质细胞的一个亚群。可以从小梁骨和密质骨以及非造血骨髓部位中分离出在许多方面与骨髓间充质干细胞相同的细胞。它们在骨髓微环境中扮演着关键角色，为造血干细胞和祖细胞提供必要的支持。
骨髓间充质干细胞具有自我更新能力，能够分裂并产生更多的干细胞，且具有归巢及免疫调节能力，在体内或体外条件下，能够迁移到特定的损伤或炎症部位，对再生医学中的应用起到至关重要的作用。
2.2. BMSCs的定向分化能力
骨髓间充质干细胞(BMSCs)具备显著的自我复制能力和多向性分化潜能。这些细胞能够在体外维持未分化状态，并展现出强大的增殖能力，便于在实验室条件下进行大规模培养。在特定的体内外条件刺激下，它们能够分化成多种组织细胞类型，包括跨胚层分化能力，例如可以分化为成骨细胞(Osteoblasts)、肌肉或肌腱[2]，为临床治疗各种创伤提供细胞来源；间充质干细胞还可以分化为心肌细胞(Cardiomyocyte)，在显微镜下，能观察到心肌组织中的细胞株出现自发搏动；用间充质干细胞分化为真皮组织，可覆盖于烧伤创面，还可以分化为脂肪细胞(Adipocytes)、肌细胞(Myocytes)、神经细胞(Neurocytes)以及软骨细胞(Chondrocytes) [3]。BMSCs的分化方向受表观遗传机制精细调控，涵盖DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA的调控。这些机制相互协作，共同决定BMSCs的分化路径[4]。并且BMSCs分化过程中会表达特定的细胞表面标志物，如成骨分化时表达碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)和骨钙素(Osteocalcin)，成脂分化时表达脂联素(Adiponectin)和过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR-γ) [5]。
2.3. BMSCs的免疫调节作用
骨髓间充质干细胞(BMSCs)的免疫调节作用包括细胞间相互作用和旁分泌活动。细胞间相互作用是指BMSCs通过直接的物理接触影响免疫细胞的功能。例如，BMSCs能够通过非认知方式阻碍原始和记忆T细胞与抗原呈递细胞(APCs)的结合。这种功能通过增强血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)和细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)的分泌来实现，有利于T细胞的激活和白细胞向炎症部位的募集，这在免疫抑制能力中起着关键作用[6]。旁分泌活动则为BMSCs通过旁分泌的方式分泌多种生物活性因子，如细胞因子、生长因子和趋化因子，对适应性免疫和先天免疫系统产生影响，从而发挥免疫调节作用。这些因子包括前列腺素E2 (PGE2)、转化生长因子β (TGF-β)、白细胞介素(ILs)等，它们能够抑制T细胞的增殖[7]并影响树突状细胞(DCs)的成熟和功能[8]。BMSCs通过以上两种方式在免疫调节中发挥关键作用。
3. BMSCs在肝癌治疗中的作用机制
3.1. BMSCs促进肝细胞的再生
肝脏内多种细胞群，包括肝实质细胞(Hepatocytes)、胆管上皮细胞(Cholangiocytes)、Kupffer细胞(肝脏巨噬细胞)和内皮细胞(Endothelial Cells)，在经历肝部分切除术后，能够迅速响应并启动肝脏再生过程[8]。如若在肝受损严重的情况下，肝祖细胞也会被激活，并且作为号称祖细胞的储存池的骨髓也会一起参与到肝再生的过程中。BMSCs是一类起源于骨髓的非造血基质细胞，是一种具有强大的增殖和分化潜能的干细胞。Qihao [9]等人通过BMSCs与成熟肝细胞的共培养体系，成功诱导BMSCs分化为肝样细胞。研究发现，共培养的细胞展现出典型的肝细胞形态特征，并具有较高的增殖能力。此外，这些细胞在mRNA和蛋白质水平上均表达白蛋白、甲胎蛋白(AFP)和细胞角蛋白18，进一步证实了其肝细胞特性。综上，BMSCs有分化成肝样细胞的潜能来促进肝细胞的再生。
3.2. BMSCs抑制肝癌细胞增殖和侵袭
BMSCs在肝癌细胞治疗中的研究尚处于初级阶段，其可能通过靶向抑制恶性肿瘤细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶B (Akt)，进而调控磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-Akt信号传导途径，该途径在调节肿瘤细胞生存与增殖中扮演着关键角色。Akt异常活化不仅促成细胞的恶性转化，同时也与肿瘤细胞的侵袭、黏附、新生血管形成以及细胞外基质降解等病理过程有着直接的关联。其次骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)可能参与调节人源间充质干细胞(hMSCs)对Wnt信号通路的抑制效应，该通路涉及一系列信号传导蛋白成员。Wnt信号通路的激活可由通路中任一成员蛋白的突变或功能异常触发，进而引发细胞增殖失调，最终可能导致肿瘤的形成和发展[9]。BMSCs已被证实能够通过产生活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，这些活性分子通过下调T细胞受体链的表达、损害白细胞介素-2受体(IL-2R)信号传导途径、以及干扰TCR与主要组织相容性复合体(MHC)分子的相互作用，从而抑制T细胞的功能，进而抑制癌细胞的增殖[10]。
3.3. BMSCs调节肝癌肿瘤微环境
BMSCs在调节肝肿瘤微环境中的免疫细胞，尤其是巨噬细胞和树突状细胞(DCs)方面，发挥着重要作用。
3.3.1. BMSCs对巨噬细胞的调节
BMSCs对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的极化具有调控作用。在肝癌的微环境里，TAMs大多呈现出M2型的特征，这一特征与肿瘤生长的促进和免疫抑制功能密切相关。BMSCs或许通过释放特定的分泌因子，影响TAMs的极化状态，并且通过调节如透明质酸等代谢产物和可溶性因子，促进TAMs的激活与分化，进而对其功能进行调控[11]。
3.3.2. BMSCs对树突状细胞(DCs)的调节
大多数研究者认同，肿瘤组织微环境中富含的多种细胞因子，无论是单独作用还是相互作用，均能抑制树突状细胞(DCs)的抗原呈递能力，导致机体无法有效启动抗肿瘤免疫反应。故肝癌细胞分泌的因子能够营造微环境，对DCs的线粒体功能产生影响，进而损伤其免疫功能，并且BMSCs可能影响DCs从不成熟DCs (imDCs)向成熟DCs (mDCs)的成熟过程，导致DCs的抗原呈递能力下降[12] [13]。
4. BMSCs治疗肝癌的可优化方向
4.1. 通过预处理BMSCs以增强治疗疗效
慢性肝病对健康是全球范围的一大威胁，许多种因素都会可能引起，其中慢性肝损伤最为值得关注，因为他可能会发展为肝硬化甚至肝癌，炎症在其中起到了关键作用。目前我们迫切需要有效的方法来解决这一难题，在寻找治疗方法过程中，BMSCs因其组织修复和免疫调节能力备受关注，但是直接移植BMSCs会引起细胞排斥、存活率低等各种潜在的风险，这也将BMSCs用于治疗的想法大打折扣。近年来的研究发现，BMSCs发挥治疗作用主要通过旁分泌机制，其中BMVSC衍生的细胞外囊泡(BMSC-EVs)尤为关键。这些纳米级的膜囊泡含有核酸，蛋白质和脂质等，是细胞间通讯的重要介质，在调节巨噬细胞极化和减轻炎症方面表现出潜力，但抗炎效果还不够理想。
Xiaodan Jiang [14]等研究人员发现使用槲皮素(Que)预处理BMSCs来获取的细胞外囊泡(EVs)可能是优化慢性肝病(CLD)治疗的有效策略。研究人员从BALB/C小鼠的骨髓中分离培养出BMSCS，并对其进行鉴定。然后，用不同浓度的槲皮素处理BMSCs，通过CCK-8实验确定了能诱导BMSCs分泌Que-EVs的合适浓度(0.5 µM, 48 h)。接着，他们从BMSCs的上清液中提取EVs，并鉴定发现EVs和Que-EVs具有相似的大小和形态，直径约为60 nm，且表达经典的表面标志物。为了探究EVs和Que-EVs在体内的分布，研究人员用荧光染料DIR标记它们，然后静脉注射到小鼠体内，6小时后发现它们主要在肝脏积累。在体外实验中，将DIR标记的EVs和Que-EVs与RAW264.7细胞共孵育12小时，观察到细胞内有强烈的荧光信号，表明RAW264.7细胞摄取了这些囊泡。在炎症相关研究中，研究人员用脂多糖(LPS)处理RAW264.7细胞来模拟炎症环境。LPS显著降低了RAW264.7细胞的活力井诱导炎症反应，但EVs和Que-EVs能抑制炎症，降低炎症因子的mRNA表达，增加抗炎因子的表达，且Que-EVs的效果更为明显。巨噬细胞在炎症调节中起着重要作用，分为促炎的M1型和抗炎的M2型。实验发现，EVs和Que-EVs能抑制M1型巨噬细胞极化，促进M2型巨噬细胞极化，从而减轻炎症，Que-EVs的作用更强。进一步的机制研究发现，EVs和Que-EVs通过调节GNAS/PI3K/ERK/STAT3信号通路相关蛋白和基因的表达来减轻炎症，Que-EVs对该通路的抑制作用更显著。同时，研究人员还发现miR-136-5p在慢性肝损伤中表达下调，而在Que-EVs中的表达高于普通EVs。miR-136-5p通过靶向抑制GNAS，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症和M1型巨噬细胞极化，发挥抗炎作用。在动物实验中，研究人员通过给小鼠注射四氯化碳(CCl4)建立了CLD模型，然后将小鼠分为模型组、EV组和Que-EV组，分别给予相应处理。结果显示，EVs和Que-EVs能改善CLD小鼠的肝脏炎症、纤维化程度，降低血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平，改善肝脏功能，调节巨噬细胞极化，抑制GNAS/PI3K/ERK/STAT3通路相关蛋白和基因的表达，且Que-EVs的治疗效果优于普通EVs。该研究表明Que-EVs通过miR-136-5p抑制GNAS/PI3K/ERK/STAT3信号通路，调节巨噬细胞极化，从而减轻炎症和慢性肝损伤。这意味着用槲皮素预处理BMSCs来获取EVs可能是优化CLD治疗的有效策略，为未来基于EVs的慢性肝病治疗提供了新的思路和方向。
Amira Awadalla [15]等首先将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外用透明质酸(HA)处理了14天，提高了细胞的生存能力和迁移能力。随后，将这些预处理的BMSCs注射到阿霉素(DOX)诱导的肝损伤大鼠体内，以评估其对肝功能的改善效果。实验结果表明HA预处理的BMSCs能够显著降低血清中的肝酶水平(如ALT和AST)，同时提高了白蛋白水平。此外，HA预处理的BMSCs能够上调抗氧化酶(如SOD和GSH)的活性，上调了抗氧化和抗凋亡标志物(如Nrf-2、HO-1、BCL2)的表达，降低了氧化应激标志物MDA的水平，并下调了促纤维化和促炎标志物(如VEGF、Wnt7b、β-连环蛋白、FN1、Col-1、TGFβ1、iNos、Bax、IL-6、TNF-α)的表达，这些均表明HA预处理的BMSCs通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路，减少了肝纤维化的发生，并通过调节炎症反应和细胞凋亡过程，进一步保护了肝脏组织。因此，HA预处理的BMSCs有望成为一种有效地减少化疗药物肝毒性的替代疗法，为临床治疗提供了新的思路和方法。
4.2. BMSCs对高转移肝癌可调整时间依赖性
李天然[16]等研究者通过将BMSCs移植到高转移潜能肝癌动物模型中，来观察BMSCs对该类型肝癌组织的影响。首先，通过将人高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-H)接种于Balb/c裸鼠腋部皮下，建立高转移潜能肝癌动物模型。随后，实验组动物在肿瘤接种后第7天起，通过尾静脉注射5 × 105个BMSCs，每周两次，连续6周；对照组则注射等量BMSCs培养液。在实验期间，每4天测量一次肿瘤体积，并在肿瘤接种后的第14天、21天、28天、35天和42天处死动物，记录肿瘤质量和体重，计算肿瘤质量抑制率。此外，利用实时定量PCR (Q-Real time-PCR)检测动物模型标本中转移相关因子(骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素αⅤ)及凋亡相关因子(bcl-2, bax, caspase3)的基因表达。该实验表明BMSCs对肝癌组织的影响存在时间和剂量依赖性。BMSCs移植后第3周，肿瘤抑制率最高(52.00%)，随后逐渐下降，到第6周时降至30.23%。实验中采用了固定剂量(5 × 105/次，2次/周)进行干预，BMSCs干预后，骨桥蛋白(OPN)、骨唾液蛋白(BSP)、整合素αV的表达均明显下降，并随着时间的推移进一步降低，肿瘤转移过程，其表达下调可能抑制肿瘤细胞的粘附和侵袭能力。且BMSCs干预后，bcl-2的表达呈下降趋势，bax、caspase-3的表达呈上升趋势，表明BMSCs可能促进肿瘤细胞的凋亡。该实验证明了BMSCs对高转移潜能肝癌组织具有一定的抑制作用，这种作用具有时间和剂量依赖性。BMSCs可能通过抑制转移相关因子(如OPN、BSP、整合素αV)的表达，促进肿瘤细胞的凋亡(如上调bax和caspase-3，下调bcl-2)来发挥抗肿瘤作用。然而，BMSCs对肿瘤的抑制作用随时间推移逐渐减弱，具体机制尚需进一步研究。
4.3. 加强对BMSCs表面标记物修饰
可以利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs) [17]标记BMSCs的物理方法，磁性纳米颗粒通过FeCl2和FeCl3，它们在碱性条件下反应生成Fe3O4纳米颗粒，实现磁性氧化铁纳米颗粒的制备，并在SPIONs表面涂以包括带正电荷的转染剂，如多聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白等分子材料进行修饰，它们可以通过静电作用与带负电的SPIONs结合。通过静电包覆的方式，使带负电的BMSCs通过非特异性膜表面吸收过程摄取铁颗粒进入细胞内以增强其与BMSCs的相互作用。这种方法依赖于修饰剂与SPIONs之间的静电相互作用，以及修饰后的SPIONs与BMSCs之间的相互作用。叶酸偶联的SPIONs可以利用其表面的叶酸与叶酸受体的高强结合作用被高效介导进入肿瘤细胞内。这种策略可以增强SPIONs的细胞毒性小，并且通过其表面的叶酸与叶酸受体的结合作用被高效介导进入肿瘤细胞内，增强MR成像中肿瘤组织与周围正常组织的对比。通过上述方法，SPIONs可以有效地标记BMSCs，用于细胞磁共振活体示踪和细胞磁靶向研究，成为探索细胞移植机制和改善疗效的有力工具。
5. 发展前景与展望
骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)在肝细胞癌(HCC)的治疗领域展现出卓越的分化多功能性、免疫调节作用、肿瘤抑制效应及归巢能力，成为肝组织工程及细胞疗法领域的重要候选项。通过预处理BMSCs，可以进一步增强其治疗效果。且BMSCs通过释放肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等生物活性分子，促进受损肝脏组织的修复与血管形成，同时，其低免疫原性属性降低了异体移植过程中的免疫排斥反应。此外，BMSCs作为基因传递的媒介，能够精准递送治疗基因至肝癌细胞，增强局部药物治疗浓度并降低全身性不良反应。并且随着基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas9系统的进步，骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基因组工程化水平得到显著提升，进而使其具备作为抗肿瘤基因、自毁基因或免疫激活分子递送平台的潜力，实现对肝细胞癌的定向杀伤作用。然而，在BMSCs的临床应用中，仍然存在一些挑战需要解决，特别是体内分化调控、长期疗效和安全性问题。为了克服这些难题，优化BMSCs的培养参数和分化条件，增强其向肝脏组织的归巢效能和治疗响应性至关重要。此外，针对BMSCs在体内的长期存活和功能持续性，研究者们正在深入探讨如何通过基因调控、药物干预或细胞表面修饰来提升其在体内的持久性和安全性评估。通过这些创新性措施，BMSCs有望克服现有局限，成为肝癌治疗策略中的重要细胞治疗资源，并进一步推进其在临床中的广泛应用。
NOTES
*通讯作者。