溃疡性结肠炎对帕金森病的影响：肠道炎症、屏障功能损伤与神经炎症的研究

Impact of Ulcerative Colitis on Parkinson’s Disease: A Study on Gut Inflammation, Barrier Dysfunction, and Neuroinflammation

摘要: 目的：本研究旨在探讨溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是否通过肠道–脑轴机制加重帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)的神经病理表现，并揭示肠道炎症及屏障损伤在其中的潜在作用机制。方法：将7周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为四组：对照组(CON组)、结肠炎组(DSS组)、PD模型组(MPTP组)、联合模型组(MPTP + DSS组)，每组6只。小鼠适应性饲养一周后进行以下处理：CON组腹腔注射生理盐水5天并持续饲养生理盐水；DSS组腹腔注射生理盐水5天，饲养21天后用2.5%葡聚糖硫酸盐(DSS)溶液诱导结肠炎；MPTP组腹腔注射30 mg/kg 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP) 5天并持续饲养28天以建立PD模型；MPTP + DSS组同样腹腔注射MPTP 5天，饲养21天后用2.5% DSS溶液诱导结肠炎。收集小鼠组织，利用高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(DA)水平；通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测结肠和黑质的炎症因子表达水平以及结肠紧密连接蛋白水平。结果：与MPTP组相比，MPTP + DSS组小鼠的纹状体DA水平显著降低(P < 0.05)，黑质炎症因子(IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α)表达显著升高(P < 0.05)。结论：本研究表明，溃疡性结肠炎通过破坏肠道屏障并激活肠–脑轴的炎症反应，进一步降低了PD小鼠纹状体DA水平，并增加黑质炎症因子的表达，从而加重了PD小鼠的神经损伤。

Abstract: Objective: This study aimed to investigate whether ulcerative colitis (UC) exacerbates the neuropathological features of Parkinson’s disease (PD) through the gut-brain axis and to explore the potential role of intestinal inflammation and barrier disruption in this process. Methods: Seven-week-old SPF-grade male C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: control (CON), DSS-induced colitis (DSS), PD model (MPTP), and combined model (MPTP + DSS), with six mice in each group. After one week of adaptive feeding, the mice were treated as follows: the CON group received intraperitoneal injections of normal saline for 5 days and continued on a normal saline diet; the DSS group received intraperitoneal injections of normal saline for 5 days, followed by 2.5% dextran sulfate sodium (DSS) solution to induce colitis after 21 days of normal feeding; the MPTP group received intraperitoneal injections of 30 mg/kg 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) for 5 days and were fed normally for 28 days to establish a PD model; the MPTP + DSS group received MPTP injections for 5 days, followed by 2.5% DSS solution to induce colitis after 21 days of recovery. Tissue samples were collected, and striatal dopamine (DA) levels were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC). Inflammatory cytokines in the colon and substantia nigra, as well as tight junction protein levels in the colon, were detected using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Results: Compared to the MPTP group, mice in the MPTP + DSS group exhibited significantly decreased striatal DA levels (P < 0.05) and significantly increased expression levels of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α) in the substantia nigra (P < 0.05). Conclusion: This study demonstrated that ulcerative colitis exacerbates neurodegeneration in PD mice by disrupting the intestinal barrier and activating inflammatory responses along the gut-brain axis. These changes result in reduced striatal DA levels and increased expression of inflammatory cytokines in the substantia nigra, thereby aggravating neurological damage in PD mice.

1. 引言

帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是一种常见的进行性神经退行性疾病，其主要特征为震颤、运动迟缓、僵直及姿势不稳等运动障碍，同时还可能伴随多种非运动症状，是神经系统领域中最重要的疾病之一[1]。尽管PD的确切病因尚未完全阐明，但公认的风险因素包括遗传易感性、环境毒素暴露以及衰老等[2]。近年来，随着“肠–脑轴”(gut-brain axis)概念的提出及深入研究，越来越多的证据表明，肠道微生物群失衡、肠道屏障功能受损以及肠道炎症可能在PD的发病和进展中扮演关键角色[3] [4]。

结肠炎，特别是溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)，是一种常见的慢性炎症性肠病，其主要特征为肠道黏膜的反复炎症及溃疡形成[5]。近年来，UC的发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，尤其是在欧美及亚洲部分地区，其发病率较高，已成为全球公共卫生领域的重要挑战之一[6]。与此相关的研究发现，肠道炎症与PD之间可能存在密切关联。一些临床和实验研究表明，PD患者常伴有显著的肠道功能障碍，如便秘、肠道炎症及肠道屏障损伤等症状[7] [8]。此外，与健康个体相比，PD患者的肠道微生物群组成显著失衡，这提示肠道微生物的改变可能在PD的发病机制中发挥重要作用[9]。研究还发现，肠道病变可能通过肠-脑轴诱发或加剧神经炎症反应，从而加速PD的神经病理性进展[10]。

尽管如此，目前关于结肠炎是否会加重PD病情的研究仍较为有限。特别是基于葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型，对其对PD病理表现影响的研究尚未充分展开。因此，本研究通过建立MPTP诱导的帕金森病小鼠模型，在恢复21天后给予2.5% DSS诱导结肠炎，旨在探讨结肠炎是否会加重PD小鼠的神经病理表现。具体而言，本研究将评估DSS诱导的结肠炎对PD小鼠黑质(substantia nigra)炎症反应、纹状体多巴胺(DA)水平、肠道炎症状况及肠屏障功能的潜在影响，从而为进一步阐明肠道炎症在PD中的作用机制提供新的实验依据，并为相关治疗策略的开发提供理论支持。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

本研究选用了SPF级C57/6J雄性小鼠，7周龄(体重19~21 g)，共24只。所有小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK (湘) 2021-0002；质量合格证号：430727230100805565)。实验期间，小鼠饲养在重庆医科大学动物中心SPF级动物代养室，环境条件为温度22℃~24℃，湿度50%~60%，并实行12小时明暗循环(动物伦理审查批准号：IACUC-CQMU-2024-0907)。

2.2. 主要试剂与仪器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(重庆衍庆生物技术有限公司)；葡聚糖硫酸钠盐(大连美仑生物技术有限公司)；多聚甲醛(成都市科龙化工试剂厂)；氯仿(重庆川东化工有限公司)；异丙醇(重庆川东化工有限公司)；无水乙醇(重庆川东化工有限公司)；TRIzol Reagent (美国GLpBio)；PrimeScriptTM RT Master Mix (日本TaKaRa)；TB Green Premix Ex TaqTMII (日本TaKaRa)；CFX ConnectTM Real-Time PCR仪(美国Bio-Rad)；T100TMThermoCycle PCR仪(美国Bio-Rad)。

2.3. 方法

2.3.1. 动物实验设计

本研究购入24只SPF级C57/6J雄性小鼠(7周龄，体重19~21 g)，适应性喂养7天后，随机分为四个组：CON组、DSS组、MPTP组和MPTP + DSS组。CON组：给予腹腔注射5天无菌生理盐水，饲养28天并喂养生理盐水。DSS组：给予腹腔注射5天无菌生理盐水，饲养21天，随后给予7天2.5%的DSS溶液用于诱导结肠炎。MPTP组：给予5天MPTP腹腔注射，随后饲养28天，用于建立PD小鼠模型。MPTP + DSS组：给予5天MPTP腹腔注射，随后饲养21天，并给予72.5%的DSS溶液诱导结肠炎。

2.3.2. 动物实验设计高效液相色谱仪检测纹状体(DA)水平

使用高效液相色谱法(HPLC)结合荧光检测器(FLD)对小鼠纹状体中的多巴胺(DA)水平进行测定。首先对纹状体组织样本进行预处理，包括匀浆、蛋白沉淀和离心以去除杂质。随后，通过反相色谱柱对样本中的多巴胺进行分离，并使用荧光检测器对其进行定量检测。多巴胺的含量通过测定其荧光信号的峰面积，并结合标准曲线进行计算，从而准确量化小鼠纹状体中DA的水平。

2.3.3. 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测相关炎症因子

通过RT-qPCR法检测结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达。提取RNA并逆转录为cDNA，使用特异性引物进行实时定量PCR，最终通过ΔΔCt法计算各炎症因子的表达水平。所使用的引物序列(见表1)：

Table 1. Primer sequence of the target gene

表1. 靶基因引物序列

Gene	Primer sequence (Forward)	Primer sequence (Reverse)
GAPDH	TGGCCTTCCGTGTTCCTAC	GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA
Occludin	AGCACTTAACCTGCCTGGAT	AGCCTGTGGAAGCAAGAGAT
ZO-1	TCTTGCTGGCCCTAAACCTG	GTTGGGCTGGCTCTGAGAAT
IL-1β	GAAATGCCACCTTTTGACAGTG	TGGATGCTCTCATCAGGACAG
IL-6	CTGCAAGAGACTTCCATCCAG	AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
IL-8	TTGTCAGCAAGGAGTTCT	TAGAGGGTAGTAGAGGTGTT
TNF-α	CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA	TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC

2.3.4. 统计学方法

实验数据以均数 ± 标准误差(Mean ± SEM)表示。统计分析和作图均使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行。各组间显著性差异通过单因素方差分析(ANOVA)检验，P < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 纹状体DA水平的变化

Figure 1. DA content in the striatum

图1. 纹状体中DA含量

DA是中枢神经系统中重要的神经递质，特别在调控运动、情绪和认知功能中起着关键作用。造模后，观察到小鼠有明显的运动功能障碍。根据实验结果，纹状体中多巴胺水平的变化显示，CON组和DSS组之间未见显著差异(P > 0.05)。然而，MPTP + DSS组的多巴胺水平显著低于MPTP组、CON组和DSS组(P < 0.05)。这一结果表明，DSS诱导的结肠炎可能加重了帕金森病小鼠的神经损伤，导致纹状体中多巴胺水平的进一步降低(见图1)。

3.2. 黑质炎症因子的变化

炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)在黑质中的积累和过度激活可导致神经炎症反应的加剧，进一步损伤多巴胺能神经元。根据RT-qPCR检测结果显示，CON组和DSS组之间未出现显著差异(P > 0.05)然而，MPTP + DSS组的黑质炎症因子水平显著高于MPTP组、CON组和DSS组，且差异具有统计学意义(P < 0.05)。这表明，DSS诱导的结肠炎可能通过加重肠道炎症，进而激活黑质中的免疫反应，导致神经炎症的增强，进而加重帕金森病小鼠的病理进展(见图2)。

Figure 2. Expression of inflammatory factors in substantia nigra

图2. 黑质中炎症因子表达情况

3.3. 结肠炎症因子的变化

RT-qPCR检测结果显示，与CON组和MPTP组相比，DSS组和MPTP + DSS组小鼠的肠道炎症因子水平显著升高，而CON组和MPTP组之间未观察到显著差异。这一结果表明，DSS的给予成功诱导了小鼠肠道炎症的激活(见图3)。

Figure 3. Expression of inflammatory factors in colon

图3. 结肠中炎症因子表达情况

3.4. 结肠病理学变化

对照组小鼠的结肠组织显示正常的组织学结构，未观察到任何病理改变。与对照组相比，MPTP组未出现显著的病理变化，仅观察到轻微的隐窝结构损伤。相比之下，DSS组和MPTP + DSS组的小鼠结肠组织均表现出明显的病理损伤，包括严重的隐窝结构破坏、排列紊乱，以及粘膜层内大量炎性细胞浸润(见图4)。

Figure 4. Colon sections stained for HE (×200). A: CON group; B: MPTP group; C: DSS group; D: MPTP + DSS group

图4. 结肠切片HE染色(×200)。A：CON组；B：MPTP组；C：DSS组；D：MPTP + DSS组

4. 讨论

PD以神经退行性变和运动障碍为特征，越来越多的证据表明，肠道健康与中枢神经系统功能密切相关[11]。UC是一种慢性炎症性肠病，特征为肠道黏膜的长期炎症和溃疡形成，通常伴随有肠屏障功能的损害。越来越多的研究表明，帕金森病患者常见早期肠道功能紊乱，包括便秘和肠道炎症等症状，这些症状与神经退行性变化呈现一定的相关性[12]。尽管帕金森病主要是一种中枢神经系统疾病，但日益增多的证据表明，肠道微生物群失衡和肠道炎症可能在帕金森病的发生和进展中起着重要作用[13]。本研究探讨了UC对PD进展的影响，特别是在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中，结肠炎是否加剧了帕金森病的神经病理表现。我们的实验结果表明，在对帕金森病模型小鼠给予DSS诱导结肠炎后，我们观察到肠道免疫状态激活、肠屏障功能受损、纹状体多巴胺水平下降，黑质出现炎症反应，导致神经损伤加剧。

近年来，肠–脑轴作为一种双向信号传递系统，已被广泛研究并证明在多种神经系统疾病中起着重要作用[14]。肠道和大脑之间通过迷走神经、免疫系统以及代谢产物等途径密切连接。肠道中的神经系统(肠神经系统)与中枢神经系统(CNS)之间通过迷走神经传递信息，进而调节脑功能[15]。此外，肠道菌群及其代谢产物(如短链脂肪酸)能够通过血脑屏障影响大脑的神经活动和免疫反应[16]。肠道微生物群的失衡不仅影响肠道免疫功能，还可能通过增加炎症因子的释放，促进神经炎症并加剧神经退行性疾病的进展[17]。这种由肠道引发的神经系统改变，逐渐形成了肠–脑轴在PD中的重要角色。

在PD中，肠–脑轴的失调被认为是疾病发生和发展的重要机制之一。肠道微生物群的变化、肠道屏障的损伤、以及肠道免疫反应的激活均可能通过肠–脑轴影响中枢神经系统，进而加剧帕金森病的临床表现[18]。研究表明，PD患者的肠道微生物群失衡，与大脑中某些区域的神经炎症和α-syn聚集存在一定相关性[19]。这些研究提示，肠道炎症可能通过肠–脑轴加剧PD的病理进展，为临床治疗提供了潜在的新靶点。肠道屏障由上皮细胞及其间的紧密连接蛋白组成，健康和疾病状态下均发挥着至关重要的作用[20]。炎性细胞因子的释放、肠道菌群与肠上皮细胞的相互作用以及免疫细胞穿越肠屏障等因素均可破坏肠道上皮的紧密连接，导致肠道屏障完整性受损，进而增加肠道通透性。在这种情况下，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和其他水溶性分子可以通过细胞旁途径穿越肠道黏膜，进入体内[21]。已有研究表明，通过破坏肠道屏障或注入LPS可以加重糖尿病小鼠的肾脏损害[22]。在本研究中，DSS诱导的结肠炎不仅导致了肠屏障功能损伤，还显著激活了肠道免疫反应。DSS处理后，PD小鼠肠道中紧密连接蛋白的表达显著下降，表明肠道屏障的完整性遭到破坏，并激活了肠道免疫系统。此外，肠道炎症可能通过继发的全身性炎症反应，引发脑部炎症，从而促使α-syn在大脑中的异常积聚，进一步诱发帕金森病[23]。临床研究发现，PD患者的结肠组织中，TNF-α、干扰素、IL-6和IL-1β等炎症因子的mRNA水平升高；其粪便中也存在IL-1α、IL-1β、C反应蛋白和钙卫蛋白等标志物的升高[24]。类似地，向A53T基因突变小鼠提供含低浓度DSS (0.5%)的饮用水以诱发结肠炎时，实验组小鼠表现出比对照组更早的运动障碍、α-syn异常积聚和多巴胺能神经元变性[25]。我们的结果也证实了DSS诱导结肠炎导致的肠屏障损伤和肠免疫的激活会加重PD小鼠中脑神经元的损伤。在本研究中，DSS诱导的结肠炎是一种急性炎症模型，与UC这种慢性炎症性疾病相比，其病理生理机制可能存在差异。因此，尽管DSS模型能够有效激发结肠炎症反应，但其与UC模型在长期慢性炎症过程中的不同，可能会对结果产生一定的局限性。因此，未来的研究可考虑使用更符合UC长期病理机制的慢性炎症模型，进一步验证慢性肠道炎症是否对PD病理产生加剧作用。考虑到肠道微生物群在肠–脑轴中的重要作用，本研究未能涉及相关的16S rRNA测序分析。因此，未来的研究可以补充对肠道微生物群变化的分析，尤其是不同结肠炎诱导下微生物群的变化，进一步揭示肠道菌群失衡如何通过肠–脑轴影响PD进展。

总体而言，本研究的结果表明，结肠炎在MPTP诱导的PD小鼠模型中可能通过促进肠–脑轴的炎症反应，进一步加剧了神经病理学变化。这一发现为结肠炎对PD的潜在影响提供了新的视角，并揭示了肠道健康在PD发病过程中的重要作用。未来的研究可以进一步探索结肠炎与PD之间的具体机制，特别是通过肠道–脑轴如何调控神经炎症和神经功能的变化。此外，针对肠道菌群变化的分析(例如16S rRNA测序)以及肠道屏障功能的干预可能成为治疗PD的新策略，值得在未来的研究中进一步探索。

5. 结论

综上，本研究表明，结肠炎通过肠–脑轴加重了PD的病理生理过程。结果显示，DSS诱导的结肠炎导致纹状体多巴胺水平显著下降，黑质炎症因子增加，并且肠屏障功能受损。这些结果表明，肠道炎症可能促进PD的进展，突显了肠道在PD发病机制中的潜在作用。这些发现为肠道炎症与神经退行性变之间的相互作用提供了新的见解，并为治疗PD进程提供了潜在的治疗靶点。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。