摘要: 目的：利用网络药理学研究芍药甘草汤治疗功能性腹痛的机制。方法：基于网络药理学，通过多种数据库进行药物化学成分的收集以及核心靶点预测；结合相关软件构建PPI网络、GO富集分析和KEGG通路分析，预测芍药甘草汤治疗儿童功能性腹痛的机制。结果：筛选出芍药甘草汤中102个活性成分，包括甘草酚、芍药苷、甘草吡喃香豆素等，治疗疾病的核心靶点蛋白11个，包含HSP90AA1、AKT1、STAT3等。KEGG通路富集分析得到20条潜在信号通路，主要涉及MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。结论：芍药甘草汤治疗功能性腹痛具有多通路、多靶点的特性，可能通过影响MAPK信号通路、HIF-1信号通路，进而达到治疗的目的。
Abstract: Objective: To study the mechanism of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of functional abdominal pain using network pharmacology. Methods: Based on network pharmacology, a variety of databases were used to collect chemical components and predict core targets. Combined with relevant software, PPI network, GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis were constructed to predict the mechanism of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of functional abdominal pain in children. Results: A total of 102 active ingredients in Shaoyao Gancao Decoction were screened, including glycyrol, paeoniflorgenone, licopyranocoumarin, etc., and 11 core target proteins were screened, including HSP90AA1, AKT1, STAT3, etc. KEGG pathway enrichment analysis identified 20 potential signaling pathways, mainly involving MAPK signaling pathway and HIF-1 signaling pathway. Conclusion: Shaoyao Gancao Decoction has the characteristics of multi-pathway and multi-target in the treatment of functional abdominal pain, and may affect the MAPK signaling pathway and HIF-1 signaling pathway to achieve the purpose of treatment.
1. 引言
功能性腹痛(functional abdominal pain, FAP)是指每月至少四次、病程不少于2个月、不仅发生在进食和月经等生理状态的发作性或持续性的腹部疼痛，一般指非特异性功能性腹痛[1] [2]。FAP属于中医学“腹痛”的范围，小儿脏腑娇嫩，形气未充，易受六淫，亦受饮食、情志影响，导致脾胃肠腑气滞，不通则痛[3]。而中医药在治疗FAP上是有一定的优势的。芍药甘草汤源自张仲景的《伤寒论》，由白芍、炙甘草组成。方中白芍酸苦微寒、能养血敛阴，配合甘味和缓的甘草，使得筋脉舒利，可以治疗各种痛症[4]。
本研究通过网络药理学探索芍药甘草汤治疗儿童功能性腹痛的作用机制，为后期临床研究提供参考价值。
2. 资料与方法
2.1. 筛选芍药甘草汤的活性成分及靶点
应用中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)，以口服生物利用度(Oral bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(Drug likeness, DL) ≥ 0.18作为筛选条件，获取芍药和甘草的活性成分及靶点。
2.2. 筛选FAP靶点
以“functional abdominal pain”为关键词，通过GeneCards (https://www.genecards.org/)和OMIM (https://omim.org/)数据库得到的靶点信息，去重整理后得到相关靶点。将疾病靶点与芍药甘草汤的相关靶点导入jvenn在线平台制作韦恩图，得到两者的交集。
2.3. “药物–成分–交集靶点”网络构建
将芍药甘草汤的活性成分、作用靶点和疾病的交集靶点导入Cytoscape3.8.0软件中构建“药物–成分–交集靶点”网络图，根据包括连接度(degree)、紧密度(closeness centrality)等参数获取芍药甘草汤治疗疾病的主要成分。
2.4. 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建
将交集靶点导入STRING平台，设置物种为“人”、分数 ≥ 0.9，获取PPI网络情况。利用Cytoscape3.8.0软件进行拓扑分析得到核心靶点。
2.5. GO与KEGG富集分析
将152个交集靶点导入MetaScape (https://metascape.org/gp/index.html)数据库，物种限定为“人”，列表类型选择为“基因列表”，进行GO分析和KEGG分析，根据Count值进行排列，并利用微生信平台制作对应的富集气泡图。
3. 结果
3.1. 芍药甘草汤的活性成分及靶点
经过TCMSP数据库的筛选，共获取芍药13种，甘草92种活性成分，筛去重复活性成分，共筛选102种活性成分，在Uniprot数据库中对化合物的作用靶点进行标准化，获取芍药甘草汤212个靶点。其中活性成分包括甘草酚、芍药苷、甘草吡喃香豆素等。部分相关成分见表1。
Table 1. The top 10 components according to oral bioavailability
表1. 根据口服生物利用度前10的成分
MOL |
化学成分 |
来源 |
MOL002311 |
Glycyrol |
甘草 |
MOL001918 |
paeoniflorgenone |
白芍 |
MOL004990 |
7,2',4'-trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin |
甘草 |
MOL004904 |
licopyranocoumarin |
甘草 |
MOL004891 |
shinpterocarpin |
甘草 |
MOL005017 |
Phaseol |
甘草 |
MOL004841 |
Licochalcone B |
甘草 |
MOL004810 |
glyasperin F |
甘草 |
MOL001484 |
Inermine |
甘草 |
MOL000500 |
Vestitol |
甘草 |
3.2. FAP的靶点预测
经过搜索得到功能性腹痛3121个靶点，同芍药甘草汤活性成分的对应靶点与功能性腹痛的靶点取交集，得出芍药甘草汤的152个靶点在治疗中发挥作用，并绘制韦恩图。如图1。
Figure 1. Venn diagram
图1. 韦恩图
3.3. “药物–成分–交集靶点”网络构建结果
“药物–成分–交集靶点”如图2，运用Cytoscape3.8.0进行分析后，根据度值筛选出前3位的药物成分是槲皮素、山奈酚和柚皮素。其中度值排名靠前的靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、雌激素受体1 (ESR1)、过氧化物酶体增生激活受体γ (PPARG)等。
Figure 2. Drug-component-disease target diagram
图2. 药物–成分–疾病靶点图
3.4. PPI网络构建结果
将152个交集靶点导入STRING平台，得到蛋白互作信息后，将结果导入Cytoscape3.8.0软件进行两次拓扑分析后，得到11个核心靶点蛋白，37条边。见图3。
Figure 3. PPI network diagram
图3. PPI网络图
Figure 4. GO enrichment analysis
图4. GO富集分析
3.5. GO与KEGG富集分析
对152个关键靶点基因进行富集分析，共得到2152个GO条目和209条KEGG通路，分别选取前10条进行可视化处理。GO富集分析包括生物过程(biological processes, BP)、细胞组分(cellular components, CC)、分子功能(molecular functions, MF)。BP主要涉及对外源性刺激的反应、细胞对脂质的反应、细胞对氮化合物的反应等；CC中显示芍药甘草汤治疗疾病主要涉及膜筏、质膜外侧、受体复合物等部位；MF涉及转录因子结合、蛋白激酶结合、蛋白质同源二聚活性等。见图4。KEGG富集分析显示涉及癌症的发病途径、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌–受体激活、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。见图5。
Figure 5. KEGG enrichment analysis
图5. KEGG富集分析
4. 讨论
文章筛选出芍药甘草汤的化学成分包括甘草酚、芍药苷、甘草吡喃香豆素等。芍药苷具有抗炎和免疫活性作用，可通过抑制IL-17和TNF-α等细胞因子的表达来调节炎症反应[5]。有研究表明甘草酚能提高对宿主代谢和免疫方面有重要作用的益生菌阿克曼氏菌的丰度，有作为益生元的潜力[6]。甘草吡喃香豆素对神经系统有保护作用，通过抑制JNK活化来减少其活性[7]。芍药甘草汤参与炎症反应、细胞因子、和各种氧化应激反应的调节，进而通过富集与疼痛有关的信号通路达到镇痛的效果[8]。FAP一般指脑–肠互动异常，症状的产生常与内脏高敏感性、中枢系统异常、神经免疫互相作用、胃肠动力紊乱和肠道菌群变化有关[2]。炎症、感染和应激都会使得内脏组织的刺激性感受增强[9]。而核心靶点有HSP90AA1、AKT1、STAT3等，HSP90AA1可以调节细胞的增殖和凋亡，而它的过表达与肿瘤细胞的侵袭转移、新陈代谢紧密相关，导致疾病预后不良[10]。STAT3信号通路的激活可以促进继发性神经炎症损伤、氧化应激等过程的进展[11]。JAK2/STAT3通路已被证实在慢性疼痛的不同阶段发挥着独特而关键的作用，其作用机制与介导神经炎症密切相关，JAK2可被IL-1β、IL-6、TNF-α等激活，磷酸化的JAK2促进STAT3激活，启动炎症基因的转录和表达，导致炎症细胞因子过度积累，最终引发神经炎症和细胞凋亡[12]。AKT1可以影响抑制性神经递质如GABA的合成和释放来降低神经元的兴奋性，从而进一步减弱疼痛信号。还能够抑制促炎因子的产生，如TNF-α和IL-1β等，这些促炎因子在炎症引发的腹痛中起着关键作用。因此，通过调节AKT1的活性，可以有效缓解因炎症和神经兴奋性增高引起的腹痛[13]。KEGG富集分析得到的MAPK信号通路、HIF-1信号通路等中，p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是介导疼痛的关键信号通路，与神经病理性疼痛高度相关[14]。MAPK参与中枢神经的敏化过程，当伤害性感受器大量释放炎症因子时，MAPK信号通路被激活，通过调节信号通路下游的相关激酶，加重疼痛感和痛觉过敏[15]。HIF-1主要由HIF-1α调控，已有研究报道证明HIF-1α是控制和减轻炎症反应发生发展的一个重要药物靶点[16]。FAP与胃肠动力有关，胃肠动力需要能量，因此线粒体功能影响胃肠运动[17]，当线粒体遭到攻击时会发生线粒体功能紊乱，导致线粒体过度自噬。研究表明，抑制HIF-1α/BNIP3信号通路可减少过度缺氧引发的线粒体膜自噬激活[18]。
芍药甘草汤治疗FAP具有多通路、多靶点的特性，可能通过影响MAPK信号通路、HIF-1信号通路，进而达到治疗的目的。
NOTES
*通讯作者。