T细胞基因筛选扩张型心肌病生物标志物并识别治疗药物

Exploring Key Genes and Potential Drugs of Dilated Cardiomyopathy Based on Bioinformatics Data

摘要: 目的：通过T细胞基因筛选寻找扩张型心肌病(DCM)的潜在病理生物标志物并筛选相应的治疗药物。方法：1) 收集3个DCM微阵列数据集并去除批次效应，利用CIBERSORT算法评估正常组织与DCM病变组织中的免疫浸润差异。2) 采用LASSO逻辑回归分析和多因素逻辑回归分析筛选与DCM有关的gamma delta T cells (γδT)相关基因并建立gamma delta T cells相关基因评分(DTAGS)。3) 使用ROC曲线下面积(Area under Curve, AUC)，校准曲线以及临床决策曲线(Decision Curve Analysis, DCA)对DCM诊断模型的区分度、校准度以及临床获益程度进行评估，进行GO和KEGG通路分析。4) 使用DGIdb数据库分析DCM的潜在药物。结果：1) 共纳入108个DCM心内膜样本和24个正常对照心内膜样本，免疫浸润分析显示与正常组织相比，DCM病变组织中的γδT细胞的浸润程度显著升高。2) LASSO分析和多因素分析确定了8个γδT相关基因用于构建DCM的诊断模型DTAGS，模型性能良好(AUC = 0.857)，DTAGS诊断DCM与实际诊断率有良好的一致性，决策曲线表明该诊断模型有较好的诊断效能。3) DTAGS与细胞间的信号转导、通道活性有显著相关。4) 基于DGIdb数据库筛选到Dasatinib，Pazopanib hydrochloride等药物作为DCM的潜在治疗药物。结论：我们建立了8个γδT相关基因的DTAGS诊断模型可以作为临床实践中预测DCM的有力工具。并基于这些基因筛选了DCM的潜在的治疗药物。

Abstract: Objectives: To search for potential pathological biomarkers of dilated cardiomyopathy (DCM) and screen corresponding therapeutic drugs. Methods: 1) Three DCM microarray datasets were collected and batch effects were removed, and differences in immune infiltration in normal versus DCM lesions tissues were assessed using the CIBERSORT algorithm. 2) LASSO logistic regression analysis and multi-factor logistic regression analysis were used to screen gamma delta T cells (gamma delta T) related genes associated with DCM and to establish gamma delta T cells related gene score (DTAGS). 3) Differentiation, calibration, and clinical benefit of the DCM diagnostic model was assessed using the Area under Curve (AUC), calibration curve, and Decision Curve Analysis (DCA). GO and KEGG pathway analysis was performed. 4) The DGIdb database was used to analyze potential drugs for DCM. Results: 1) A total of 108 DCM endocardial samples and 24 normal controls endocardial samples were included. Immuno-infiltration analysis showed significantly higher infiltration of γδT cells in DCM lesions tissues compared to normal tissues. 2) LASSO analysis and multifactorial analysis identified eight γδT-related genes for the construction of DTAGS, a diagnostic model for DCM. The model performance was good (AUC = 0.857). The DTAGS diagnostic DCM was in good agreement with the actual diagnostic rate, and the decision curve indicated that the diagnostic model had good diagnostic efficacy. 3) DTAGS is significantly related to signal transduction and channel activity between cells. 4) Drugs such as Dasatinib and Pazopanib hydrochloride were screened as potential therapeutic agents for DCM based on the DGIdb database. Conclusion: We developed a DTAGS diagnostic model of eight γδT-associated genes that can be used as a powerful tool for predicting DCM in clinical practice. Potential therapeutic agents for DCM were screened based on these genes.

1. 介绍

扩张型心肌病(DCM)是临床上最常见的原发性心肌病，其特征是左心室扩张和收缩功能受损[1]。近年来，随着影像学诊断水平的进步和抗心力衰竭药物的快速发展，扩张型心肌病患者的生活质量和长期生存率有一定提高[2] [3]。但扩张型心肌病仍是心力衰竭和心脏移植的重要原因[4] [5]，临床预后仍较差，5年死亡率为20% [6]，给家庭和社会带来了沉重的负担。目前认为，DCM的病因多种多样，基因变异、感染、自身免疫性疾病、接触化学物质和毒素等原因所引发的心脏炎症和免疫损伤[7]-[9]，均可能会导致扩张型心肌病的发生和发展。因此，扩张型心肌病的早期诊断、早期治疗、疾病监测和预后判断对于提高扩张型心肌病患者的生存率和生活质量具有重要意义[8]。另外，临床上目前对扩张型心肌病患者的危险分层多根据一些临床危险因素和影像学检查[10] [11]，但由于扩张型心肌病临床表现复杂多样，现有的监测手段在实际临床工作中往往不能很好地满足医生对患者病情管理的需求，临床转归往往很难做到准确预知[12]，因此，探索新的检测方法、研究新的生物学标志物十分重要。

分子诊断技术是指利用分子生物学方法对人体及各种病原体的遗传物质的表达及结构进行检测，以达到预测及诊断疾病的目的[13]。近年来，分子诊断技术蓬勃进展，尤其是基因芯片和高通量测序技术快速发展，发现了许多潜在核心基因和小分子在多种疾病生物学过程中的关键作用[14]。已有许多研究使用分子诊断技术鉴定扩张型心肌病的基因和非编码RNA表达谱，提供了扩张型心肌病心肌组织的基因表达模式。例如，Zhou LQ等[15]鉴定了DCM和正常心脏样本之间的差异表达基因，并构建了预测DCM发病率的列线图。Liu C等[16]对DCM的基因芯片数据进行分析，发现了DCM的性别差异，并构建了免疫相关的ceRNA网络，可能为免疫治疗的性别相关个体化发展提供基础。然而，这些研究的基因特征多是从单个数据集分析的，由于以往研究中患者的数量有限，这可能会影响研究的预测能力和可靠性。因此，我们根据多个数据集进行分析，对公共数据集进行深入探索，揭示疾病相关基因，并结合临床病理特征开发有效的诊断模型，有助于形成预测扩张型心肌病状态和个体化治疗的有前景的工具。

本研究从基因表达综合数据库(GEO)下载DCM的基因表达谱数据，利用多个数据集的DCM样本和正常样本进行分析，试图探讨免疫微环境与扩张型心肌病之间的联系，探索扩张型心肌病中的免疫细胞浸润差异，并且联合这些免疫基因对样本进行赋值。随后，为了研究基因功能和探索发病机制，进行了基因富集分析，并探讨DTAGS与临床特征的相关性。最后，通过DGIdb数据库预测了DCM潜在的治疗药物，探讨了相关基因与药物的关系，为DCM的临床精确治疗和实验研究提供思路。

2. 方法

2.1. 资料下载

从GEO数据库中提取微阵列数据下载了GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)中的mRNA表达谱GSE120895，GSE21610和GSE17800，这是一个共享平台，研究人员可以在其中存储与各种疾病相关的微阵列数据。

GSE120895 (GPL570平台)包括47名DCM患者和8例左心室射血分数正常的患者。

GSE21610 (GPL570平台)包括21个DCM患者和8个非衰竭对照心脏(NF)的基因表达谱。

GSE17800 (GPL570平台)包括40个DCM心内膜样本和8个正常对照心内膜样本。

这三个数据集均包含DCM患者，根据纽约心脏协会(NYHA)分类心功能分级II级和III级，这些患者具有左心室收缩功能障碍(LVEF < 45%)和有心力衰竭(HF)症状[17]。

本研究共包括132例心肌样本，包括108例DCM和24例健康样本(对照组)。

GEO属于公共数据库，数据库中涉及的患者已获得伦理认可。用户可以免费下载这些相关数据进行研究并发表相关文章。大多数据基于开源数据，因此不存在道德问题和其他利益冲突。

2.2. 免疫浸润分析

为了确定DCM和正常个体对照之间免疫细胞组成的差异，在CIBERSORT (https://cibersortx.stanford.edu/)中使用去卷积方法和LM22免疫特征矩阵计算浸润性免疫细胞的分数[17]。

2.3. γδT细胞相关基因的筛选

我们以“gamma delta T cell”为关键词，以C5-基因本体论(GO)为筛选条件，在分子特征数据库(MSigDB, http://www.gseamsigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中进行了搜索，得到了21个γδT细胞相关基因(DTAG)。

在这项研究中，最小绝对收缩和选择算子(LASSO)逻辑回归用于特征基因选择，以减少疾病预测模型中的基因数量，解决回归分析中的多重共线性问题，并筛选DCM基因的分子标记[18]。“glmnet”包用于实现LASSO回归算法，α设置为1，用于在处理高度相关数据时控制模型的特性。

此外，本研究还使用了多因素逻辑回归进一步来表征DTAG，并去除不相关的基因，以使诊断预测模型更加稳健。

2.4. DCM诊断模型的建立

为了研究筛选的DTAG是否可用于预测扩张型心肌病的发生，通过ROC曲线下面积(AUC)评估模型的可预测性，并计算每个样本的DTAGS。“pROC”软件包用于绘制ROC曲线，“RMDA”软件包用于绘制DCA临床获益曲线。

“ggstatsplot”包(https://indrajeetpatil.github.io/ggstatsplot/)用于对诊断标记进行Spearman相关性分析，“ggplot2”包用于可视化结果。双侧p < 0.05被认为具有统计学意义。

2.5. GO和KEGG途径的富集分析

以DTAGS诊断评分中位值为界将所有样本分为高低表达组，使用R软件包clusterProfiler [19]对差异表达基因进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径富集分析。满足P < 0.05和计数 > 2的结果被认为是有统计学意义的。

2.6. 临床特征分析

提取GSE17800样本中的临床信息，性别、年龄、lvidd左心室舒张末期内径、LVEF左室射血分数和CD68+和CD3+免疫细胞比例。

2.7. DCM潜在药物筛选

从DGIdb药物数据库(https://dgidb.org/)，获取了目标基因的潜在治疗药物，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取潜在小分子药物的化学结构。

2.8. 统计分析

统计分析使用了R软件包。两组的比较通过t检验或Wilcoxon秩和检验，三组或更多组的比较通过Kruskal-Wallis检验来评估其显著性。相关性分析通过Spearman相关分析和R包“corrplot”实现。ROC曲线分析是通过pROC R包进行的。所有的统计检验都是双尾的，P < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. DCM的免疫浸润景观

对数据集GSE120895，GSE21610和GSE17800的表达数据进行了合并去批次，在去除批次效应之前各个数据集的样本各自聚在一起，表明彼此之间具有批次效应，而去除批次效应之后各个数据集之间的样本聚类在一起，说明较好地去除了不同数据集之间的批次效应(见图1)。

为了了解DCM的潜在免疫浸润差异，我们采用CIBERSORT算法评估了DCM患者与健康对照组免疫浸润差异(见图2(A))。结果显示相较于正常组织，γδT细胞在DCM中浸润程度显著升高(见图2(B)) (P < 0.05)。这提示了γδT细胞可能参与了DCM的疾病形成。

Figure 1. UMAP diagram of the data set

图1. 数据集合并的UMAP图

Figure 2. Immune infiltration landscape of DCM. (A) Immune infiltration stacked plot of normal and DCM tissues. (B) Comparative box plot of immune infiltration of normal and DCM tissues

图2. DCM的免疫浸润景观。(A)正常组织和DCM组织的免疫浸润堆叠图。(B)正常组织和DCM组织的免疫浸润比较箱线图

3.2. 基于机器学习构建DTAGS

为了了解γδT细胞在DCM中的潜在诊断价值，我们首先从MSigDB数据库获取了γδT细胞相关基因DTAG，之后采用最小绝对收缩选择算子(LASSO)回归分析获得了15个基因作为DCM的潜在诊断生物标志物(见图3(A)~(C))。接下来，我们利用多因素逻辑回归进一步分析这15个DTAG。并最终获得了8个与DCM疾病显著相关的DTAG (EGR3、ITK、JAG2、MICB、NOD2、SOX4、STAT5B、TCF7) (见图3(D))。基于这8个基因建立了γδT细胞相关基因评分(DTAGS)，DTAGS = 2.87672 − 0.01138 × EGR3 + 0.02390 × ITK + 0.01837 × JAG2 + 0.02638 × MICB − 0.04521 × NOD2 − 0.01694 × SOX4 − 0.04751 × STAT5B − 0.01717 × TCF7。

Figure 3. Construction of DCM diagnostic model DTAGS. (A)~(C) LASSO logistic regression analysis was performed to screen out 15 DTAGs. (D) Multi-factor logistic regression analysis is screening 8 DTAGs were used to create DTAGS scores, P < 0.05. (E) ROC curve analysis to assess the diagnostic efficacy of DTAGS. (F) Differences in the distribution of DTAGS in normal and DCM tissues. (G) Calibration curve of DTAGS. The blue line represents the diagnostic performance of the DATGS. The gray line closer to the diagonal indicates a better estimate. (H) In DCA analysis, the horizontal line indicates that all samples are negative and the net benefit is 0. The sloping line indicates that all samples are positive and the net benefit is an inverse slope with a negative slope. The farther the decision curve is from the 2 extreme lines, the higher the value of the diagnostic model for clinical application, and DCA can be used to assess the diagnostic reliability of DTAGS

图3. 构建DCM诊断模型DTAGS。(A)~(C) LASSO逻辑回归分析筛选出15个DTAG。(D) 多因素逻辑回归分析筛选出8个DTAG用于建立DTAGS评分，P < 0.05。(E) ROC曲线分析评估DTAGS的诊断效能。(F) DTAGS在正常组织和DCM组织的分布差异。(G) DTAGS的校正曲线。蓝色线代表DATGS的诊断性能。更接近于对角线的灰色线表示更好的估计。(H) DCA分析中，横线表示所有样本都是阴性，净获益为0；斜线表示所有样本都是阳性，净获益是个斜率为负值的反斜线。决策曲线距离2条极端线越远，说明诊断模型临床应用价值越高，DCA可以被用来评估DTAGS的诊断可靠性

ROC曲线显示DTAGS可以有效区分DCM心脏组织和正常心脏组织(AUC = 0.857) (见图3(E))。同时箱线图显示DTAGS在DCM病变组织中要显著高于正常组织(见图3(F))。校准图显示该模型的校准曲线趋势与标准曲线贴合程度尚可，说明该模型在诊断DCM具有可靠性(见图3(G))。之后的决策曲线的结果同样表明，构建的诊断模型可在很大的风险阈值概率范围内提高对DCM发生风险的预测能力(见图3(H))。总的来说，以上结果说明了基于γδT细胞相关基因构建的诊断评分DTAGS在诊断DCM是高度准确的。

3.3. DTAGS相关的信号通路和功能富集分析

为了解与DTAGS可能相关的生物学通路，我们根据DTAGS将所有样本分为高低表达组，进行了GO和KEGG通路分析，结果显示差异基因主要富集于channel activity，neuroactive ligand receptor interaction，cell-cell signaling，plasma membrane part等相关通路(见图4(A)~(D))。这些结果表明了DTAGS可能通过参与信号转导、通道活性来影响DCM的形成。

Figure 4. GO and KEGG analysis of DTAGS-related genes. (A) KEGG analysis of DTAGS-related genes. (B) GO-MF analysis of DTAGS-associated genes. (C) GO-CC analysis of DTAGS-associated genes. (D) GO-BP analysis of DTAGS-associated genes

图4. 与DTAGS相关的GO和KEGG分析。(A) DTAGS相关基因的KEGG分析。(B) DTAGS相关基因的GO-MF分析。(C) DTAGS相关基因的GO-CC分析。(D) DTAGS相关基因的GO-BP分析

3.4. DTAGS与DCM患者临床特征相关

为进一步探索DTAGS与DCM患者临床病理特征的潜在联系，我们获取了GSE17800数据集中DCM患者的临床信息。结果显示，DTAGS在 > 55岁和 < 55岁的患者之间存在显著性差异，> 55岁的患者DTAGS相对更高(P < 0.05) (见图5(A))，而在不同性别之间却不存在明显差异(见图5(B))；DTAGS与炎症指标及心脏功能指标之间的相关性分析显示：DTAGS与CD68+和CD3+的免疫细胞浸润比例呈显著正相关(r = 0.402, P = 0.005) (见图5(C))，DTAGS与左室射血分数levf呈显著负相关(r = −0.438, P = 0.002) (见图5(D))，DTAGS与左心室舒张末期内径lvidd呈显著正相关(r = 0.291, P = 0.045) (见图5(E))。

Figure 5. Correlation analysis of DTAGS and clinicopathological features. (A) Differences in the distribution of DTAGS in different age groups; (B) Differences in the distribution of DTAGS in different sexes; (C) Correlation analysis of DTAGS with CD68+ and CD3+; (D) Correlation analysis of DTAGS with lvef; (E) Correlation analysis of DTAGS with lvidd

图5. DTAGS与临床病理特征的相关性分析。(A) DTAGS在不同年龄段的分布差异；(B) DTAGS在不同性别的分布差异；(C) DTAGS与CD68+和CD3+的相关性分析；(D) DTAGS与lvef的相关性分析；(E) DTAGS与lvidd的相关性分析

3.5. 筛选DCM的潜在药物

考虑到DTAGS在DCM中潜在的重要作用，我们将构成DTAGS的8个γδT细胞相关基因导入到了DGIdb数据库中，用于确定可能逆转DCM的潜在治疗药物。在组成DTAGS的8个基因中有4个基因ITK，MICB，NOD2，STAT5B可从DGIdb数据库中检索到药物–基因相互作用网络。互作网络显示16种药物或小分子化合物包括坦度替尼等，可差异性地调节ITK的表达，其中盐酸巴唑帕尼是ITK的抑制剂。Mifamurtid可以通过与NOD2相互作用进而激活单核/巨噬细胞，其与NOD2的interaction Score为15.46；这提示了Mifamurtid作为DCM治疗药物的潜力。RIBAVIRIN是一种抗非逆转录病毒药，可与MICB相互作用。此外，Dasatinib是STAT5B的抑制剂(见图6(A)、图6(B))。

PubChem是一个储存有1000多万种化合物的公共数据库[20]。我们从Pubchem中下载了种类为抑制剂的小分子化合物的结构(见图6(C))。

Figure 6. Screening of potential therapeutic agents for DCM. (A) Diagram of drug-gene interaction network; (B) Drug-gene interaction scores; (C) Chemical structures of small molecule compounds

图6. 筛选DCM的潜在治疗药物。(A) 药物与基因的互作网络图；(B) 药物与基因的互作评分；(C) 小分子化合物的化学结构

4. 讨论

DCM的临床特征和病因复杂，这使得临床上准确而及时的诊断十分困难[21]。发表在《柳叶刀》上的一项前瞻性城乡流行病学(PURE)队列研究[22]表明，在全球35~70岁的成年人中，心血管疾病仍是死亡的主要原因。因此，对DCM患者进行全面病情评估是改善患者预后的前提条件。另一方面，临床上需要影像学技术来评估心室功能障碍和心肌重塑不良[23]。当怀疑有炎症或感染时，还需要对心内膜心肌活检样本进行免疫学和组织学分析[24] [25]，这进一步使得DCM的诊断相当困难。最近的研究表明，基于高通量分子生物学技术的靶向治疗(精准医学)可能会提供一个新的方向[26] [27]。

免疫应答作为一种防御机制，会导致长期心肌免疫浸润，从而导致DCM患者的心室重塑[28]。已有许多研究表明DCM与心肌中免疫细胞的浸润有关[29]-[32]。Pistulli R等的研究发现，扩张型心肌病患者心内膜心肌活检中树突状细胞减少[29]。另一项心脏免疫细胞的单细胞转录组学分析显示，骨髓衍生的Rel介导的CD72hi巨噬细胞具有促炎作用，诱导心脏损伤，可作为DCM的治疗靶点[30]。这都说明DCM中的体液和细胞免疫紊乱逐渐被发现，在发病机制中发挥着重要作用[32]。因此，我们利用生物信息学算法和工具，探索了DCM病变组织中免疫细胞浸润的潜在变化。结果显示，相较于正常组织，在DCM病变组织中，T细胞中γδT细胞亚群的浸润程度显著升高。在之前的研究中Efthimiadis I等人发现在慢性 DCM 外周血中，CD4+/CD25+ T细胞升高可能是DCM进展的预后标志物[33]。Ueno A等人则报道了DCM患者外周血T细胞的HLA-DR和CD40L的高表达与血清BNP水平升高和DCM的心肌功能障碍显著相关[34]。总之，以上研究均说明了Ｔ细胞调节机制异常与心肌功能紊乱之间的潜在联系[31]，而γδT作为携带由γ和δ多肽链组成的T细胞受体的T细胞，已经被证实广泛参与微生物感染和其他炎症的免疫调节[35] [36]。我们发现DCM区域的γδT细胞的浸润丰度的变化，这提示着γδT细胞亚群在DCM病变区域可能存在调节机制的异常，然而其中潜在机制仍需进一步探究。

我们通过LASSO逻辑回归和多因素逻辑回归分析获得了8个与DCM相关的DATG：EGR3、ITK、JAG2、MICB、NOD2、SOX4、STAT5B、TCF7。JAG2相应的蛋白质是激活Notch和相关受体的几种配体之一，有研究发现JAG家族可能影响横纹肌功能，导致神经和肌肉之间的串扰功能失调，其中包括心脏损伤[37]。这可能是潜在的JAG2对DCM发生发展的影响。另外，Shichi D等[38]已经证明，MICB参与的通路可能控制对丙型肝炎病毒相关性扩张型心肌病的易感性。Sry相关高迁移率组盒(SOX)基因家族在人类中具有20种已知的转录因子，在发育和疾病过程中起着至关重要的作用[39]。一项meta分析表明，SOX4在心肌病中起作用，导致人类心力衰竭[40]。STAT5B编码的蛋白质是转录因子STAT家族的成员，已被证明参与多种生物过程，例如TCR信号传导、细胞凋亡等。一项基于中国汉族人群的研究表明STAT中常见的遗传多态性与DCM相关[41]。综上所述，已有许多研究发现以上8个基因与DCM的关系，由EGR3、ITK、JAG2、MICB、NOD2、SOX4、STAT5B、TCF7所构建的诊断模型DTAGS对DCM具有极好的诊断价值。我们可以通过测量这些基因的表达来拓展诊断DCM的手段。

在我们的研究中，来自GO和KEGG的结果表明，DTAGS和细胞间的信号传导和通道活性等生物学通路密切相关。与临床特征的相关性分析表明，基于γδT细胞相关基因构建的DTAGS与临床反应密切相关。综上所述，这些γδT细胞相关基因可能在DCM的发生发展中发挥着关键作用。尽管关于DCM发病机制有广泛的研究，但并发左心室功能障碍、心力衰竭或心律失常的炎症性心肌病预后仍不良，部分患者发生扩张型心肌病的原因尚不清楚[42]。我们的研究进一步揭示了γδT细胞及其炎症介质参与DCM的进程，检测心肌组织中这些基因的表达可能有助于DCM的诊断。并且在基因水平上发现DCM的高危患者，以提高诊断DCM的有效性并有助于实现精准治疗。

本研究也存在一定局限性。例如，本研究仅进行了信息学数据分析，暂未进行基础实验的探索；另外本研究仅是初步的分子筛选，距离应用到临床治疗还有很长的路要走，仍值得后期深入探究。

5. 结论

本研究构建了一个γδT细胞相关基因评分DTAGS，DTAGS可以准确地诊断DCM，同时基于γδT细胞相关基因筛选了DCM的潜在治疗药物。

NOTES

^*通讯作者。