大肠埃希菌：耐药机制及新兴治疗策略研究进展

Escherichia coli: Research Progress on Drug Resistance Mechanisms and Emerging Treatment Strategies

摘要: 自青霉素问世以来，越来越多的抗生素被发现并应用于临床，多种抗生素的选择压力催化产生了多种耐药酶，大肠埃希菌耐药性问题日益突出，给临床诊疗带来了巨大挑战。大肠埃希菌耐药机制多样，包括基因突变与修饰、抗药性基因转移、细胞膜通透性降低、灭活酶或钝化酶的产生、靶点结构改变、主动外排系统增强、生物膜形成、代谢途径适应性改变等。为应对大肠埃希菌耐药问题，新兴治疗策略一直在被研究，包括新型抗菌药物开发、新型复方制剂、噬菌体、抗菌肽、纳米技术、光动力疗法、CRISPR-Cas系统、反义疗法、粪菌移植等。本文对大肠埃希菌耐药机制进行综述，并探讨新兴治疗策略的发展现状与前景，以期为应对大肠埃希菌耐药挑战提供科学依据。

Abstract: Since the emergence of penicillin, more and more antibiotics have been discovered and applied in clinical practice. The selection pressure of multiple antibiotics has catalyzed the production of multiple resistant enzymes, and the problem of antibiotic resistance in Escherichia coli has become increasingly prominent, posing a huge challenge to clinical diagnosis and treatment. The resistance mechanisms of Escherichia coli are diverse, including gene mutations and modifications, transfer of resistance genes, decreased cell membrane permeability, production of inactivating or inactivating enzymes, changes in target structure, enhanced active efflux systems, biofilm formation, and adaptive changes in metabolic pathways. To address the issue of antibiotic resistance in Escherichia coli, emerging treatment strategies have been studied, including the development of new antibiotics, new combination formulations, bacteriophages, antimicrobial peptides, nanotechnology, photodynamic therapy, CRISPR-Cas system, antisense therapy, fecal microbiota transplantation, and more. This article provides a review of the resistance mechanisms of Escherichia coli and explores the current status and prospects of emerging treatment strategies, in order to provide scientific basis for addressing the challenges of E. coli resistance.

1. 引言

大肠埃希菌是一种寄生于肠道内、兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，是一种常见的共生菌和条件致病菌，能引起血液系统、呼吸系统、泌尿系统、神经系统等多种感染，严重时可导致多器官功能衰竭甚至死亡。近年来，随着抗生素的滥用，大肠埃希菌耐药性问题日益突出，给临床抗感染治疗带来了巨大挑战。因此，加强对大肠埃希菌的研究，了解其耐药机制，开发新型抗生素和抗感染治疗策略，对于延缓后抗生素时代的到来、保障人类健康具有重要意义。

2. 大肠埃希菌的耐药机制

大肠埃希菌耐药性依据其产生机制的差异，可划分为三大类别，即固有耐药性、获得耐药性和适应耐药性[1]。

2.1. 固有耐药性

大肠埃希菌因自身固有性质，会对部分抗生素展现出天然抗性，这种抗性即为固有耐药性。如大肠埃希菌的外膜包含两部分，一部分是以脂多糖为主要成分的外小叶，另一部分是以磷脂为主要成分的内小叶。脂多糖外小叶具有亲水性，可阻挡脂溶性化合物的渗透，而磷脂内小叶具有疏水性，可降低亲水性分子的透过效率，这使得大肠埃希菌天然对某些抗生素具备固有耐药性[2]。除此之外，大肠埃希菌的多重耐药性还与耐药结节分裂(resistance-nodulation-division, RND)家族外排泵介导的药物外排有关。在大肠埃希菌中，已表征的RND外排泵已有7种，其中AcrAB被发现与固有耐药性有关[2]。

2.2. 获得耐药性

获得耐药性是指原本对各类抗生素敏感的大肠埃希菌，因自身发生基因突变和修饰，或从外界获取新的遗传物质进而产生的耐药性。获得耐药性常通过产生灭活酶或钝化酶、靶点结构改变/靶点保护蛋白质、细胞膜通透性降低、主动外排系统增强发挥作用。

2.2.1. 基因突变与修饰

氨基糖苷类抗菌药物(Aminoglycoside antibiotic, AGsAGs)通过与大肠埃希菌16S rRNA中高度保守的核苷酸碱基H44螺旋结合，导致蛋白质翻译错误从而介导大肠埃希菌的死亡。而大肠埃希菌16S rRNA编码基因rrs突变可阻碍AGs与之结合，从而产生AGs抗性[3]。喹诺酮类药物通过抑制DNA回旋酶(gyrA和gyrB编码)和/或拓扑异构酶IV (parC和parE编码)的活性，阻碍DNA合成来抑制细菌生长[4]。细菌gyrA、gyrB、parC、parE位点发生突变会使喹诺酮类药物对酶-DNA复合物亲和力降低，从而减弱喹诺酮类药物抗菌效果[5]。

除自身基因发生直接突变之外，一些酶对基因所发挥的修饰作用也会导致细菌产生抗药性。一般来说，AGs通过氢键与细菌16S rRNA中A位点的核苷酸碱基结合发挥抗菌作用，因此关键核苷酸的变异和修饰会干扰氢键结合而导致AGs与16S rRNA结合减少介导细菌耐药性。16S rRNA甲基化酶可以甲基化16S rRNA中G1405的N7位使鸟苷变为7-甲基鸟苷，引起卡那霉素、庆大霉素耐药；甲基化16S rRNA中A1408的N-l位引起卡那霉素、安普霉素耐药[6]。头孢地尔是一种新型头孢菌素，其与Fe³⁺结合，并通过细菌外膜上的摄铁转运蛋白，被运输至周质间隙内发挥抗菌作用[7]。tonB基因编码的TonB依赖性转运蛋白是细菌外膜蛋白，能够转运铁载体–铁复合物，当tonB基因发生修饰、编码大肠埃希菌特异性铁转运蛋白的CirA和fiu发生缺失时，大肠埃希菌对头孢地尔的敏感程度显著降低[8]，有研究指出，cirA和fu的双重缺失会导致头孢地尔MIC值升高16倍[9]。

2.2.2. 抗药性基因转移

细菌耐药基因的获取和传播与可移动遗传元件之间存在着密切联系。可移动遗传元件是一种能够在细菌之间传播耐药基因的基因组片，包括质粒、插入序列、转座子、整合性接合元件等[10]。大肠埃希菌可通过水平基因转移来积累抗性的基因有编码超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases, ESBLs)、碳青霉烯酶、16S rRNA甲基化酶的基因，以及质粒介导的喹诺酮抗性基因和mcr基因(赋予对多黏菌素的抗性)等[11]。

易灵娴[12]等对某养殖场的黏菌素耐药大肠埃希菌进行研究，发现了可水平转移的质粒介导的黏菌素耐药基因，并将其命名为mcr-1，且通过ESI-MS分析证实MCR-1可催化磷酸乙醇胺与脂多糖表面类脂A结合，从而降低黏菌素与脂多糖的静电作用，导致细菌对黏菌素耐药。其中IncI2、IncHI2和IncX4是携带mcr-1的主要质粒类型[13]。tet(X)及其变异基因可编码黄素依赖性单加氧酶(替加环素修饰酶)，在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧气(O₂)和镁离子(Mg²⁺)存在的条件下可催化降解四环素类抗生素[14]。2018年首次在从人类和动物回收的菌株中发现编码对替加环素高水平耐药性的质粒携带的tet(X)基因，后来在肠杆菌科中回收的各种高度结合质粒中检测到越来越多的tet(X)变异体，tet(X)变异体不仅可灭活各种四环素类药物，还具有高度水平转移的潜力[15]。16S rRNA甲基化酶(编码基因为armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA)介导大肠埃希菌氨基糖苷类药物抗生素耐药，其中armA和rmtB基因可在大肠埃希菌间水平转移[16]。

2.2.3. 细菌产生灭活酶或钝化酶

细菌能够产生灭活酶或钝化酶，这些酶会破坏抗菌药物的空间结构，进而导致抗菌药物失去活性。在大肠埃希菌中，其主要的耐药酶包括β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶等[17]。

青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins, PBPs)是细菌细胞壁主要结构成分肽聚糖合成过程中所必需的转肽酶，β-内酰胺类抗生素通过与PBPs共价结合抑制PBPs的酶活性，阻碍细胞壁肽聚糖的合成，使细菌细胞壁缺损，导致菌体膨胀崩解发挥抗菌作用[18]。β-内酰胺酶可以水解β-内酰胺环，从而使β-内酰胺类的抗生素失效。截至目前，人们已鉴定出的天然β-内酰胺酶超过2000种，且每种酶都有着独特的氨基酸序列和典型的水解特性[19]。针对这些酶的分类，目前存在两种主要体系：Bush分类体系和Ambler分类体系。Bush分类根据不同底物谱将其分成青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等5大类；Ambler分类则根据作用机制将其分为丝氨酸酶及金属酶[20]。

氨基糖苷类钝化酶可作用于抗生素分子中特定的氨基或羟基，使得抗生素与大肠埃希菌核糖体之间的结合不够紧密，不能顺利进入下一抗菌环节发挥作用，进而让大肠埃希菌在存在氨基甙类抗生素的条件下依旧能够存活[21]。

氯霉素乙酰转移酶可催化氯霉素类药物的C-3位羟基使之乙酰化，乙酰化后的3-乙酰氯霉素无法与靶点结合，从而介导耐药性的产生[11]。

2.2.4. 靶点结构改变/靶点保护蛋白质

抗生素与细菌靶点的特异性结合可阻止目标靶点的正常活动而发挥抗菌作用。在不干扰靶点正常功能的前提下，靶点结构的改变能够有效地阻碍抗菌药物与之相结合，进而产生耐药性。除此之外，细菌还能够合成一些阻止抗生素与靶点结合的靶点保护蛋白质，依据作用方式可将其分为三类：I型在空间上覆盖抗生素的作用靶点；II型通过改变抗生素的靶位构象来间接移除抗生素；III型则诱导靶位构象改变，使其在结合抗生素的状态下也能工作[22]。例如携带Qnr基因的大肠埃希菌可编码五肽重复序列家族蛋白Qnr，Qnr蛋白能够与大肠埃希菌DNA回旋酶或拓扑异构酶IV结合从而减少大肠埃希菌中可用的喹诺酮结合位点，介导大肠埃希菌的喹诺酮抗性的产生[23]。

2.2.5. 细胞膜通透性降低

大肠埃希菌含有两层膜，其中一层是外膜(outermembrane, OM)，内含几种不同的外膜蛋白(outermembraneproteins, Omps)，孔蛋白是跨膜成孔Omps的一个亚类，可在膜上形成微小通道，允许亲水性化合物被动运输，有助于调节细胞通透性并增加抗生素耐药性。常见的孔蛋白包括OmpA、OmpC、OmpF、OmpW以及OmpX，其中尤以OmpC、OmpF最为常见[24]。有研究表明，在所有对碳青霉烯不敏感的大肠杆菌分离株中，OmpC的转录和蛋白表达均降低，通过克隆OmpC基因，一个分离株的碳青霉烯敏感性得以恢复[25]。OmpF通过提供脂多糖结合位点，在短抗菌肽的渗透中起着至关重要的作用[26]。已证明大肠杆菌的OmpF能够使β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类抗生素穿透OM，因此，OmpF缺陷突变体导致了许多β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素耐药的产生[27]。

孔蛋白表达的变化往往仅导致抗生素耐药性的轻微提升，但这种变化会减少抗生素的摄取量，进而增强其他并存耐药机制的作用，最终促成高水平耐药性的产生[28]。

2.2.6. 主动外排系统增强

主动外排系统增强可能是细菌应激反应中作用最快、最有效的抵抗机制。目前，已经确定了六个有助于细菌药物外排的外排泵家族。其中，ATP结合盒家族直接利用ATP作为能源来驱动运输，而RND家族是次级活性转运蛋白，由跨膜离子梯度中捕获的电化学能量提供动力[29] [30]。RND家族外排泵AcrAB-tolC的过表达已被发现是肠杆菌科替加环素耐药的主要因素[31]。AcrAB-TolC药物外排泵复合物由连接转运蛋白与通道蛋白的AcrA、识别底物并利用质子驱动力进行底物易位的AcrB、为底物提供穿越外膜孔道的TolC组成，其可识别和结合来自细胞质、内膜外小叶、周质和内膜的底物，然后通过延伸到外膜的通道蛋白将这些底物排出到细胞外[32]。AcrAB-TolC外排泵是大肠埃希菌唯一具有广泛底物特异性且高水平组成性表达的外排系统[33]，缺失AcrAB-TolC复合物任一相应基因的大肠埃希菌突变体对许多抗生素的敏感性均显著增加[2]。

2.3. 适应耐药性

适应性耐药性是由特定信号或环境条件诱导的对一种或多种抗生素的耐药性，这种适应性耐药性是有条件的、不稳定的、暂时的、且不垂直遗传的，这种耐药性通常在信号或条件消除后消失[34]。

2.3.1. 代谢改变与营养缺陷

某些细菌代谢通路中的基因突变后会引起细菌耐药性。Lopatkin等人[35]对大肠埃希菌进行了测序和分析，发现与中心碳原子和能量代谢相关的基因造成的代谢改变可导致大肠埃希菌基础呼吸降低，从而阻止抗生素介导的三羧酸循环活性诱导，从而避免代谢毒性并最大限度地降低药物致死率。几种已确定的代谢特异性突变在>3500种临床大肠杆菌病原体的基因组中过度代表，表明具有临床相关性。

营养缺陷型生物缺乏在基因水平上合成氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸或代谢辅酶所需的基本代谢途径[36]。Yu [36]通过分析地球微生物组计划的部分数据以及广泛的肠道微生物组数据，并通过可追溯的SeMeCo模型(一种基于酵母的同基因模型，用于营养缺陷型亚群的研究)证实，发现氨基酸营养缺陷型生物相比原生营养型生物对广泛的药物暴露更具适应性。潜在机制是细胞从特定必需代谢物的自我合成转变为从外部摄取必须营养物质所致。有研究指出，细菌的营养缺陷型与代谢改变相互作用可以增强抗菌药物耐受性[36] [37]。

2.3.2. 细胞形态改变

抗生素的抑菌效率与细菌形态密切相关。如细菌体积增加可稀释进入细菌的抗生素浓度，而细菌形态弯曲可以通过降低表面体积比来减少其表面抗生素积累，从而提高对抗生素的耐受性[1]。Mickiewicz等人[38]发现30名老年复发性尿路感染患者中有29名的新鲜尿液中存在细胞壁缺陷(L型)细菌。在尿液中，来自患者样本的大肠埃希菌菌株细胞壁在靶向抗生素的攻击过程中很容易地被诱导从壁状态转变为L型状态存活和分裂(这可能与细胞壁为多种抗生素的作用靶点有关)，停用抗生素后，它们会有效地切换回带壁状态，可能为感染的复发提供途径。

2.3.3. 生物膜形成

生物膜主要由微生物细胞和自产细胞外聚合物基质(extracellular polymeric substance, EPS)如水、多糖、蛋白质、表面活性剂、脂质、DNA和RNA等组成[39]。大肠埃希菌可通过各个生物系统的调控，诱导卷曲菌毛(curli)和EPS的合成进而形成生物被膜，由浮游状态转变为生物膜状态[40]。常规抗生素能有效杀死生长和分裂的浮游状态细菌细胞，但细菌形成生物膜后对抗生素的抵抗力可提高1000倍以上[41]。其耐药机制包括分子电荷屏障限制抗生素渗透、抗生素水解酶破坏抗生素结构作用，且生物膜具有不均质性，氧含量和营养物质浓度呈现出由外向内逐渐递减的状态。在生物膜较深的部位，部分细菌会因营养物质缺乏和代谢废物的积聚而处于非增殖状态。这类处于非增殖期的细菌难以被抗生素有效杀灭，一旦停止用药，生物膜深层的非增殖期细菌可以借助死亡细菌为营养迅速繁殖形成新的生物膜，再次导致机体出现相关不良反应[42]。

3. 大肠埃希菌新兴治疗策略

大肠埃希菌耐药性问题已成为全球公共卫生领域亟待解决的严峻课题，给临床诊疗带来了严峻挑战。近年正在积极尝试开发新的抗菌方法，其中有一些在研究阶段就呈现出了很强的抗菌效果，而且显示出了良好的应用前景，例如新型抗菌化合物分子、噬菌体、抗菌肽、光动力疗法、CRISPR-Cas系统、反义疗法等[43]。

3.1. 新型抗菌药物

抗生素按照化学结构可分为喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、磺胺类、糖肽类和氨基糖苷类抗生素等[44]，传统抗菌药物对耐药大肠埃希菌抑菌能力有限，因此，迫切需要研发新型抗菌药物缓解临床耐药性问题。

3.1.1. 新型β-内酰胺类抗生素

头孢地尔是一种新型铁载体头孢菌素，通过细菌铁载体蛋白进入菌体。头孢地尔能够抵抗包括丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶的水解作用，对包括碳青霉烯耐药、多重耐药的肠杆菌科菌具有很强的体外抗菌活性[45]。新型碳青霉烯类抗菌药物Sulopenem (静脉注射和口服)和替比培南(口服)则可能在治疗产ESBLs肠杆菌和喹诺酮耐药病原体引起的复杂性尿路感染方面发挥作用[46]。

3.1.2. 新型β-内酰胺酶增效剂

β-内酰胺酶增效剂包括β-内酰胺酶抑制剂、外排泵抑制剂和膜通透剂[44]。

目前在临床上广泛应用的经典β-内酰胺酶抑制剂包括克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦，主要抑制A类(碳青霉烯酶除外)和某些C类丝氨酸β-内酰胺酶[47]，在此基础上推出新的β内酰胺酶抑制剂，包括阿维巴坦、瑞来巴坦、雷利巴坦、齐德巴坦、法硼巴坦、他尼硼巴坦、那库巴坦、Xeruborbactam等[44] [48]。其中，阿维巴坦、瑞来巴坦、齐德巴坦和那库巴坦都属于二氮杂双环辛酮(DBO)类，表现为A类和C类β-内酰胺酶的强效抑制剂[44] [48]。法硼巴坦、他尼硼巴坦和Xeruborbactam属于含环硼酸的β-内酰胺酶抑制剂，除可抑制丝氨酸β-内酰胺酶外，更显示出了抑制金属β-内酰胺酶的潜力，这归功于硼酸盐与β-内酰胺环相似的四面体结构[48] [49]。除此之外，环硼酸在sp2和sp3杂化状态之间的“变形”能力使其在与靶分子相互作用时具有更高的适应性和灵活性，这进一步有助于实现强效的抑制[48]。含硫基的卡托普利是一种常用的抗高血压药，也被报道为金属β-内酰胺酶的抑制剂，体外试验证明其能恢复美罗培南的抗菌活性[49]。

外排泵抑制剂苯丙酰精氨酰β-萘酰胺(Phenylalanyl arginyl β-naphthylamide, PAβN)因其对具有多种特异性外排泵的临床病原体具有潜在活性而被广泛探索；1-(1-萘甲基)-哌嗪(1-(1-napthylmethyl)-piperazin, NMP)是另一种假定的外排泵抑制剂，被证实能通过抑制底物与肠杆菌科病原体外排泵的直接结合来增强苯唑西林抗生素的效力；青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，通过与大肠杆菌的AcrAB-TolC结合而被鉴定具有外排泵抑制活性，从而增强几种β-内酰胺类抗生素抑菌效果[44]。

膜通透剂是一种使OM变弱从而促进抗生素进入细菌并发挥抗菌作用的化合物。但膜通透剂的研究尚处于起步阶段，多粘菌素抗生素和多粘菌素B的纳米肽衍生物被鉴定为具有显著的OM渗透活性，令人欣慰的是，基于多粘菌素B开发的名为NAB74的纳米肽已进入临床试验的初始阶段[44]，或许在不久的将来能够投入临床发挥其抗菌作用。

3.1.3. 中药

传统中医药是人类医学瑰宝，其可通过影响耐药菌细胞壁结构、改变耐药菌细胞膜通透性、抑制菌体内能量的生成、抑制耐药菌蛋白质合成、阻碍耐药菌核酸和叶酸合成、抑制灭活酶活性、增加细菌外膜通透性、抑制外排泵系统、影响生物被膜、调控耐药基因表达或转移、增强中性粒细胞的吞噬功能、减少细菌内毒素的释放等途径发挥抗菌作用[50] [51]。如大豆异黄酮的有效成分可与苹果酸脱氢酶(MDH)结合使其活性降低，从而导致菌体三磷酸腺苷(ATP)和烟酰胺辅酶(NADH)合成受阻，抑制呼吸链，最终使菌体的合成代谢受到抑制[51]。盐酸小檗碱可使大肠埃希菌细胞膜皱缩、菌体变形，导致细胞膜破裂、细胞质外泄，最终菌体死亡；另外小檗碱能使菌体表面菌毛数量减少，降低菌体黏附；降低DNA拓扑异构酶I、II的活性，影响菌体DNA合成；抑制钠钾ATP酶活力，影响菌体内外渗透压平衡；抑制菌体内糖代谢过程中的丙酮酸氧化，使菌体对维生素B6和烟酰胺等的利用受限[52]。

张文平等人[53]研究表明，含千里光血清(千里光水浸液灌胃小鼠获得的含药血清)作用于多重耐药大肠埃希菌后，对其R质粒的消除率为2.8%，同时可出现多重耐药性的丢失，其中以四环素的耐药性消除最多。刘平等人[54]研究表明，黄芩、黄柏、黄连、连翘、千里光水煎液对产ESBLs菌株均有不同程度的抑菌作用，其中黄芩抑菌效果较好，对产ESBLs的大肠埃希菌(46/80)的最低抑菌浓度为31.25 mg/mL。吕世等人明[55]研究表明，在10 μg/mL时芦荟大黄素、苦参碱和香紫苏醇对酶有极显著的抑制作用，且抑酶作用与10 μg/mL的克拉维酸钾相当；在50 μg/mL以上时，其单体对酶的抑制作用虽有提高但显著低于同等浓度的克拉维酸钾抑酶作用，虽然如此，在90 μg/mL时，芦荟大黄素、苦参碱和香紫苏醇的抑酶率分别可高达81.7%、71.7%和60.4%，仍表现出明显的增敏效果。李海华等人[56]对筛选的45味中药进行研究，发现大肠埃希菌在博落回、山楂、水杨梅、赤芍、黄柏、五味子、乌梅、黄连、马齿苋和诃子的作用下平均抑菌圈直径大于20 mm，表现出高度敏感。帅丽华等人[57]研究表明，黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与左氧氟沙星联合用药后对大部分多重耐药大肠埃希菌(90.9%)均表现为协同或相加作用，可增加抗菌效果。但现有研究多以体外研究为主，尚需进一步的临床数据加以证实。

3.1.4. 其他新型抗生素

依拉环素是一种新型全合成的含氟四环素类抗生素，具有广谱的抗菌活性。其在四环核心的C9位侧链上连接一个吡咯烷，C7位引入氟原子，从而赋予其强大的广谱抗菌活性[58]。同作为四环素类的新药，奥马环素显示出对广谱革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、非典型菌和厌氧菌的活性。几乎一半的碳青霉烯类不敏感肠杆菌分离株对奥马环素敏感[46]。

普拉佐米星是一种新开发的氨基糖苷类药物，其展现出了广谱的革兰阴性菌抗菌活性及更小的肾毒性和耳毒性，在治疗产ESBLs肠杆菌以及耐碳青霉烯类肠杆菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)方面有着出色的疗效，并且已获得FDA批准用于治疗复杂尿路感染[59]。

3.2. 抗菌药物新型复方制剂/长时间输注

β-内酰胺酶抑制剂复方是临床最常用的抗生素复方制剂，目前已有数个复方产品被开发，包括头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、头孢吡肟/他尼硼巴坦、亚胺培南/吡啶二甲酸、亚胺培南/西司他丁/瑞来巴坦、氨曲南/阿维巴坦、美罗培南/曲霉明素Ａ、美罗培南/法硼巴坦、美罗培南/ANT431、美罗培南/卡托普利、厄他培南/齐德巴坦等[45] [47] [59] [60]。头孢他啶/阿维巴坦对产β-内酰胺酶耐药肠杆菌、碳青霉烯耐药菌均展现出很强的活性，但对金属β-内酰胺酶无效[61]。对产NDM的CRE感染，美国传染病学会颁布的2022版CRE治疗指南建议联合使用头孢他啶/阿维巴坦(2.5g IV q8h)和氨曲南(2.5g IV q8h)，且滴注时间需大于3 h [62]。厄他培南/齐德巴坦1:1组合可以有效抑制超过90%的产AmpC、ESBLs、KPC、MBL或OXA-48酶的大肠埃希菌[48]。美罗培南/法硼巴坦主要用于治疗18岁及以上患者的复杂尿路感染，亦可用于治疗由CRE引起的其他系统难治性感染[48]。

氟喹诺酮杂合体可同时作用于致病菌的多个靶点，具有发挥多重抗菌作用和克服耐药性的潜力。近年来，药物化学家设计、合成了多个系列氟喹诺酮杂合体，其中，4-喹诺酮-β-内酰胺杂合体6a,b对耐氟喹诺酮大肠埃希菌活性是环丙沙星、左氧氟沙星的20倍左右，环丙沙星–头孢菌素杂合体7则具有良好的抗产金属-β-内酰胺酶大肠埃希菌活性[63]，均为应对大肠埃希菌耐药问题提供了更多治疗手段。

来自药代动力学和药效学研究的综合数据支持长时间(即延长或持续)输注β-内酰胺类抗生素给药可优化治疗效果。基于β-内酰胺类抗生素的时间依赖性杀菌活性，持续输注(在24小时内给予总剂量)或延长输注(每次剂量的输注时间比标准许可时间更长，如哌拉西林/他唑巴坦的输注时间为3小时而不是30分钟)可通过增加体内有效抗菌药物浓度的持续时间提高杀菌活性[64]。

3.3. 噬菌体

噬菌体是一种能够感染并破坏细菌的病毒，相较于抗生素，其在治疗应用上展现出多个优势：宿主范围窄、有助于保护宿主的正常共生微生物群、能够在感染部位进行繁殖、对人类安全无害[65]。在天然噬菌体的基础上，利用生物学技术对现有噬菌体进行改造或构建新的噬菌体，以赋予其新功能，有助于增强噬菌体抑菌能力、缓解快速耐药问题[66]。大肠埃希菌外排系统的TolC蛋白是噬菌体进入细胞的受体，当噬菌体和抗生素联合使用时，大肠埃希菌TolC蛋白发生突变，重新转变为抗生素敏感型，并可恢复对新霉素的高度敏感性[67] [68]。

3.4. 抗菌肽

抗菌肽别称宿主防御肽，是天然存在于生命体中的多肽物质，大都具有广谱的抗菌活性[69]。相比于传统的抗生素，抗菌肽具有杀菌谱更广、相对安全和低毒性、细菌对其更难产生耐药的优势[70]。对肠道微生物群培养和功能性亚基因组学研究表明，大肠杆菌产生抗菌肽抗性基因的潜力有限，这表面抗菌肽在未来抗菌应用中具有巨大潜力[71]。目前临床上使用的抗菌肽有达托霉素，多黏菌素B，万古霉素和替考霉素[59]。Imai等[72]在发光杆菌的代谢产物中提取出了一种短肽，这种短肽具有选择性杀伤革兰阴性菌的能力，对革兰阳性菌没有活性，且未展现出细胞毒性，在治疗大肠埃希菌感染方面有极好的效果。

3.5. 纳米技术

尺寸比生物被膜孔径小的纳米材料能够穿过生物被膜基质并轻易到达其内部。利用纳米技术可以将药物携带至细菌内部，从而达到治疗的目的，这种联合用药方式可以降低药物使用剂量，进而减少药物毒性，减轻机体不良反应。除了作为药物的载体之外，纳米材料自身也具备抗菌活性，其作用机制包括[73]：① 带有正电荷的纳米粒子和带负电荷的细菌通过静电力以及范德华力相互结合，致使细菌的细胞壁遭到破坏；② 金属离子可以直接与细菌的核酸或蛋白质相结合，破坏酶的完整性，进而扰乱细菌的代谢；③ 活性氧(ROS)会引发氧化应激，导致细菌的多个组分，如蛋白质、脂质、DNA等遭到破坏。由于纳米材料不像抗生素那样具有明确的作用方式，因此它们对于解决细菌病原体的耐药性非常有用[74]。纳米材料具有较大的表面积与体积比，有助于结合多种配体(抗生素分子)以制备抗细菌病原体的多价纳米颗粒，将抗生素有效地输送到耐药病原体中。脂肪族聚酯是较为常用的纳米聚合物载体，其中聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)由于具有卓越的缓释特性、良好的生物相容性等优势获得了FDA的批准使用[75]。据已有报道显示，将环丙沙星组装在PLGA上，会发现该组装体展现出较高的载药量和通透性，能够在局部形成较高且持久的药物浓度，并且还可以降低药物副作用[76]。

3.6. 光动力疗法

光动力疗法是光敏剂在一定波长的光照下，会产生对靶细胞有毒的单线态氧(¹O₂)从而杀死特定靶细胞的一种新型治疗方法。抗菌光动力疗法是光动力疗法的衍生疗法，其能杀灭敏感细菌和耐药细菌，且不会出现耐药性，是一种非常有前景的治疗方法[77]。Khan等人[78]通过使用大肠埃希菌作为研究模型，证明了核黄素的光动力抗菌潜力，而且发现光活化核黄素的作用机制为利用核黄素的基本化学特性来产生ROS。Ronqui等人[79]研究发现，光动力疗法作为单一疗法时可破坏生物被膜，当其协同环丙沙星治疗后，则显著减少了大肠埃希菌的生物被膜。

3.7. CRISPR-Cas系统

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的规则间隔短回文重复序列)-Cas (CRISPR相关核酸内切酶)系统是结合和切割外源核酸的原核适应性免疫系统，可以特异性识别和降解DNA或RNA，执行DNA切割、精确基因修饰、控制基因表达、表观遗传改变等功能[80] [81]。在运用传统抗生素时，会残留亚致死剂量，细菌在低浓度的抗生素环境中能出现基因突变或表型改变，进而产生耐药基因型[1]。鉴于细菌获得耐药性这一情况，有必要研发能够精准作用于突变位点的工具，以此实现对特定耐药性细菌的针对性清除。常见的用于CRISPR-Cas递送的载体有噬菌体、纳米颗粒和共轭质粒[82]。Kim等人[83]将靶向β-内酰胺酶突变体保守序列的sgRNA和Cas9转导至产超广谱β-内酰胺大肠埃希菌中，成功抑制了β-内酰胺酶基因突变体的生长。

3.8. 反义疗法

反义疗法作为一种新兴的治疗策略，通过设计反义寡核苷酸来抑制细菌必要基因的表达，从而可能逆转细菌耐药性[84]。在这种疗法中，反义分子通过碱基互补配对原则识别并结合靶基因的mRNA，调控其表达。Suzuki等人[85]设计了一个24-nt反义序列，它与大肠埃希菌翻译起始密码子和翻译信号区域绝对互补，从而损害其核糖体与mRNA的结合并干扰翻译。acpP基因表达对于脂肪酸生物合成至关重要，是反义RNA肽偶联物的已知靶标，通过设计acpP基因的反义RNA序列能使必需acpP蛋白表达降低，从而使大肠埃希菌的生长受到抑制[85]。王慧[86]以耐氟喹诺酮类大肠埃希杆菌的耐药基因acrB mRNA为靶点，挑选出一条最佳反义核苷酸PS-ODNs831，同时设计了随机对照链PS-ODNs0701，最终结果显示靶向作用于acrB mRNA的PS-ODNs831能有效逆转耐氟喹诺酮类大肠埃希杆菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药性。CTX-M是我国最常的ESBLs基因型，张劲丰等人[87]针对CTX-M基因，利用RNA structure3.7软件辅助设计一系列反义寡核苷酸并挑选出最佳的反义寡核苷酸，同时设计一条随机寡核苷酸(对照链)，结果显示，反义寡核苷酸能显著减少医院标本大肠埃希菌的菌落数，抑制其增殖。但反义核苷酸技术在抑菌领域的研究多以体外研究为主，临床使用资料匮乏，尚需进一步的临床数据以判断其体内疗效。

3.9. 粪菌移植

肠道菌群是抗菌药物抗性基因的储存库，其总和被称为“耐药基因组”。据2022年的一项Meta研究结果可知，78.7% (74/94)的患者在给予粪菌移植操作后，于6至12个月后肠道内的CRE得以成功去定植[88]。Ghani等的研究成果表明，20例出现多重耐药菌定植或感染的免疫低下患者在接受粪菌移植治疗后，在6个月内发生多重耐药菌相关及全因血流感染的可能性较之前下降[89]。对于具有多重耐药菌定植危险因素、接受过化学治疗或长时间抗菌药物治疗的免疫低下患者，粪菌移植可能是一种安全、经济、有效的血流感染预防措施[90]。

4. 结论与展望

当前针对耐药性大肠埃希菌，已不断有新药研发并逐渐进入临床试验，但由于新药研发周期长、成本高、细菌耐药性快速演变等，大肠埃希菌耐药仍是一项非常严峻的问题。总之，现有的抑菌策略对大肠埃希菌的防治取得了一定的成果，未来应积极推进跨学科合作，深化研究抑菌机制、不断进行技术创新，进一步开发安全有效且具有普适性的抗菌手段。

NOTES

^*通讯作者。