基于铜死亡相关基因和多组学分析的新型预后模型预测膀胱尿路上皮癌患者的预后

A Novel Prognostic Model Based on Cuproptosis-Related Genes and Multi-Omics Analysis for Predicting the Prognosis of Patients with Bladder Urothelial Carcinoma

摘要: 铜死亡是一种特殊的细胞死亡形式。膀胱癌，特别是膀胱尿路上皮癌(BLCA)，是全球十大最常见癌症之一。迄今为止，铜死亡在BLCA中的潜在作用尚不明确。在本研究中，我们基于从癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合(GEO)数据库下载的数据，系统评估了509个BLCA样本中19个经过验证的与铜中毒相关基因(CRGs)介导的铜中毒模式。使用Kaplan-Meier方法分析不同风险组的总体生存率(OS)。使用基因集变异分析(GSVA)研究不同铜死亡簇(CR簇)之间的差异。使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)讨CRG簇与免疫状态之间的潜在关系。我们使用GO (基因本体)和KEGG (京都基因与基因组百科全书)富集分析研究各种细胞生化过程。最后，我们建立了一个预后模型，以预测患者的生存结果，并进一步分析BLCA患者的预测特征与各种治疗反应之间的相关性。在本研究中，我们得出了两个CRG簇和基因簇，并建立了一个模型来量化个体BLCA患者的风险评分，发现其与多种临床特征密切相关，并能够准确预测BLCA患者的预后。我们相信，通过本研究，对单个样本中铜死亡介导模式的定量分析可能有助于提高我们对BLCA多组学特征的理解，并指导未来的治疗方案。

Abstract: Cuproptosis is a special form of cell death. Bladder cancer, especially Bladder Urothelial Carcinoma (BLCA), is one of the ten most common cancer types in the world. So far, the potential role of cuproptosis in BLCA is unclear. In the present study, we systematically evaluated the copper poisoning-mediated patterns of 509 BLCA samples based on 19 validated copper poisoning-related genes (CRGs) using data downloaded from the Cancer Genome Atlas (TCGA) and the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Kaplan Meier method was used to analyze the overall survival rate (OS) of different risk groups. Gene Set Variation Analysis (GSVA) was used to study the functional differences between different cuproptosis clusters (CRG clusters). Single sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) was used to explore the potential relationship between CRG clusters and immune status. We used GO (Gene Ontology) and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) enrichment analysis to study various cellular biochemical processes. Finally, we established a prognostic model to predict patients’ survival outcomes and to further analyze the correlation between the predictive characteristics of BLCA patients and various treatment responses. In this study, we derived two CRG clusters and gene clusters and also established a model to quantify the risk score of individual BLCA patients, which was found to be closely associated with various clinical characteristics and could precisely predict the prognosis of BLCA patients. We believe that through our study, quantitative analysis of cuproptosis-mediated patterns in a single sample may help to improve our understanding of the multi-omics characteristics of BLCA and guide future treatment regimens.

1. 引言

众所周知，膀胱尿路上皮癌(BLCA)是膀胱癌的主要亚型，也是威胁人类健康的最常见癌症之一。据相关文献报道，BLCA已在全球范围内导致超过20万人死亡[1]。尽管膀胱癌可以通过多种手术方法进行治疗，但术后患者仍可能出现复发和转移。目前，临床分期或病理分级被广泛用于指导临床治疗和预测生存结果。有研究报道，p53、ERCC2和RB1等基因的典型致癌突变与BLCA的发生密切相关[2]。晚期膀胱癌患者通常被建议接受以顺铂为基础的化疗作为一线治疗，有时也会采用免疫治疗作为二线治疗[3]。不幸的是，由于目前对BLCA的发病机制了解有限，化疗和免疫治疗的效果非常有限。

细胞死亡在多细胞生物的发育和进化中起着重要作用。不难发现，不同阶段肿瘤治疗的进展总是与我们对不同类型细胞死亡模式的理解相关。我们知道，铜离子是体内许多生化过程中不可或缺的微量元素。相关研究表明，癌症患者血清和肿瘤组织中的铜离子水平明显高于正常人[4]-[6]。铜离子的稳态调节可能会引发细胞毒性，因此改变细胞内铜离子水平可能会影响癌症的发展和进展[7]。基于这一机制，铜螯合剂(如四硫钼酸盐、三羧酸盐等)和铜离子载体(如二硫代氨基甲酸盐、二硫酮、厄尔利克氯化物等)等新型药物已被应用于临床抗癌治疗[8]-[11]。最近，一种名为铜死亡的新型细胞死亡形式被发现。研究人员证实，铜离子可以直接与三羧酸(TCA)循环中的脂肪酰化成分结合，产生有毒的蛋白质应激效应，最终导致细胞死亡[12]。

如前所述，铜死亡在BLCA中是否发挥重要作用，以及它是否是开发新型治疗策略的未来方向，仍不明确。本研究旨在系统分析BLCA中铜死亡的介导模式，并基于509个样本的转录组和临床信息，分析这些模式与各种临床特征之间的内在联系。我们最终确定了两种不同的铜死亡介导模式，并发现它们与BLCA的多组学特征存在显著关联。因此，我们建立了一个预后模型，并基于独特的风险评分系统对铜死亡模式进行量化，以进一步检验该模型在预测生存结果中的作用，并分析不同BLCA患者群体的临床特征和治疗反应。

2. 材料和方法

2.1. 数据检索与处理

首先，我们回顾了过去两年与铜死亡相关的一些影响研究结果，以识别铜死亡相关基因(CRGs)。我们的当前研究包括19个CRGs。所有BLCA患者的DNA测序数据从癌症基因组图谱(TCGA数据库)和基因表达综合(GEO数据库)下载。由于GSE13507数据集基于不同测序平台(如芯片与RNA-seq)，部分基因(LIPT2和GCSH)的表达数据存在批次效应或无法标准化匹配，因此在合并队列中仅保留了17个CRGs用于后续分析。我们排除了没有详细生存信息或样本量小的数据集。最终，我们选择了两个合格且高质量的批量序列队列(包括TCGA-BLCA和GSE13507)。tcga-blca数据集中的转录组数据下载格式为每百万人映射转录本每千碱基(FPKM)。然后，我们将每个样本的FPKM值转换为每千碱基每百万的转录本(TPM)。同时，我们下载了GSE13507数据集的标准化矩阵文件及其相应的临床信息，合并这些数据集，并使用R包“sva”通过combat算法消除批次效应。突变图也从TCGA数据库下载。CNV矩阵来自UCSC Xena。所有原始数据均通过R程序版本4.1.3进行处理和研究。

2.2. CRGs在合并队列中的无监督聚类

首先，调查了所有CRGs在TCGA-BLCA队列中的拷贝数变异(CNVs)和体细胞突变。然后，使用“maftools”R软件包分析和可视化体细胞突变谱。接下来，使用“RCircos”包描述CRGs在染色体上的CNV详细位置。最后，我们使用R语言的“limma”、“reshape2”和“ggpubr”包找出这些CRGs在不同组织之间的表达是否存在显著差异。

我们进一步将两个队列(TCGA-BLCA, GSE13507)合并为一个单一矩阵，以识别BLCA中不同的铜死亡介导模式。使用单因素Cox回归分析调查这些基因的预后作用。随后，我们基于这些基因的无监督聚类分析调查铜死亡的介导模式。使用“Consensus Cluster Plus”R包的共识聚类算法确定不同聚类的稳定性和数量，并重复此过程1000次以提高分类的稳定性。

2.3. CRG簇的生存差异、潜在功能和免疫浸润

在获得CRG簇的分类后，我们进行了生存分析，以研究CRG簇之间的生存差异。使用R包“survminer”绘制Kaplan-Meier生存曲线(p < 0.05认为具有显著性)。主成分分析(PCA)也用于检验不同CRG簇之间的差异。众所周知，GSVA是一种常用于癌症相关研究的生物信息学算法[13]-[15]。在本研究中，我们使用“GSVA”R包进行GSVA分析，以检测不同铜死亡介导模式之间的生物活性差异。GSVA分析参考“C2.Cp.kegg.V6.2.-sign”进行，显著性设定为p值 < 0.001。最后，我们进行了ssGSEA分析，以评估不同CRG簇中BLCA患者的免疫浸润和免疫相关功能[16]。然后，我们使用Wilcoxon检验比较不同CRG簇之间免疫浸润和免疫相关功能的差异。

2.4. 功能注释和铜死亡基因特征的生成

对在铜死亡介导模式中发现的差异表达基因(DEGs)进行GO和KEGG富集分析，基于R语言包“clusterprofiler”、“org.Hs.eg.db”、“ggplot2”和“enrichplot”，定义调整后的p值 < 0.01和|logFC| > 1。然后，我们进行了无监督聚类分析，以识别潜在的调控机制，并使用R语言的“limma”、“consensusclusterplus”和“survival”包将所有BLCA患者分为不同的基因组亚组。使用R包“survminer”绘制Kaplan-Meier生存曲线(p < 0.05认为有显著性)。我们还使用R语言的“pheatmap”软件包绘制不同基因簇与临床特征之间的关系。

2.5. 预后模型的开发与评估

我们进一步建立了一个预后模型，以预测BLCA患者的生存状态和生存时间。首先，我们将509名BLCA患者分为两组：训练组(n = 255)和测试组(n = 254)。然后，我们选择了通过铜死亡聚类确定的DEGs，并在合并数据集中进行了标准化。接下来，我们在训练数据集中使用单因素Cox回归分析筛选单因素显著基因(预后显著基因/独立预后基因)，使用R语言的“survival”包，设定p值 < 0.05为显著差异。随后，我们应用R语言的“glmnet”和“survminer”包对所有独立预测基因进行LASSO回归分析，并成功避免多重共线性。为确保模型稳定性，我们通过10折交叉验证选择最优正则化参数(λ)，并重复抽样100次以验证基因选择的可靠性。结果显示，最终选定的10个基因在90%的重复抽样中稳定出现，表明模型具有较高的鲁棒性。最后，我们通过Cox多变量比例风险回归模型进行多变量生存分析，获得最佳的独立预后基因预测特征。风险评分公式如下：

其中，Expri表示单因素显著基因的表达水平，Coef表示LASSO Cox回归系数。我们使用训练数据集中风险评分的中位数作为风险截止值，将BLCA患者分为高风险(>中位数)和低风险(≤中位数)组。使用R包“survminer”绘制不同风险组的Kaplan Meier (KM)生存曲线(p < 0.05)。我们使用R语言的“timeROC”包计算1年、3年和5年的受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)值，以评估预测模型的预测价值。我们使用测试组评估预后模型的性能，并建立整合风险、性别、年龄和肿瘤分级的列线图，以预测BLCA患者的1年、3年和5年生存结果。

2.6. 药物敏感性分析

更重要的是，由于铜死亡的生物过程与化疗和免疫治疗相关，我们进一步探索了化疗药物敏感性(如吉西他滨、紫杉醇、顺铂、多西他赛、甲氨蝶呤、丝裂霉素C)与风险组之间的关系，使用R包“pRRophetic”进行预测。我们使用Pearson检验进行不同风险组与药物敏感性之间的相关性分析。相关研究基于792种药物或美国食品药品监督管理局(FDA)批准的临床试验的效果。

2.7. 统计分析

我们使用R软件版本4.1.3进行所有数据处理和统计分析，独立样本t检验用于定量变量分析。我们使用ROC曲线分析和Kaplan Meier生存分析来分析R软件在预测生存结果中的有效性。我们使用Cox比例模型研究预后分类与生存结果及其他临床参数之间的潜在联系。本研究中的所有p值均为双侧，默认p值 < 0.05具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 膀胱癌(BLCA)中铜死亡相关基因(CRGs)的遗传变异图谱

在本研究中，我们系统回顾了过去两年关于铜死亡的高质量研究，最终确定了19个相关的铜死亡相关基因(CRGs)，包括LIPT2、NLRP3、LIPT1、GCSH、NFE2L2、MTF1、PDHA1、SLC31A1、DLD、LIAS、ATP7A、GLS、DBT、FDX1、PDHB、ATP7B、CDKN2A、DLST和DLAT。我们调查了上述CRGs在TCGA-BLCA队列中的拷贝数变异(CNV)和体细胞突变。通过CNV分析，我们发现相关CRGs的CNV频率显著(图1(A))。

Figure 1. Landscape of genetic variations in cuproptosis-related genes in BLcA. (A) CNV distributions of cuproptosis-related genes in bladder tumours; (B) Waterfall plot demonstrating the somatic mutation status of cuproptosis-related genes in bladder cancer. Each column indicates individual samples, and the upper bar plot represents the TMB value. The number on the right represents the frequency of somatic mutations; (C) CNV locations of cuproptosis-related genes on 23 human chromosomes; (D) Different expressions of cuproptosis-related genes in tumour and normal tissues

图1. 膀胱尿路上皮癌(BLCA)中铜死亡相关基因的遗传变异图谱。(A) 膀胱肿瘤中铜死亡相关基因的拷贝数变异(CNV)分布；(B) 水瀑布图展示膀胱癌中铜死亡相关基因的体细胞突变状态。每列代表单个样本，上方的条形图表示肿瘤突变负荷(TMB)值。右侧的数字代表体细胞突变的频率；(C) 铜死亡相关基因在23条人类染色体上的CNV位置；(D) 铜死亡相关基因在肿瘤组织和正常组织中的不同表达

首先，我们总结了BLCA中19个CRGs的CNV和体细胞突变的流行情况。如图1(B)所示，CRGs的突变出现在414个样本中的97个(23.43%)。可以看到，NFE2L2的突变频率最高，其次是CDKN2A、NLRP3、ATP7B、MTF1、DLD、ATP7A、DLAT、LIAS、PDHA1、DBT和GLS，而PDHB、SLC31A1、FDX1、LIPT1、GCSH、DLST和LIPT2在BLCA样本中没有突变。大多数CRGs表现为拷贝数扩增，包括LIPT2、NLRP3、LIPT1、GCSH、NFE2L2、MTF1、PDHA1、SLC31A1、DLD、LIAS和ATP7A，而其他CRGs (如GLS、DBT、FDX1、PDHB、ATP7B、CDKN2A和DLAT)主要表现为拷贝数缺失。大多数CRGs在BLCA与正常组织之间的表达差异显著(图1(D))。此外，包括NFE2L2、NLRP3、ATP7A、SLC31A1、LIPT2、DLD、MTF1、CDKN2A、GCSH和DLST的CRGs在肿瘤与正常组织之间的表达明显不同。我们绘制了相关CRGs在染色体上的CNV详细位置，如图1(C)所示。拷贝数和基因突变的高度异质性表明CRGs在BLCA的发展中具有重要作用。

3.2. 基于17个铜死亡相关基因构建铜死亡相关基因簇

Figure 2. The prognostic role of cuproptosis-related genes in the merged cohort. (A) A network illustrating interactions between 17 cuproptosis-related genes; (B)~(L) Kaplan-Meieranalysis of 11 cuproptosis-related genes with prognostic roles in BLCA in the merged cohort

图2. 合并队列中铜死亡相关基因的预后作用。(A) 展示17个铜死亡相关基因之间相互作用的网络；(B)~(L) 在合并队列中对BLCA (膀胱尿路上皮癌)具有预后作用的11个铜死亡相关基因的Kaplan-Meier分析

随后，将TCGA-BLCA和GSE13507队列合并为一个单一矩阵文件以进行进一步分析。由于我们使用的研究队列属于不同的测序平台，因此仅从合并队列中提取了17个CRGs (包括NLRP3、LIPT1、DLST、NFE2L2、MTF1、PDHA1、SLC31A1、DLD、LIAS、ATP7A、GLS、DBT、FDX1、PDHB、ATP7B、CDKN2A和DLAT)。我们首先调查了这些基因之间的相互作用，并进一步分析它们在预测BLCA患者生存结果中的不同价值。绘制图2(A)以显示17个基因之间的关系。可以发现SLC31A1、LIPT1和DLAT在关系网络中发挥了重要作用。结果显示相关CRGs之间存在潜在关系，这可能在未来对BLCA患者的预后发挥关键作用。研究中有11个基因在预测BLCA生存结果方面具有显著的预后价值，包括SLC31A1、DLD、DLAT、PDHB、ATP7B、MTF1、CDKN2A、LIPT1、DLST、NFE2L2和NLRP3。我们在图2(B)~(L)中展示了这些预后基因的Kaplan-Meier分析曲线。结果进一步表明大多数CRGs相互作用，并在BLCA的发展中发挥重要作用。

Figure 3. Cuproptosis clusters in the merged cohort. (A) Consensus clustering matrix for k = 2; (B) Principal component analysis for the transcriptome profiles of two cuproptosis patterns, showing a remarkable difference on transcriptome between two cuproptosis patterns; (C) Heatmap demonstrating various clinicopathological features of two distinct cuproptosis clusters; (D) Kaplan-Meier curves indicated cuproptosis patterns were markedly related to overall survival of 509 patients in meta-cohort, of which 322 cases were in CRG cluster A, 187 cases in CRG cluster B (p = 0.015, log-rank test)

图3. 合并队列中的铜死亡聚类。(A) k = 2时的共识聚类矩阵；(B) 对两种铜死亡模式的转录组谱进行主成分分析，显示两种铜死亡模式在转录组上存在显著差异；(C) 热图展示两种不同铜死亡聚类的各种临床病理特征；(D) Kaplan-Meier曲线表明，在meta-队列的509名患者中，铜死亡模式与总生存期密切相关，其中322例属于CRG聚类A，187例属于CRG聚类B (p = 0.015，对数秩检验)

此外，我们还使用“ConsensusClusterplus” R包根据17个CRGs的不同表达水平将所有合并样本分类为不同的CRG簇。CRGs的转录谱存在显著差异，如图3(A)所示。PCA分析显示两个不同CRG簇的患者分布在两个方向上(图3(B))，其中CRG簇A有322例，CRG簇B有187例。图3(C)中的热图显示CRG簇与各种临床特征之间的详细关系。CRG簇A的所有CRGs均显著增加，而CRG簇B则显著减少。如图3(D)所示，划分在CRG簇B的患者生存结果更好。

3.3. 两个铜死亡相关基因簇的基因集变异分析(GSVA)和单样本基因集富集分析(ssGSEA)

为了进一步揭示不同CRG簇的潜在生物活性，我们进行了GSEA分析，发现CRG簇B在脂质代谢活动(如亚油酸和花生四烯酸代谢)方面显著富集(图4(A))。CRG簇A主要富集于TCA循环、神经营养因子信号通路和肿瘤发生通路。然后，我们进行了免疫细胞浸润相关性分析，发现CRG簇A和B在几乎所有免疫细胞中均显著富集，如活化的CD4T细胞、活化的CD8T细胞、活化的树突状细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)和自然杀伤细胞(图4(B))。CRG簇B中先天免疫细胞的浸润显著更高，包括CD56 dim自然杀伤细胞、17型辅助性T细胞和单核细胞，这与更好的预后相一致(图4(B))。而CRG簇A中各种免疫细胞的浸润较高，但其预后却相对较差。我们进一步回顾了一些研究，认为这种现象可能与肿瘤微环境(TME)中先天免疫细胞和适应性免疫细胞促进肿瘤进展有关[17]。值得注意的是，CRG簇B中先天免疫细胞的浸润与更好的预后相关，可能是由于脂质代谢增强导致肿瘤细胞对铜死亡更敏感，进而激活免疫清除机制。然而，本研究中观察到的相关性仍需通过体外实验(如共培养模型)或单细胞测序进一步验证免疫细胞是否直接调控铜死亡通路，或反之。未来研究可结合多组学数据解析TME中铜死亡与免疫互作的分子机制。

3.4. 铜死亡相关基因簇的构建

我们对在不同CRG簇中发现的1578个差异表达基因(DEGs)进行了GO和KEGG富集分析，使用R语言包“clusterprofiler”。通过GO富集分析，所有细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)模式显著与免疫相关(图4(C)，图4(D))。KEGG富集分析也显示相关基因在免疫相关通路中显著富集(图4(E)，图4(F))。我们进一步得出结论，铜死亡是BLCA免疫调节中不可或缺的组成部分。

Figure 4. GSVA, ssGSEA, Go and KEGG Enrichment Analysis of Two CRGclusters. (A) Heatmap demonstrating various clinicopathological features of two distinct CRG clusters; (B) ssGSEA analysis of two distinct CRG clusters. The asterisk symbol indicated the statistical p-value. (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001); (C) Bar plot presenting GO enrichment analysis; (D) Bubble chart presenting GO enrichment analysis; (E) Bar plot presenting KEGG enrichment analysis; (F) Bubble chart presenting KEGG enrichment analysis

图4. 两种CRG聚类的GSVA、SSGSEA、GO和KEGG富集分析。(A) 热图展示两种不同CRG聚类的各种临床病理特征；(B) 两种不同CRG聚类的SSGSEA分析。星号表示统计p值。(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)；(C) 展示GO富集分析的柱状图；(D) 展示GO富集分析的气泡图；(E) 展示KEGG富集分析的柱状图；(F) 展示KEGG富集分析的气泡图

Figure 5. Cuproptosis related gene clusters in the merged cohort. (A) Consensus clustering matrix for k = 2; (B) Kaplan-Meier curve survival analysis between two distinct gene clusters; (C) Heatmap demonstrating various clinicopathological features of two distinct gene clusters; (D) Different expression levels of 17 cuproptosis-related genes in distinct gene clusters. The asterisk symbol indicates the statistical p-value; (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

图5. 合并队列中的铜死亡相关基因聚类。(A) k = 2时的共识聚类矩阵；(B) 两种不同基因聚类间的Kaplan-Meier曲线生存分析；(C) 热图展示两种不同基因聚类的各种临床病理特征；(D) 不同基因聚类中17个铜死亡相关基因的不同表达水平；星号表示统计p值；(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

然后，我们进行了无监督聚类分析，进一步将样本分为不同的基因簇。最终识别出两个基因簇，分别命名为基因簇A和B (图5(A))。图5(B)显示不同基因簇在生存结果中的显著差异，并展示了两个基因簇与各种临床参数之间的关系。很明显，基因簇B主要由CRG簇B的患者组成，具有更好的TNM分级，并且在低级别中富集(图5(C))。因此，患者在基因簇B中具有更好的预后并不难解释(图5(B))。我们同时发现这两个基因簇具有不同的特征基因，合并队列中的大多数CRGs在不同基因簇中差异表达，排除NFE2L2、FDX1和PDHB (图5(D))。NLRP3、SLC31A1、DLD、DLAT、PDHA1、MTF1、GLS、CDKN2A和DLST在基因簇A中高表达，而ATP7B、ATP7A、LIAS、LITP1和DBT在基因簇B中高表达。

3.5. 预后模型的构建及其预后价值

为了进一步研究在不同CRG簇中发现的1578个DEGs的表达水平与临床意义之间的潜在关系，我们将509名BLCA患者随机分为两组：训练数据集(n = 255)和测试数据集(n = 254)。通过卡方检验，我们未发现训练、测试和整个合并数据集中基本临床特征分布的显著差异(p > 0.05)。为了筛选与预后相关的基因，我们首先在训练数据集中进行了单因素Cox回归分析，最终发现1578个基因中997个与BLCA患者的OS显著相关(p < 0.05)。接下来，我们在筛选出的997个基因中逐步进行LASSO回归和多变量Cox比例风险回归分析，以创建预测模型。最终，在铜死亡相关的预后模型中识别出10个独立预后基因。根据上述独立预后基因的表达水平及其多变量Cox分析系数，我们建立了所有基因的特征以评估BLCA患者的风险。预测模型的风险评分公式如下：

在我们建立的相关模型特征中，九个独立预后基因(LRRC59、TMEM109、LDLR、TRIB3、BAIAP2、TPST1、PHGDH、KRT4和CYP1B1)的系数为正，表明它们是BLCA患者的危险因素，并且它们的高表达水平也预示着较差的预后。另一方面，我们可以将具有负系数的APOL6视为保护因素，其高表达将成为BLCA患者更好预后的指标。

我们绘制了Sankey图以展示构建预后模型的过程，并以图形形式呈现个别患者的属性变化(图6(A))。使用Kruskal-Wallis H检验，我们发现不同CRG簇之间的风险评分存在显著差异(图6(B))。相反，我们可以清楚地看到CRG簇A的中位风险评分较高，而CRG簇B的评分较低。有趣的是，基因簇A的中位风险评分也高于基因簇B (图6(C))。结合本研究的前期分析结果，低风险评分可能与预后特征有关。

为了进一步验证我们的想法，我们根据上述公式计算了训练数据集中255名患者的风险评分，以建立预后模型。然后，我们使用训练数据集中1.110的中位风险评分作为切割值，将训练数据集中的患者分为高风险组和低风险组。我们通过Kaplan-Meier生存分析进一步证明高风险组的OS显著低于低风险组(p < 0.01，log-rank检验；图6(D))。在训练数据集中，1年、3年和5年的时间依赖性ROC曲线的AUC值分别为0.842、0.809和0.840 (图6(F))。

为了验证模型的预测性能，我们对测试数据集中的样本(n = 254)进行了相同方法的分析。低风险组的生存时间也显著长于高风险组(p < 0.001，log-rank检验；图6(E))。测试数据集中ROC曲线的AUC值在1年、3年和5年分别为0.675、0.701和0.702 (图6(G))。

我们还绘制了一系列风险图，按风险评分升序排列BLCA患者，包括风险评分的分布、生存状态和独立预后基因的表达。如图7(A)和图7(B)所示，在两个数据集中，我们可以看到低风险组患者的生存时间更长。可以发现，相关风险独立预后基因(LRRC59、TMEM109、LDLR、TRIB3、BAIAP2、TPST1、PHGDH、KRT4和CYP1B1)的表达水平也随着风险评分的增加而上升。然而，保护性独立预后基因APOL6的表达则相反。

Figure 6. Establishment and evaluation of a prognostic model. (A) Sankey diagram demonstrating correlations among CRG clusters, gene clusters and risk score; (B) (C) Differences in the risk score between two CRG clusters and gene clusters in meta-cohort. (p < 0.001, Wilcoxon test); (D) (E) Kaplan-Meier analysis of the training and testing datasets; (F) (G) ROC curves for one-year, three-year and five-year survival prediction in the training and testing dataset

图6. 预后模型的建立和评估。(A) Sankey图展示CRG聚类、基因聚类和风险评分之间的关系；(B) (C) meta-队列中两种CRG聚类和基因聚类间风险评分的差异；(p < 0.001，Wilcoxon检验)。(D) (E) 训练集和测试集的Kaplan-Meier分析。(F) (G) 训练集和测试集中1年、3年和5年生存预测的ROC曲线

这些结果表明，本研究构建的模型对BLCA患者的生存率具有良好的预测价值。为了提高模型的临床适用性，我们还构建了一个包含病理特征和风险评分的预测列线图模型。从列线图中可以明显看出，风险评分是模型的主要预测因子(图7(C)，图7(D))。

Figure 7. Assessment and verification of the prognostic model. (A) (B) Distribution of risk score, survival status, and the expression of independent prognostic genes in the training and testing datasets; (C) Nomogram to predict the 1-year, 3-year, and 5-year OS and PFS rates of BLCA patients; (D) Calibration curve for the OS nomogram model in BLCA. A dashed diagonal line represents the ideal nomogram; (E) Different expressions of cuproptosis-related genes in low- and high-risk groups; (F) The correlation between risk score and infiltration abundance of various immune cells.

图7. 预后模型的评估和验证。(A) (B)训练集和测试集中风险评分、生存状态和独立预后基因表达的分布；(C)预测BLCA患者1年、3年和5年OS (总生存期)和PR (无进展生存期)率的诺模图；(D) BLCA中OS诺模图模型的校准曲线。虚线对角线代表理想的诺模图。(E) 低风险组和高风险组中铜死亡相关基因的不同表达；(F) 风险评分与各种免疫细胞浸润丰度之间的相关性

我们还研究了CRGs表达与预后模型之间的关系。我们惊讶地发现，大多数CRGs在高风险组和低风险组之间的表达存在显著差异，包括NLRP3、SLC31A1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A和DLST (图7(E))。为了进一步研究模型与TME之间的关系，我们还研究了已知免疫细胞浸润与风险评分之间的相关性(图7(F))。如我们所见，巨噬细胞M0、巨噬细胞M2、静息肥大细胞、中性粒细胞和CD4记忆静息T细胞的浸润与风险评分呈正相关，而单核细胞、静息NK细胞、浆细胞、激活CD4 T细胞、CD8 T细胞和调节性T细胞(Tregs)的浸润则与风险评分呈负相关。这些结果与本研究的前期结果一致。

3.6. 癌细胞的化学敏感性

最后，我们想知道我们的预后模型是否能够预测BLCA患者的化疗反应。我们筛选了一些常用的BLCA化疗药物，研究半数抑制浓度(IC50)与风险评分之间的关系。结果发现，低风险组的吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和顺铂的IC50较高，而甲氨蝶呤和丝裂霉素C在同一组中IC50较低(图8(A)~(F))，这一结果可能有助于探索适合高级别低风险BLCA患者的个体化治疗选择。

Figure 8. Relationship between different risk score groups and chemotherapy sensitivity. (A)~(E) Differences in IC50 of chemotherapy drugs between high- and low-risk score groups in the meta-cohort; (A) Gemcitabine (p < 0.001, Wilcoxon test); (B) Paclitaxel (p < 0.001, Wilcoxon test); (C) Cisplatin (p < 0.001, Wilcoxon test); (D) Docetaxel (p < 0.001, Wilcoxon test); (E) Methotrexate (p < 0.001, Wilcoxon test); (F) Mitomycin C (p < 0.001, Wilcoxon test)。

图8. 不同风险评分组与化疗敏感性的关系。(A)~(E) meta-队列中高风险评分组和低风险评分组间化疗药物IC50的差异。(A) 吉西他滨(p < 0.001，Wilcoxon检验)；(B) 紫杉醇(p < 0.001，Wilcoxon检验)；(C) 顺铂(p < 0.001，Wilcoxon检验)；(D) 多西他赛(p < 0.001，Wilcoxon检验)；(E) 甲氨蝶呤(p < 0.001，Wilcoxon检验)；(F) 丝裂霉素C (p < 0.001，Wilcoxon检验)

4. 讨论

我们已经知道，适当浓度的铜参与了许多代谢过程，包括超氧化物肽胺化、分解、儿茶酚胺合成、能量产生、细胞外基质生物合成和铁离子转运，然而，体内过高的铜离子浓度也可能产生一些不良反应。研究表明，体内铜离子的稳态与各种肿瘤的发生发展密切相关，其不平衡诱导的细胞毒性已被证明显著影响癌细胞的生长和增殖速度[18]。进一步研究铜离子积累导致细胞内毒性增加导致铜稳态不平衡的机制将大大有助于我们在临床常规治疗中有效选择性地杀死癌细胞[19]。茨韦特科夫和他的团队在研究中发现，铜离子可以直接与三羧酸(TCA)循环中的脂质酰化蛋白的聚集结合，导致铁硫(Fe-S)簇蛋白的损失，从而增加蛋白质毒性应激，最终导致细胞死亡[20]。这种新的细胞死亡形式最终被他们定义为铜中毒，这与已知的形式有很大不同。我们知道，Fe-S簇蛋白和脂酰化在自然界中广泛而保守地存在。铜离子疗法作为铜中毒引起的细胞毒性的主要靶点，具有这种代谢特征的肿瘤在未来具有非常有前景的临床应用前景。

我们在研究中共纳入19个CRG，最终从合并队列中衍生出17个CRG (包括FDX1、LIPT1、DLD、LIAS、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A、NLRP3、DLST、NFE2L2、SLC31A1、ATP7A、ATP7B和DBT。FDX1基因主要编码一种次要的铁硫蛋白，通过铁还原酶将电子从NADPH转运到线粒体细胞色素P450，据报道这是一种与维生素D、类固醇和胆汁酸代谢密切相关的酶。相关研究进一步发现FDX1可能影响。

通过调节体内代谢活动对肺腺癌预后的影响[21]。脂酰转移酶1 (LIPT1)是一种激活与TCA循环相关的2-酮酸脱氢酶的酶，其缺失会抑制TCA循环[22]。有研究发现，二氢脂胺脱氢酶(DLD)可调节半胱氨酸剥夺诱导的铁凋亡[23]。相关研究发现，FDX1和LIAS表达的丧失可能抑制铜中毒的发生[20]。DLAT的过表达已被报道调节内部碳水化合物代谢，最终促进胃癌细胞增殖[24]。PDHA1和PDHB基因参与糖酵解的调节，其异常表达已被证明与胃癌患者预后不良显著相关[25]-[27]。金属调节转录因子1 (MTF1)广泛存在于真核生物中，其主要作用是保护细胞免受氧化和缺氧应激损伤。它的增加会刺激间充质向上皮的转化[28]。谷氨酰胺酶(GLS)是谷氨酰胺代谢的关键酶，与多种癌症的发生发展有关[29] [30]。CDKN2A位于9p21.3号染色体上，已被报道为肿瘤抑制基因，在抑制肿瘤增殖方面发挥了至关重要的作用[31]。然而，一些研究人员发现，CDKN2A在HCC中的表达明显上调，并被认为与不良预后密切相关[32]。此外，CDKN2A的甲基化水平与内部铜离子代谢有关[33]。几项研究表明，NLRP3 DNA的甲基化可能通过增加NLRP3炎症体相关的神经炎症过程而倾向于某些有机变化[34]。二氢硫磷酰胺琥珀酰转移酶(DLST)是克雷布斯循环中α-酮戊二酸脱氢酶复合物的亚单位酶，在高加索和日本人群中发现了DLST基因多态性与阿尔茨海默病(AD)之间的遗传关联[35]。NFE2L2基因内的变异与CKD (慢性肾脏病)的危险因素之间的关系，如HBP (高血压)和高血糖，已被建议[36]。铜离子进入细胞被认为是通过膜蛋白SLC31A1 (CTR1)发生的，该蛋白已在包括酵母、人类和小鼠在内的各种物种中报道[37]。相关研究报告了ATP7A和ATP7B基因的突变可用于预测铜中毒[38]。而DBT基因的突变可能与MSUD (枫糖浆尿液病)相关[39]。上述相关内容和研究表明，CRG与癌症的发展和预后密切相关。

每年约有50万患者被诊断为膀胱癌，膀胱癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一[40]。虽然膀胱癌现在可以通过手术治疗，但术后患者仍有可能复发并发展转移。顺铂为主的化疗仍被推荐为晚期膀胱癌患者的一线临床治疗，免疫治疗被列为二线治疗。鉴于，由于对膀胱癌起始和进展机制的了解有限，其对化疗和免疫治疗的治疗反应非常有限和异质性[41]。随着基因测序技术的不断完善，从转录组信息中获得的相关基因特征已被应用于预测不同疾病的预后和治疗反应[42]。本研究旨在通过结合两个不同的队列(TCGA-BLCA和GSE13507)全面探索BLCA中是否存在显著的铜死亡介导模式，以扩展癌症样本。

每年约有50万名患者被诊断为膀胱癌，膀胱癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管膀胱癌现在可以通过手术治疗，但术后患者仍可能复发和转移。顺铂化疗仍被推荐作为晚期膀胱癌患者的第一线临床治疗，免疫治疗被列为二线治疗。然而，由于对膀胱癌发病和进展机制的了解有限，其对化疗和免疫治疗的治疗反应非常有限且异质。随着基因测序技术的不断提高，从转录组信息中获得的相关基因特征已被应用于预测不同疾病的预后和治疗反应。本研究旨在通过结合两个不同的队列(TCGA-BLCA和GSE13507)全面探索BLCA中是否存在显著的铜死亡介导模式，以扩展癌症样本。尽管在我们的研究中，由于不同的测序平台，我们最终仅提取了17个CRGs进行进一步研究，但基于这些交叉基因的深入分析充分证实了BLCA中确实存在不同的铜死亡介导模式。通过量化这些模式，我们发现它们在预测BLCA的多组学特征和化疗反应方面显示出良好的应用前景。

总体而言，本研究发现了两种不同的CRG簇，其中CRG簇B在两个CRG簇中均表现出更好的生存结果。GSVA显示CRG簇B显著富集于脂质代谢活动，包括花生四烯酸代谢和亚油酸代谢。使用ssGSEA，我们发现CRG簇B显著增加了先天免疫细胞的浸润，包括CD56 dim自然杀伤细胞、17型T辅助细胞和单核细胞。结合之前的研究，我们推测CRG簇B中的脂质代谢增强，增加了过氧化物产品的积累，使肿瘤细胞对铜死亡敏感，从而通过激活先天免疫系统抑制肿瘤增殖，表现出更好的预后[43] [44]。

在本研究中，CNV分析揭示CRGs的CNV发生显著更频繁，并且肿瘤与正常组织之间存在显著差异，表明铜死亡介导模式在BLCA的发生中起着关键作用。此外，CRGs也与BLCA的分级和分期相关。因此，将这两个CRG簇转换为不同的基因簇是必要的，以测试铜死亡在合并队列中的重要性。因此，从CRG簇中的DEGs开发了两个不同的基因簇。在本研究中，首次基于10个独立预后基因构建了与铜死亡相关的BLCA预后模型，并验证了该模型在预测BLCA患者生存中的价值。我们的研究结果表明，铜死亡在BLCA的发生和发展中发挥了关键作用，并可能成为未来临床工作中从遗传角度评估患者预后的重要工具。

当然，我们的研究也存在一些局限性。首先，我们仅使用公共数据(包括GEO和TCGA)分析BLCA中的铜死亡介导模式。需要使用多中心队列进行外部验证，以验证不同的铜死亡介导模式。其次，我们在合并队列中提取了17个CRGs，但由于两个队列来自不同平台，可能会忽略其他具有潜在研究价值的基因。第三，本研究仍需进一步的体外实验验证和前瞻性临床研究。然而，我们的分析证明了BLCA中确实存在不同的铜死亡介导模式，并且对这些模式的量化在预测BLCA的多组学特征方面显示出良好的前景。此外，进一步研究CRGs调节BLCA发生和发展的机制将有助于克服其相关的治疗抵抗。

5. 结论

我们的研究调查了BLCA中的不同铜死亡介导模式。这些不同模式的评估将有助于提高我们对与BLCA发生和发展相关机制的理解，并进一步为临床治疗提供相关指导。我们还为探索BLCA治疗的新组合药物策略提供了新的前景。

NOTES

^*通讯作者。