1. 引言
胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率[1]。在我国，胃癌的发病率和死亡率均居世界前列，占全球胃癌病例的近一半。由于胃癌早期症状隐匿，且缺乏高效普适的筛查手段，大多数患者确诊时已处于进展期或晚期，这严重限制了治疗效果[2]。因此，如何提高胃癌患者的治疗效果和生存率仍是临床亟待解决的问题。
目前，手术联合化疗是进展期胃癌的主要治疗手段，而化疗耐药已成为胃癌治疗失败的重要原因之一。化疗耐药的发生显著限制了化疗药物的疗效，导致患者出现术后复发和远处转移，从而显著缩短生存期。胃癌化疗耐药的发生机制复杂，涉及药物外排、细胞凋亡抑制、DNA损伤修复等多方面，同时与肿瘤代谢重编程密切相关[3] [4]。近年来，代谢重编程逐渐被认为是肿瘤细胞适应恶劣环境、维持增殖和存活的核心机制，其中嘌呤代谢通路作为肿瘤代谢的重要组成部分，受到越来越多的关注[5]。
嘌呤是核酸合成和能量代谢的重要分子，为肿瘤细胞的快速生长和增殖提供必需的代谢底物。嘌呤代谢通路的活性在多种肿瘤中显著增强，促进了肿瘤细胞对外界环境的适应能力和抗药性[6]-[9]。然而，目前关于嘌呤代谢通路在胃癌化疗耐药中的具体作用尚不明确。深入探讨嘌呤代谢通路在胃癌化疗耐药中的机制，有望为克服化疗耐药提供新的理论依据，并为胃癌的精准治疗提供潜在靶点。
基于此，本研究通过生物信息学方法，从公开数据库中筛选胃癌化疗耐药相关的关键基因，探讨嘌呤代谢通路在胃癌化疗耐药中的作用，并结合临床数据评估其在患者预后中的意义。研究结果将为胃癌化疗耐药的分子机制研究提供新线索，并为临床抗耐药治疗提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 数据获取与预处理
从基因表达汇编数据库(Gene Expression Omnibus, GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中获取胃癌相关数据集GSE14209，该数据集包含化疗耐药组与敏感组的基因表达数据。利用R软件中的“limma”包对数据进行标准化处理，并筛选化疗耐药组与敏感组之间的差异表达基因。筛选标准设定为Fold Change (FC) > 1.3，p < 0.05，以确保筛选出的差异基因具有统计学意义和生物学意义。
2.2. 基因功能与通路分析
对筛选出的差异表达基因进行基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)，用于比较化疗耐药组与敏感组之间的通路差异。特别关注代谢相关通路，重点分析嘌呤代谢通路的活性变化，筛选出可能在化疗耐药过程中发挥关键作用的基因。
2.3. 关键基因的表达验证与功能分析
结合癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas, TCGA, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)验证筛选出的关键基因IMPDH2和ITPA的表达水平，分析其在胃癌组织与正常组织中的差异表达情况。通过GO功能富集分析(Gene Ontology, GO)，探索IMPDH2表达相关基因的功能，重点关注其在核糖体功能调控中的潜在作用。
2.4. 调控机制的探索
采用京都基因与基因组百科全书通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)和基因标志通路富集分析(Hallmark Pathway Enrichment Analysis)，研究关键基因IMPDH2在嘌呤代谢通路中的功能角色。同时结合文献分析[10]-[13]，推测c-Myc可能作为IMPDH2的上游转录因子，并进一步验证KRAS通过MAPK通路调控c-Myc的可能性[14]，从而形成c-Myc-IMPDH2-KRAS闭环调控机制。
2.5. 预后模型的构建与评估
利用最小绝对收缩与选择算子回归(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, Lasso)分析，筛选与IMPDH2显著相关的76个预后基因。基于这些基因构建胃癌预后模型，并通过受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC)和风险评分验证模型的预测能力，评估其在预测胃癌患者5年生存率和无病生存率中的临床应用价值。
2.6. 体外实验验证
为验证生物信息学分析结果，本研究从24名胃癌患者中收集了肿瘤标本，包括化疗耐药组和化疗敏感组各12名患者。所有患者在治疗前均通过临床影像学检查(如CT、MRI、内镜)和病理学检查确认胃癌的诊断，并且根据疗效评估标准(RECIST标准)被分为化疗耐药组和化疗敏感组。
RT-qPCR：提取细胞总RNA，反转录为cDNA，使用SYBR Green法检测IMPDH2 mRNA表达水平，以GAPDH为内参。
免疫荧光染色：细胞固定后，用抗IMPDH2一抗(1:200)及Alexa Fluor 488标记二抗染色，DAPI复染细胞核。荧光显微镜下观察IMPDH2亚细胞定位，ImageJ软件定量阳性细胞比例。
3. 结果
3.1. 差异表达基因的筛选
通过对GSE14209数据集的分析，筛选出化疗耐药组与敏感组之间显著差异的161个基因，其中85个基因上调，76个基因下调(筛选标准为Fold Change > 1.3, p < 0.05)。进一步通过基因集合富集分析(GSEA)发现，嘌呤代谢通路在化疗耐药组中显著上调(p < 0.01)。随后，将差异基因与嘌呤代谢通路基因集取交集，筛选出IMPDH2和ITPA两个交集基因(如图1)。
(a)
(b)
(c)
图注：(a) 差异表达基因火山图和热图。上调的基因(红色)和下调的基因(蓝色)在统计学上具有显著差异(p < 0.05, FC > 1.3)；(b) GSEA分析结果，嘌呤代谢通路在化疗耐药组中显著富集(p < 0.01，FDR < 0.25)；(c) Venn图，差异表达基因(蓝色)与嘌呤代谢相关基因集(红色)有2个交集：IMPDH2和ITPA。
Figure 1. Screening of differentially expressed genes
图1. 差异表达基因的筛选
3.2. 关键基因的相关性验证
通过Spearman相关性分析，进一步验证了IMPDH2与嘌呤代谢通路活性的关系。结果表明，IMPDH2的表达水平与嘌呤代谢通路的活性高度相关(p < 0.01)。进一步分析表明，IMPDH2可能是化疗耐药中代谢重编程的核心参与者(如图2)。
图注：(a) ITPA表达(Log2(TPM+1))与嘌呤代谢活性之间的相关性(Spearman’s ρ = −0.11, p = 0.041)；(b) IMPDH2表达(Log₂(TPM+1))与嘌呤代谢活性之间的相关性(Spearman’s ρ = 0.25, p = 6.45e−07)。
Figure 2. Correlation analysis of differentially expressed genes and purine pathway
图2. 差异表达基因的与嘌呤通路相关性分析
3.3. IMPDH2在胃癌中的表达与功能分析
在TCGA数据库中分析IMPDH2的表达水平，结果显示IMPDH2在胃癌组织中的表达显著高于正常组织(p < 0.001)。进一步通过GO功能富集分析发现，与IMPDH2表达相关的基因集主要参与核糖体功能，提示IMPDH2可能通过核糖体功能调控胃癌细胞的代谢活动(如图3)。此外，IMPDH2的高表达与化疗耐药组相关，提示其可能与化疗耐药密切相关。
(a) (b)
(c)
图注：(a) IMPDH2在正常组织与肿瘤组织中的表达差异，结果显示肿瘤组织中的IMPDH2表达显著高于正常组织(p < 0.001)；(b) IMPDH2在正常组织和肿瘤组织中的配对表达差异，肿瘤组织中的IMPDH2表达水平显著高于配对的正常组织(p < 0.01)；(c) GO富集分析结果，展示了与差异表达基因相关的生物学过程(BP，蓝色)、细胞组成(CC，红色)和分子功能(MF，橙色)。
Figure 3. Expression and functional analysis of IMPDH2 in gastric cancer
图3. IMPDH2在胃癌中的表达与功能分析
3.4. IMPDH2的调控机制分析
通过KEGG通路分析进一步验证了IMPDH2相关基因的功能，结果显示这些基因能够显著反映嘌呤代谢通路的活性变化。同时，Hallmark通路分析提示c-Myc可能作为IMPDH2的上游调控因子，通过转录调控其表达水平(如图4)。此外，结合文献分析发现，KRAS可能通过MAPK通路激活c-Myc表达[13]，从而间接上调IMPDH2的表达，最终形成闭环调控机制(如图5)。
3.5. 预后模型的构建与验证
通过Lasso回归分析，筛选出与IMPDH2显著相关的76个预后基因，构建了胃癌预后模型。验证结果表明，该模型在预测胃癌患者5年总生存率(OS)和无病生存率(DFS)方面具有显著效果(p < 0.01)。Kaplan-Meier生存曲线显示，高风险组患者的生存率显著低于低风险组，表明模型能够有效区分不同风险的患者群体。
(a) (b)
图注：(a) KEGG通路富集分析，嘌呤代谢通路(红色)和细胞因子受体相互作用通路(蓝色)在分析中显示显著富集(p < 0.01, FDR < 0.25)；(b) Hallmark基因集富集分析，KRAS信号通路(红色)和MYC靶基因集(蓝色)在数据集中显著富集(p < 0.01, FDR < 0.25)。
Figure 4. Regulatory mechanism analysis of IMPDH2
图4. IMPDH2的调控机制分析
图注：IMPDH2通过促进GTP合成，激活KRAS信号通路，进一步通过MAPK通路增强c-Myc的表达，c-Myc作为转录因子能够结合到IMPDH2基因的启动子区域，直接促进其转录表达，从而形成闭环。同时，GTP水平的增加使肿瘤细胞对化疗等外源性压力更有抵抗力。
Figure 5. Schematic diagram of the feedback regulatory mechanism
图5. 闭环调控机制示意图
模型的ROC曲线表现优异，1年、3年和5年AUC均超过0.7，证明了其较高的预测稳定性和准确性。特别是在化疗患者中，该模型对总生存率的预测效果更为突出，提示IMPDH2及其相关基因可能与化疗敏感性密切相关。总之，该模型为胃癌患者的风险分层和治疗决策提供了重要参考，也为IMPDH2在化疗耐药中的作用研究奠定了基础(如图6)。
(a) (b)
(c) (d)
图注：(a)~(d)分别为群体总体生存(OS)模型、群体无病生存(DFS)模型、化疗总体生存(OS)模型以及化疗无病生存(DFS)模型。Kaplan-Meier生存曲线展示了高风险组与低风险组在各模型中的生存差异((a)~(d) Log-rank p依次为2.88e−09、6.63e−06、7.53e−05、0.0167)；ROC曲线展示了各模型在预测中的表现(群体OS中1年、3年、5年的AUC分别为0.684、0.702、0.681；群体DFS中1年、3年、5年的AUC分别为0.808、0.861、0.917，化疗OS中1年、3年、5年的AUC分别为0.758、0.758、0.866，化疗DFS中1年、3年、5年的AUC分别为0.719、0.624、0.786)
Figure 6. Prognostic model of gastric cancer patients
图6. 胃癌患者预后模型
3.6. IMPDH2在化疗耐药组中的表达验证
RT-qPCR结果显示，化疗耐药(AR)组中IMPDH2 mRNA表达水平显著高于化疗敏感(Res)组(p < 0.0001，图7(a))。免疫荧光染色进一步显示，AR组细胞中IMPDH2蛋白在胞质中呈弥漫性高表达，且阳性细胞比例显著增加(p < 0.05，图7(b)，图7(c))。Res组细胞形态呈高分化状态，而AR组细胞表现为低分化特征，提示IMPDH2高表达与肿瘤恶性表型相关。
(a) (b)
(c)
图注：(a) RT-PCR结果，展示了化疗敏感组(Res)与化疗耐药组(AR)中IMPDH2 mRNA的相对表达水平，结果显示AR组的IMPDH2表达显著高于Res组(p < 0.0001)；(b) 免疫荧光图，显示IMPDH2在Res组细胞和AR组细胞中的分布情况，且可以看出Res组细胞呈高分化，而AR组为低分化；(c) 免疫荧光定量结果，展示了AR组中IMPDH2阳性细胞的比例显著高于Res组(p < 0.05)。
Figure 7. Differential expression of IMPDH2 in Res and AR groups
图7. IMPDH2在化疗耐药和化疗敏感组中的表达差异
4. 讨论
IMPDH2与化疗耐药的关系早在2005年就有研究报道，Silvia Peñuelas等[15] [16]的研究揭示了IMPDH2在红白血病和结肠癌化疗耐药中发挥的关键作用。随后，Liu Hong等[17]研究进一步显示，抑制IMPDH2的活性可以通过降低胃癌细胞对甲氨蝶呤的耐药性，使其对药物重新敏感。随着研究的深入，IMPDH2作为癌症预后标志物和治疗靶点的潜力逐渐被揭示，提示其在多种癌症具有重要的治疗潜力[18] [19]，但对于其作用机制研究尚且不足。
本研究通过对胃癌化疗耐药机制的生物信息学分析，揭示了嘌呤代谢关键酶IMPDH2在化疗耐药中的重要作用，并提出了可能存在的c-Myc-IMPDH2-KRAS闭环调控机制。首先，IMPDH2作为嘌呤代谢通路的关键限速酶，其高表达不仅显著增强了耐药组中嘌呤代谢通路的活性，也为化疗耐药肿瘤细胞提供了充足的核酸合成和能量支持[20]。嘌呤代谢重编程是肿瘤细胞应对化疗压力的重要策略[4]，IMPDH2的上调可能帮助肿瘤细胞通过增加鸟苷三磷酸(GTP)供给，维持代谢需求[21]。
进一步的分析表明，IMPDH2的表达可能受到c-Myc的直接调控。c-Myc能够结合到IMPDH2基因的启动子区域，直接促进其转录表达，并通过体外和体内实验证实了其对肿瘤生长的促进作用[10]。此外，KRAS可通过MAPK通路上调c-Myc的活性和表达。KRAS突变(如G12D)是多种癌症(尤其是胰腺癌)的关键驱动因素，KRAS突变导致其持续激活，进而通过RAF-MEK-ERK信号级联磷酸化下游转录因子(如Elk-1)，促进c-Myc的转录表达。此外，ERK还可通过磷酸化c-Myc蛋白增强其稳定性[14]。
结合本研究的结果，推测可能存在c-Myc-IMPDH2-KRAS的闭环调控机制。通过这一闭环调控机制，IMPDH2在嘌呤代谢中的活性进一步增强，而嘌呤代谢的产物GTP又可能反过来调控KRAS的活性[22]，从而形成代谢与信号传导相互强化的正反馈。这一机制为理解胃癌化疗耐药的发展提供了新的理论基础，同时也为潜在靶点的开发提供了研究方向。即便如此，已有研究仍然很难将上述闭环调控机制与化疗耐药构建起直接联系，但是在《Cancer Discovery》新发表的文献中[23]，直接阐明了三磷酸鸟苷(GTP)水平与癌细胞放化疗等外源性压力的相关性：细胞中GTP水平的增加使它们对化疗等外源性压力更有抵抗力，而GTP水平降低使细胞更敏感。然而，由于本研究主要基于生物信息学分析，仍需通过体外和体内实验进一步验证这一闭环调控机制的具体作用和功能。
本研究基于IMPDH2相关基因构建了一个预后模型，结果表明该模型可以较为准确地预测胃癌患者的5年生存率和无病生存率。特别是在化疗患者中，该模型的预测效果更加突出，提示IMPDH2及其相关基因的表达水平可能与患者对化疗的敏感性以及肿瘤的侵袭性有关。这个预后模型为胃癌患者的风险分层和治疗决策提供了有力支持，具有一定的临床应用潜力。但要确保该模型在实际应用中的可靠性，还需要通过更大规模的多中心研究进行进一步验证。
与已有研究相比，本研究不仅进一步明确了IMPDH2在胃癌中的作用，还提出了与c-Myc和KRAS相关的调控机制，为化疗耐药的代谢重编程提供了新的视角。IMPDH2不仅在嘌呤代谢通路中发挥重要作用，还可能作为代谢和信号调控的核心节点，参与其他代谢通路的重编程[24] [25]。未来研究应进一步探讨IMPDH2与其他代谢通路的相互关系，并结合药物筛选，评估IMPDH2及其调控网络在靶向治疗中的潜力。
创新性方面，正如前文所言：尽管已有研究报道c-Myc、KRAS与IMPDH2之间的关联，但并未将其与胃癌化疗耐药联系起来。本研究通过研究IMPDH2在嘌呤代谢中的作用，并联系GTP和化疗耐药新的研究成果，首次在胃癌化疗耐药背景下揭示了三者的闭环调控机制，并通过实验验证其临床相关性，基于IMPDH2构建的预后模型在预测化疗患者生存率方面表现优异(AUC > 0.7)，凸显了其转化潜力。未来可通过靶向IMPDH2或其上游调控因子(如c-Myc抑制剂JQ1或KRAS抑制剂Adagrasib)逆转化疗耐药，为胃癌精准治疗提供新策略。本研究的局限性在于尚未开展体内实验(如小鼠移植瘤模型)验证IMPDH2的促耐药作用。此外，闭环调控机制中GTP对KRAS的反馈激活需进一步通过代谢组学验证。尽管如此，通过整合生物信息学分析与体外实验，我们首次揭示了IMPDH2在胃癌化疗耐药中的核心地位及c-Myc-KRAS-IMPDH2调控网络的存在，为深化对代谢重编程驱动耐药的理解和开发靶向IMPDH2的联合疗法提供了理论支撑。
5. 结语
总体而言，本研究揭示了IMPDH2在胃癌化疗耐药中的关键作用，并为其作为潜在靶点提供了理论依据。IMPDH2及其调控网络不仅可能为胃癌精准治疗提供新方向，也为解决化疗耐药问题提供了新思路。
NOTES
*通讯作者。