摘要: 目的：由连梅汤(LMD)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠回肠屏障及肝肺损伤的保护作用的研究。方法：采用随机方式，将C57/6J雄性小鼠分为对照组(CON组)、LPS模型组(LPS组)和连梅汤治疗组(LMD组)，每组各6只。适应性喂养7天后，分别经口给予生理盐水与治疗剂量的连梅汤(LMD) 21天。第22天，PBS注入对照组腹腔，另两组LPS注入5 mg/kg腹腔，建立脓毒症模型小鼠。腹腔注射24小时后进行回肠和肝、肺组织的收集。用HE染色组织病理鉴定；通过RT-qPCR检测回肠屏障因子水平(ZO-1, Occludin)和肝肺组织炎性因子(IL-1
α, IL-8, TNF-
α)。结果LPS组与CON相比，体重下降明显(n = 6; P < 0.0001)，小鼠临床评分大幅提高(n = 6; P < 0.0001)。与LPS组相比，LMD可显著提高回肠屏障因子ZO-1、Occludin的表达(n = 6; P < 0.0001)，下调肝、肺组织的促炎因子(IL-1
β、IL-8、TNF-
α)水平(n = 6; P < 0.05)，减轻肝、肺组织的病理损伤。结论：连梅汤能有效改善LPS诱导的脓毒症小鼠回肠屏障损伤和肝、肺损伤及炎症失衡。
Abstract: Objective: The protective effect of Lianmei Decoction on the intestine was studied to the intestinal barrier, liver, and lung damage caused by lipopolysaccharide (LPS) in septic mice. Methods: C57/6J male mice were randomly assigned to the control group (CON group), LPS model group (LPS group), and Lianmei Decoction treatment group (LMD group), with 6 mice in each group. After 7 days of adaptive feeding, normal saline and a therapeutic dose of LMD were given orally for 21 days. In the 22 days of the study, PBS was injected intraperitoneally into the CON group, and 5 mg/kg LPS was administered intraperitoneally to the remaining two groups to create a sepsis mouse model. Ileum, liver, and lung tissues were gathered 24 hours after intraperitoneal injection. Histopathological examination was done using HE staining; the amounts of ileal barrier factors (ZO-1, Occludin) and inflammatory factors (IL-1β, IL-8, TNF-α) in liver and lung tissues were detected by RT-qPCR. Results: Compared with the CON group, the body weight of the LPS group decreased dramatically (n = 6; P < 0.0001), and the clinical score of mice was considerably raised (n = 6; P < 0.0001). Compared with the LPS group, LMD significantly increased the expression of ileal intestinal barrier factors ZO-1 and Occludin (n = 6; P < 0.0001), down-regulated the levels of pro-inflammatory factors (IL-1β, IL-8, TNF-a) in liver and lung tissues (n = 6; P < 0.05), reduce the pathological damage of liver and pulmonary tissue. Conclusion: Lianmei Decoction can effectively improve ileal barrier damage, liver and lung injury, and inflammatory imbalance in LPS-induced sepsis mice.
1. 引言
脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起[1]。脓毒症的免疫反应过度激活，从而引发危及生命的全身炎症反应(SIRS)感染，可能导致器官衰竭和死亡[2] [3]。其是重症监护室(ICU)最常见的死亡原因，多脏器功能障碍和最终衰竭是脓毒症的特征[4] [5]。有研究表明，对于随访期间的粗死亡率脓毒症患者明显高于非脓毒症患者。且在观察期间，脓毒症患者的感染性死亡风险持续增加[6]。然而，脓毒症的发病机制目前还不完全清楚，临床上尚未有理想的治疗方法。因此，研制防治脓毒症的药物，对研究脓毒症的发病机理具有十分重要的意义。
脓毒症属中医“温病”范畴，根据其临床表现而定。中医积累了丰富的感染性疾病治疗经验，总结出完整的防治方法，如东汉张仲景于公元25~220年所著《伤寒论》、清吴鞠通于公元1798年所著《温病条辩》等，记载了治疗感染性疾病的方法及方剂配方，应用至今[7] [8]。其中，连梅汤(LMD)出自吴鞠通《温病条辨·下焦》，由黄连、乌梅、生地黄、麦冬、阿胶这五味药组成[9]。外感急性热病(暑温、春温、湿温)的中后期，发生发热不退、麻痹、甚至昏迷的时候适用连梅汤治疗。但目前对连梅汤药用价值的研究较少，对其功效的研究尚无系统、科学的研究报道。本文研究了连梅汤(LMD)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠的保护作用。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
本次实验选用18只7周龄(19~21 g)的SPF级C57/6J雄性小鼠；由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK(湘)2019-0004；质量合格证号：430727230100805565)，饲养于重庆医科大学动物中心SPF级动物代养室，温度22℃~24℃，湿度50%~60%，12 h明暗循环(动物伦理审查批号：IACUC-CQMU-2023-09035)。
2.2. 实验药物
连梅汤(LMD)包含的所有中草药均购自重庆市中医院(中国重庆)。所有中草药均由白群华教授(重庆医科大学，中国重庆)鉴定。根据中药煎煮标准方法制备连梅汤(LMD)。药材酒连黄(9 g)、乌梅(15 g)、麦冬(12 g)、生地黄(20 g)加入1 L水中浸泡60分钟，大火煮沸5 min后调至文火熬煮30 min，得到第一个汤剂。加入1 L水大火煮沸5 min，文火30 min，重复两次获得煎剂。最后，将三次汤剂混合，离心(12000 r，15 min)，过滤后，于旋转蒸发仪浓缩药液，浓缩后加入隔水加热的阿胶定量为100 ml/剂，于4℃冰箱保存备用。
2.3. 主要试剂与仪器
LPS (Sigma，美国，批号：L2630)。多聚甲醛(成都市科龙化工试剂厂)；氯仿(重庆川东化工有限公司)；异丙醇(重庆川东化工有限公司)；无水乙醇(重庆川东化工有限公司)；TRIzol Reagent (GLpBio，美国)；PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa，日本)；TB Green Premix Ex TaqTM II (TaKaRa，日本)；旋转蒸发浓缩仪(上海亚荣生化仪器厂)；CFX ConnectTM Real-Time PCR仪(Bio-Rad，美国)；T100TMThermoCycle PCR仪(Bio-Rad，美国)。
2.4. 方法
2.4.1. 动物实验设计
将雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，随机分成3组(n = 6)：对照组(CON组)、LPS模型组(LPS组)、连梅汤治疗组(LMD组)。根据临床患者(60 kg)每日一剂的中药剂量，换算为小鼠剂量，综合前期预实验结果以0.5倍剂量作为灌胃剂量。LMD组给予二十一天的药物预处理，每天一次，CON组和LPS组小鼠给予等体积磷酸缓冲液(PBS)；于第二十一天，给予药物一次后一小时，除对照组腹腔注射PBS，其余2组腹腔注射LPS (5 mg/kg)，造模24小时后实施安乐死。
2.4.2. 小鼠临床评分
小鼠的临床评分标准见表1 [10]。
2.4.3. 组织病理学
收集小鼠回肠、肝脏和肺组织，置于4%多聚甲醛中固定。石蜡经过脱水、切片等处理后，再进行包覆。苏木精–伊红染色在显微镜下对回肠、肝、肺组织进行病理观察。
2.4.4. 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)
RT-qPCR法检测回肠、肝、肺组织中ZO-1、Occludin、IL-1β、IL-8和TNF-α在mRNA上的表达水平。所使用的引物序列见表2。
2.4.5. 统计学方法
运用GraphPad Prism 9.5.0、SPSS 26软件进行作图和分析，采用方差分析、秩合检验等方法进行统计学分析，当P < 0.05时认为具有统计学意义。
Table 1. Clinical scoring criteria for mice
表1. 小鼠临床评分标准
得分 |
外观 |
意识水平 |
活动 |
对刺激的反应 |
眼睛 |
0 |
被毛光滑 |
小鼠活动 |
正常活动量。老鼠是任何一种：吃，喝，爬，跑，打架 |
小鼠对听觉刺激或触觉立刻作出反应 |
睁眼 |
1 |
部分头发竖立 |
鼠标是活跃的，
但避免直立 |
轻微抑制活性。
老鼠在笼子的
底部移动 |
对听觉刺激反应缓慢或无反应；强烈的触碰反应(逃离动作) |
眼睛可能有分泌物，且没有完全睁开 |
2 |
背部大多数毛发
竖着的 |
小鼠活动明显减慢。老鼠还在走动。 |
抑制活动。老鼠偶尔做一些运动或静止
不动 |
对听觉刺激无反应；对触摸的中度反应(移动几步) |
眼睛可能有分泌物且至少半闭 |
3 |
可能存在毛发竖立，小鼠出现“浮肿” |
活动受损。老鼠只有被激怒时才会动，一动就会发抖 |
没有活动。
鼠是静止的 |
对听觉刺激无反应；触摸反应轻微(无移动) |
眼睛半闭或以上，可能有分泌物 |
4 |
可能存在毛发竖立，小鼠出现消瘦 |
活动严重受损。老鼠被激怒时保持静止，可能会颤抖 |
不活动。正在经历颤抖，特别是在后腿上 |
对听觉刺激无反应。对触摸很少或没有反应。如果被推倒不能恢复 |
眼睛闭上或乳白色 |
Table 2. Primer sequence of the target gene
表2. 靶基因引物序列
Gene |
Primer sequence (Forward) |
Primer sequence (Reverse) |
GAPDH |
TGGCCTTCCGTGTTCCTAC |
GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA |
Occludin |
AGCACTTAACCTGCCTGGAT |
AGCCTGTGGAAGCAAGAGAT |
ZO-1 |
TCTTGCTGGCCCTAAACCTG |
GTTGGGCTGGCTCTGAGAAT |
IL-1β |
GAAATGCCACCTTTTGACAGTG |
TGGATGCTCTCATCAGGACAG |
IL-8 |
TTGTCAGCAAGGAGTTCT |
TAGAGGGTAGTAGAGGTGTT |
TNF-α |
CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA |
TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC |
3. 结果
3.1. 小鼠一般情况、小鼠临床评分
实验处理从适应性喂养一周后开始，每组6只老鼠被随机分成3组。实验处理记录了如图1所示的老鼠每天体重变化的全过程。用药3周后给小鼠腹腔注射LPS (5 mg/kg)，并在0 h、2 h、6 h、12 h、24 h分别对小鼠进行行为学评分，如图2所示。在小鼠未造模期间，小鼠身体健康，性格活泼，毛发柔顺光滑，大小便都是正常的。CON组与LPS组体重呈稳定增长，LMD组体重涨幅不大。小鼠在腹腔内注射24 h后，体重下降明显，LPS组的减重幅度也比较大。评分结果显示，造模后各组小鼠评分均在2 h升高，小鼠开始出现，部分头发竖立，小鼠活跃水平受限。随后在6 h时评分进一步升高，其中LPS组峰值达7分，炎症情况高于LMD组。12 h时，小鼠评分放缓，与6 h相比，稍有加重，说明炎症水平在6 h时达到一次高峰。24 h时，小鼠评分再次大幅上升，峰值LPS组高达14分，小鼠体型消瘦，活动受损，仅在激惹时活动，偶尔会做一些研究性运动，对触觉中度反应，至少半闭眼，伴有白色分泌物。LMD组的评分与LPS组相比明显降低，连梅汤能有效对抗脓毒症的发生与发展。
Figure 1. Weight changes of mice (
± s, n = 6)
图1. 小鼠体重变化(
± s, n = 6)
Figure 2. Clinical score of mice
图2. 小鼠临床评分
3.2. 肝、肺组织病理学变化
HE染色的组织学检查结果详见图3。结构正常、无明显病理变化的CON组其肝组织细胞排列整齐；LPS组的肝脏小叶区有较多的肝脏细胞炎性细胞和肿胀，结构破坏，排列紊乱。与LPS组相比，LMD组的肝细胞炎性细胞浸润较少，且排列更为规整。CON组织结构完整，未见肺泡萎缩，肺泡壁增厚，炎性细胞浸润明显。然而，LPS组观察到肺泡结构受到破坏，发生了肺泡萎缩，肺泡壁增厚，并且在肺间质中可以看到炎性细胞的浸润。LMD组肺组织的病理变化比LPS组明显好转。
3.3. 肠道屏障
用RT-qPCR技术对小鼠回肠组织紧密连接蛋白因子ZO-1、Occludin含量水平进行检测。LPS诱导的脓毒症可能会影响肠组织紧密连接蛋白的表达，而紧密连接蛋白是组成肠道上皮细胞紧密连接结构的重要成分之一，肠道屏障功能的破坏可能是因为其表达的缺失。ZO-1和Occludin在LPS组的小鼠回肠中的表达水平明显低于LMD组的表达水平(n = 6; P < 0.0001)。结果表明，连梅汤可缓解紧密蛋白缺失情况，提高表达水平(见图4)。
Figure 3. HE staining of liver and lung tissue sections (× 200). (A)-(C): HE staining of liver tissue sections; (D)-(F): HE staining of lung tissue sections; (A), (D): CON group; (B), (E): LPS group; (C), (F): LMD group
图3. 肝、肺组织切片HE染色(× 200)。(A)-(C)：肝组织切片HE染色；(D)-(F)：肺组织切片HE染色；(A)、(D)：CON组；(B)、(E)：LPS组；(C)、(F)：LMD组
Figure 4. mRNA expression of tight junction protein in the intestines of each group of mice
图4. 各组小鼠肠道紧密连接蛋白mRNA表达
3.4. LMD对肝脏炎症因子表达的影响
采用RT-qPCR方法检测小鼠肝脏组织炎症因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)的水平，探讨LMD预处理对小鼠肝脏组织炎症的作用。结果表明，LPS组小鼠肝脏组织炎症水平显著高于CON组(n = 6; P < 0.05)，而LMD有效抑制炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表达(n = 6; P < 0.05)，且LMD抑制TNF-α的表达效果最为显著(n = 6; P < 0.001) (见图5)。
Figure 5. Expression of inflammatory cytokines in liver
图5. 肝脏炎症细胞因子表达情况
3.5. LMD对肺组织炎症因子表达的影响
检测结果显示，腹腔注射LPS后显著上调了炎症细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表达(n = 6; P < 0.05)，而LMD给药显著降低了炎症因子的mRNA水平(n = 6; P < 0.05) (见图6)。以上结果显示，对LPS刺激的肺组织炎性因子释放的抑制，LMD具有显著的效果。
Figure 6. Expression of inflammatory cytokines in the lung
图6. 肺炎症细胞因子表达情况
4. 讨论
脓毒症是宿主在感染细菌、病毒等致病微生物后，常继发于创伤、烧伤和感染、休克等情况下引起的全身性炎性反应综合征，发病率和病死率一直居高不下，对人体健康的影响越来越严重[11] [12]。宿主感染细菌、病毒等致病微生物的病理机制复杂，其中不可控炎症反应是其重要的病理生理机制之一。全身性炎症反应产生的大量炎性介质不断累积可引起全身多系统、多器官的严重损伤[13]。脓毒症属于中医“温毒”、“温病”范畴，其发生发展过程涉及全身炎症及免疫反应的多种因素。其中以肠为中枢器官参与脓毒症并加重脓毒症，被认为是全身炎症反应的“引擎”；在脓毒症的发生发展过程中，肝脏是最容易受到损害的器官；急性肺损伤是脓毒症病人器官功能紊乱、死亡的独立危险因素[14]-[17]。因此具有多种生物活性物质和多个靶器官的中药复方被广泛用于预防和治疗脓毒症。
多种因素均可引起脓毒症，包括革兰阴性菌外膜的主要分子脂多糖(LPS)。由于大量的促炎细胞因子释放，脂多糖的释放通常伴随着失控的炎症反应，进而引起全身性炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) [18]。在研究中建立了脓毒症小鼠模型，通过测量小鼠的临床评分来评估小鼠的健康状况，采用腹腔注射LPS的方法。小鼠在腹腔注射LPS后表现出疾病的迹象，包括体重下降、嗜睡和整体行为不佳[19]。这些症状表明LPS引发的免疫反应，包括炎症、发烧以及一系列行为和生理变化。而预灌胃连梅汤小鼠的健康状况有所改善，这表明连梅汤可能是一种抑制LPS不良反应的潜在药物。我们的动物实验结果为连梅汤的潜在健康益处提供了有价值的见解。
《温病条辩》是一部记载呼吸道急性传染性疾病防治方法的典籍，连梅汤出自于此。连梅汤用于疾病加重，并出现严重口渴、手足麻痹的时候。有研究发现，连梅汤可用于治疗细菌性痢疾[20]、糖尿病及周围神经病变[21]-[24]、月经病[25]等。但目前对连梅汤治疗机理研究较少，我们的研究发现，其对促炎因素LPS激发的肠屏障损伤及各器官的炎症反应发生有非常良好的抑制作用。
人体内最大的内毒素储存库是肠道。研究显示，严重的肠道损伤后的应激反应会造成宿主异常反应，肠道黏膜屏障受损，免疫功能下降，器官功能紊乱甚至衰竭[13]。ZO-1和Occludin是细胞间紧密连接蛋白的重要成分，与保持肠屏障功能和肠通透性有密切的关系[26]。本研究结果表明，LPS模型组中ZO-1和Occludin的mRNA表达显著低于连梅汤治疗组。连梅汤能够显著提升ZO-1和Occludin的表达，从而维护肠屏障的完整性。回肠组织的HE染色结果与qPCR结果一致，连梅汤可缓解LPS导致的肠道屏障破坏。
在脓毒症的发生和发展过程中，最容易受到损害的器官是肝脏[27]。我们研究发现，LMD治疗组的肝脏组织病理学结构基本正常。LPS组以肝小叶结构破坏、肝细胞排列障碍、肿胀、炎性细胞增加等为特征。结果发现，LPS组小鼠肝脏的炎性因子IL-1β、IL-8及TNF-α的mRNA表达水平比CON组有明显提高，而LMD能有效抑制促炎因子的表达，从而达到预防减轻肝脏炎性作用的目的。由于肺组织对炎症介质的显著易感性以及氧化应激，经常引起急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，因此，肺组织的发展也是最早、最容易受到脓毒症影响的靶器官[28]。本研究观察到LPS组肺泡萎缩、肺泡壁增厚、破坏肺泡的结构、浸润肺间质炎性细胞、血管淤血等症状。LMD组可明显改善LPS诱导的肺损伤。RT-qPCR研究结果表明，炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α在肺组织中的基因表达明显增加，LPS诱发的炎症因子mRNA表达可明显升高，通过连梅汤预处理而得到显著降低。
5. 结论
综上，该项研究初步证明连梅汤对预防和保护脓毒症有一定效果。结果表明，LMD可有效改善LPS诱导的脓毒症小鼠肠道屏障损伤、肝肺损伤和炎症失衡，但研究不够深入，其具体机制有待进一步研究。
基金项目
重庆市渝中区科技局自然科学基金项目(编号：20240122)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。