1. 引言
肺缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤是肺移植、袖状肺叶切除术等手术中不可避免的损伤之一，会产生过量有毒物质[1]，导致术后肺功能受损。肺缺血再灌注损伤的机制尚不完全清楚。进一步阐明其机制，寻找有效的治疗方法是目前的研究热点，有助于提高肺移植的成功率。
铜是一种重要的微量元素，作为重要的催化辅因子参与调节各种酶的活性[2] [3]。在血红蛋白合成和骨形成等生理过程中起重要作用[4]。铜离子引起细胞损伤的机制已被多次研究。主要原因是细胞铜代谢不稳定，表现为细胞内铁氧化还原蛋白1 (FDX 1)介导的脂肪酰基蛋白聚集、线粒体呼吸异常和铁硫簇蛋白减少。这种引起蛋白毒性应激并最终诱导细胞死亡的方式被称为铜死亡[5]。铜死亡已经并证明在多种病理过程中起关键作用。
本研究将重点研究大鼠肺缺血再灌注损伤组织中的铜离子水平及2个关键铜转运蛋白——SLC31A1与ATP7B的表达水平，阐明大鼠肺I/R模型中铜离子的变化。本研究为进一步研究铜死亡在肺I/R中的作用机制及后续治疗提供了理论依据。
2. 资料与方法
2.1. 动物资料与模型建立
7~8周龄S-D大鼠(雄性，济南朋悦)被饲养在与自然光照/黑暗循环相似的动物饲养室内，并有足够的食物和水。所有动物在实验前3天在动物饲养室进行环境习服。本研究中的动物实验遵循ARRIVE (Animal Research: Reporting of in Vivo Experiments)指南。
大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)进行麻醉。然后，通过颈部正中切口将气管导管插入大鼠气管，连接动物呼吸机进行辅助呼吸。初始潮气量为10 mL/kg。股静脉插管用于给药。开胸后注射肝素(100 IU/只) 10 min，呼气末用无创微血管夹夹闭左肺门。钳夹期间潮气量降至6 mL/kg。缺血90 min后取出微血管夹，调整潮气量为10 mL/kg，再灌注120 min。灌注结束后，抽取动脉血行血气分析，麻醉下放血处死大鼠。取左肺组织和血液样本进行检测。
缺血再灌注组(I/R Model)与对照组(Control)各设置6只，对照组除夹闭左肺门操作之外与再灌注组保持完全一致。
2.2. 仪器设备与观察指标
2.2.1. 铜离子浓度测定
比色定量试剂盒由Scientific Inc.提供。将清洗后的肺组织在液氮中速冻，取出，研磨成粉末，在裂解液中匀浆。16,000×g离心5 min后，收集上清液，定量蛋白，补充抗干扰液。将再次离心后的上清液与还原溶液共孵育5 min，使用酶标仪(MD，上海)测量吸光度(580 nm)。
2.2.2. 肺组织损伤评分
处死大鼠后，取左肺叶在多聚甲醛中保存24 h，石蜡包埋，切成6微米切片进行HE染色。根据以下标准进行肺组织病理学损伤评分(LIS)：中性粒细胞浸润，肺间质水肿，肺透明膜形成，出血。每个标准在5个尺度上评分：正常 = 0，微小变化 = 1，轻度变化 = 2，中度变化 = 3，重度变化 = 4 (8)。一名不了解本研究的病理学家用光学显微镜评估了所有切片。
2.2.3. 蛋白印记
使用完整的RIPA缓冲液裂解系统(Elabscience，武汉)裂解肺组织。然后用超声波破碎仪(Sonic, USA)对样品进行均质化。使用BCA蛋白试剂盒(Elabscience，武汉)测定蛋白浓度，并将等量的可溶性蛋白分散到4%~20%聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到PVDF膜上，然后进行Western blot分析。在添加抗体后，在4℃进行过夜孵育。然后，用PBST洗涤膜三次后，用山羊抗大鼠二抗(Proteintech, 1:10,000)。采用ECL试剂(Elabscience，中国武汉)对印迹进行可视化，ImageJ软件分析灰度值ATP7B抗体由Proteintech (中国)提供。MCE提供SLC31A1抗体。β-actin抗体由Sevier (中国)公司提供。硫辛酸抗体由Abcam (UK)提供。
2.3. 统计分析
数据以均数 ± 标准差表示，使用Prism 10.1.2进行检验。Shapiro-Wilk检验验证正态分布，差异采用单因素方差分析和Tukey’s检验。使用SPSS 27.0.1进行皮尔森相关性检验。本研究中p < 0.05为显著性。
3. 结果
3.1. 肺损伤模型成功建立
从HE染色的病理切片中可以看出(图1)，无论是中性粒细胞浸润、肺间质水肿还是肺出血，I/R组的结果均较对照组严重。两组大鼠肺损伤评分差异大(图2)，Control组肺损伤评分较低，I/R组肺损伤评分较高，p < 0.01，大鼠肺缺血再灌注损伤模型成功建立。
Figure 1. HE staining of lung tissue in control group and ischemia-reperfusion injury rats
图1. 对照组与缺血再灌注损伤大鼠肺组织HE染色图
Figure 2. Lung injury scores of the two groups of rats
图2. 两组大鼠肺损伤评分
3.2. 再灌注模型组肺组织铜含量明显较对照组升高
如图3所示，缺血再灌注损伤组大鼠肺组织中铜离子含量相比对照组有明显上升，p < 0.01。
Figure 3. Copper ion content in lung tissue of rats in two groups
图3. 两组大鼠肺组织铜离子含量
3.3. 铜转运蛋白含量发生变化
如图4所示，相比于对照组大鼠，在缺血再灌注损伤组的大鼠肺组织中，负责铜内流的蛋白SLC31A1表达明显增多，而负责铜离子外流的蛋白ATP7B表达量明显减少。
Figure 4. The expression of copper ion transporter in lung tissue of rats in the two groups
图4. 两组大鼠肺组织中铜离子转运蛋白表达情况
3.4. 脂酰化蛋白含量明显变化
Figure 5. Changes in the content of acylated proteins in the two groups of rats
图5. 两组大鼠脂酰化蛋白含量变化
脂酰化蛋白含量的升高被认为是铜死亡发生的依据之一。由图5可见，在缺血再灌注大鼠中脂酰化蛋白明显升高。
3.5. 铜转运蛋白与肺损伤评分相关性
利用SPSS计算两种铜转运蛋白与肺损伤评分之间的相关性结果如表1，可见铜转运蛋白与肺损伤评分关系密切。
Table 1. Correlation between two copper transporters and lung injury scores
表1. 两种铜转运蛋白与肺损伤评分之间的相关性
|
与肺损伤评分间皮尔逊相关性 |
显著性 |
ATP7B |
−0.978 |
<0.01 |
SLC31A1 |
0.992 |
<0.01 |
4. 讨论
铜在广泛的生理过程中起着至关重要的作用。为了使代谢过程正常进行，铜水平需要保持在一个特定的范围[6]。细胞内铜水平的调节由依赖于铜的复杂和系统性蛋白质网络管理，这些蛋白质网络包括铜酶、伴侣蛋白和转运蛋白，以确保铜水平的稳定性[7]。这些蛋白协同调节细胞内铜的输入、输出和使用，确保铜水平保持稳定，并防止过量和缺乏。
溶质载体家族31成员1 (SLC31A1)是一种重要的铜转运蛋白，可影响细胞膜对铜的摄取。有证据表明SLC31A1对铜转运到某些器官和组织具有重要意义[8]。铜稳态分析提示SLC31A1可通过调控细胞内铜浓度影响铜死亡[9]。而ATP7B作为重要的铜离子外流转运蛋白在控制铜离子浓度方面同样具有重要意义[10]。相关性分析显示，铜转运蛋白含量与肺损伤评分显著相关，更直接表明了铜离子在再灌注损伤中的重要作用。脂酰化蛋白的聚集暗示铜死亡的发生，具体的机制还有待进一步探索。
本研究从铜离子浓度与蛋白表达层面论证了在大鼠缺血再灌注损伤过程中组织铜离子浓度的升高，对于后续研究此过程中的铜死亡具有重要意义。
5. 结论
在S-D大鼠肺缺血再灌注损伤模型中，肺组织中铜离子含量有明显提高；铜离子含量与肺损伤程度具有显著相关性。
基金项目
本研究得到国家自然科学基金(82102188)的资助。
NOTES
*通讯作者。