1. 引言
胃癌的发病率居全球第五位，是常见的恶性肿瘤，患者的预后较差。中国的胃癌高发区域主要集中在西北和东南沿海地区[1]。胃癌初期无特异性表现，大多数胃癌患者在确诊时病情已经进展至晚期。随着手术、化疗、靶向治疗及免疫治疗等综合治疗策略的应用，患者的生存时间得到了显著改善，但由于胃癌的高度异质性和侵袭性，预后仍然不佳[2]。为了能够早期诊断、精准治疗，寻找更有效的生物标志物显得尤为重要。
双硫死亡[3]是最新发现的不同于铁死亡、细胞凋亡等程序性细胞死亡方式的新的细胞死亡形式。研究发现，SLC7A11高表达的癌细胞，葡萄糖大量消耗后会引起细胞内的肌动蛋白细胞骨架回缩、板状伪足形成，从而引起细胞皱缩、死亡。研究表明，SLC7A11是双硫死亡的关键分子，其在胃癌组织中呈现高表达状态，显著增强了肿瘤细胞的增殖能力、迁移活性及侵袭潜能，在胃癌的发生和进展过程中扮演着关键角色，并且能够通过抑制PI3K/AKT通路铁死亡的细胞进程，起到控制胃癌进展的作用[4]。
在既往的研究中，LncRNA关于肿瘤发生发展和杀死或抑制肿瘤的作用越来越得到研究者的重视[5]-[8]。目前免疫和靶向治疗在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，更多的肿瘤病人因此获益。LncRNA可作为靶向治疗肿瘤的潜在靶点，不仅能够延缓肿瘤的进展，还能提高放疗的效果，并减少化疗的抗药性[8]-[10]。但LncRNA在肿瘤双硫死亡中的作用、机制，以及与化疗、免疫环境等的关系尚不明确。双硫死亡的发现为抗癌治疗提供了新的思路，其在胃癌中的转化医学安全性和有效性仍需进一步研究。
2. 材料与方法
2.1. 数据来源
从TCGA数据库下载407例胃腺癌患者的转录组、临床资料和体细胞突变数据。从已知研究中[3]确定了10个双硫死亡相关基因。基于双硫死亡相关基因的表达水平，采用Pearson相关性分析(r > 0.4, P < 0.001)对胃癌患者的lncRNA进行筛选，最终鉴定出与双硫死亡机制密切相关的lncRNA。
2.2. 构建双硫死亡相关lncRNA风险模型
将407例胃癌患者随机分配至训练集(204例)和验证集(203例)，训练集用于建立风险评分模型，验证集用于评估模型的稳定性和预测效能。通过单因素Cox回归分析筛选与胃癌患者预后显著相关的lncRNA (P < 0.05)，利用LASSO回归进一步缩小lncRNA范围。基于筛选出的lncRNA，采用多因素Cox回归分析构建预后模型，并依据以下公式计算每位胃癌患者的风险评分：
风险评分 = AC016394.2表达量 × (−0.522074252508722) + AL354743.2表达量 × (−0.266369655783146) + AC097448.1表达量 × 0.696170246197329 + AL445231.1表达量 × (−0.723459212005132) + LINC00511 × (−0.470265199551909) + TNFRSF10A-AS1 × (−0.466700692129747) + C2orf27A表达量 × 0.700452759813083 + AC090844.3表达量 × 0.529709154089653 + CASK-AS1表达量 × 1.0108087401509。
利用“survival”和“survminer”R包进行生存分析，将407例胃腺癌患者以风险评分的中位数为界分为高危组和低危组，并通过绘制Kaplan-Meier生存曲线来比较两组患者的生存期，验证模型的预测能力。采用ROC曲线进一步评估风险评分对患者预后的预测效能。通过单因素和多因素Cox回归分析，筛选出与患者预后相关的临床因素。
2.3. 诺莫图的构建和验证
借助“rms”R包构建诺莫图，旨在基于个体差异预测胃腺癌患者的预后，并通过绘制校准曲线来评估诺莫图的预测效能。
2.4. 生物学通路与基因集富集分析
通过差异表达分析(Limma)筛选显著差异表达基因(P-value < 0.05, |log2FC| > 1)，并利用“ClusterProfiler”R包对基因进行KEGG富集分析，筛选并识别显著富集的生物学通路(P < 0.05)。利用基因集富集分析(GSEA)对高危组和低危组分别进行信号通路富集分析，探索两组间生物学功能方面的差异，以P < 0.001为条件筛选。
2.5. 肿瘤微环境、免疫浸润和肿瘤突变负荷
通过评估每个样本肿瘤微环境中的细胞成分，ESTIMATE算法可以借此评估每个样本的肿瘤微环境。使用TIDE网络工具来预测两个亚组间对ICIs的反应性。分析各个样本的肿瘤突变负荷(简称TMB)与高危组和低危组之间的关系及预后。
2.6. 统计学方法
本研究中数据处理和结果输出是R语言(4.3.2)完成的。通过Wilcoxon检验评估两亚组间的差异，设定P < 0.05作为差异具有统计学意义的阈值。
3. 结果
3.1. 预后模型的构建与验证
本研究从既往文献中确定了10个与双硫死亡相关的基因。通过person回归分析，我们筛选出694个与双硫死亡相关的长链非编码RNA (lncRNA)，进一步用单变量Cox生存分析筛选与患者预后显著相关的lncRNA，并使用森林图的形式可视化分析结果(见图1(a))。其中有18个lncRNA的风险比(HR值)大于1，包括AC138207.5、AP001107.5、AC005180.2、HCG11、AC018752.1、AP001363.2、LIMS1-AS1、AL157392.4、C2orf27A、AP000766.1、AC090844.3、AC012085.2、ADAMTS9-AS2、AL590617.2、AC097448.1、CASK-AS1、LINC01638、AC036103.1，是不良预后的标志物。利用LASSO回归确定最优回归系数，并通过交叉验证优化模型性能(见图1(b)和图1(c))，最终，我们开发了一个包含8个lncRNA的多变量Cox回归模型。
基于风险评分中位数，将样本分为高危组和低危组。为了能够评估风险评分与患者预后的关系，我们绘制了两亚组的Kaplan-Meier曲线，发现高危组生存率较差(P < 0.001，见图1(e)、图1(f))，两亚组间的无疾病进展率存在明显差异(P < 0.001，见图1(g))。通过对两亚组进行生存分析，表明高危组的患者预后较差，本模型与患者的预后相关。
(a)
(b) (c)
(d) (e)
(f)
Figure 1. Construction of prognostic model: (a) Identification of prognosis-associated lncRNA through univariate Cox regression analysis; (b), (c) Development of the prognostic model using LASSO regression and validation via cross-validation; (d), (e) Survival curves of the training set and validation samples; (f) Disease-free progression curves between the two subgroups
图1. 模型的构建：(a) 单因素Cox回归鉴定预后相关lncRNA；(b)、(c) LASSO回归构建预后模型和交叉验证；(d)、(e) 训练集、验证集的生存曲线；(f) 两亚组间无病进展期曲线
3.2. 预后特征的预测潜力评估
为了验证本模型对于胃癌患者预后的预测能力，我们对年龄、性别和分期等临床变量及模型风险评分分别进行单因素和多因素Cox回归分析。根据单因素Cox回归分析结果，年龄和肿瘤分级的风险比大于1且P值 < 0.05，与患者的预后有关，分期和风险评分的风险大于1且P值 < 0.001，具有明显的统计学差异(见图2(a))。为了明确各个因素是否能够独立预测患者的预后，多因素Cox回归分析被用来进一步探索，结果发现风险评分与分期的风险比大于1 (P < 0.001，见图2(b))。进一步证实，风险评分可以作为胃癌患者的独立预后因素。为了验证预后模型在胃癌患者总生存期方面的功能，我们利用ROC曲线探索了预后模型的准确性，1、3和5年的AUC值(ROC曲线下的面积)分别为0.745、0.686和0.740 (见图2(c))，证实了本模型能够有效地预测胃癌患者的预后。此外，为了比较各个临床因素的预测能力，我们对比了风险评分和常见临床因素预测胃癌患者生存期的功能，ROC曲线显示，风险评分(AUC = 0.686)的预测能力优于肿瘤分期(AUC = 0.633)，预后模型有良好的预测能力，且相较于传统的临床特征，具有更好的表现(见图2(d))。为了能够将模型用于临床实践，并评估患者预后，结合风险评分、年龄及肿瘤分期等变量，构建了用于预测胃癌患者生存时间的诺莫图(见图2(e))，诺莫图的预测能力得到了校准曲线的验证，C指数(C-index)为0.722 (见图2(f))，表明其具有良好的预测功能。
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Figure 2. Model validation and construction of nomogram: (a), (b) Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analyses assessing clinical variables; (c) Time-dependent ROC curves for predicting survival at 1, 3 and 5 years; (d) ROC curves of various factors; (e), (f) Construction of the nomogram and calibration plots for predicting survival rates
图2. 模型验证和构建列线图：(a)、(b) 多种临床因素的单因素、多因素Cox回归分析；(c) 1、3、5年生存率受试者工作特征曲线；(d) 各种因素的受试者工作特征曲线；(e)、(f) 列线图构建和预测生存率校准图
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
(i) (j)
Figure 3. External data validation of the model: (a)~(j) Survival analysis of GEO data for genes associated with disulfidptosis
图3. 模型外部数据验证：(a)~(j) 双硫死亡相关基因的GEO数据的生存分析
为了进一步验证本研究的结果，避免单数据集建模导致的结果不稳定，利用GEO胃癌数据对构建模型的双硫死亡相关基因进行生存分析(见图3(a)~(j))，除NDUFA11外，其余基因的表达量均与患者预后有关。
3.3. GSEA和KEGG富集分析
为了探索两亚组预后差别的原因，我们探索了两个亚组在细胞通路方面的差异。对两个亚组差异分析后，进行了KEGG富集分析(见图4(c))，结果表明，高危组比低危组高表达的差异基因多富集在cAMP信号通路、焦点粘附、细胞外基质–受体相互作用和钙信号等通路，与肿瘤的发生发展有关。为了进一步验证两亚组之间功能的差异，我们希望通过GSEA分析能够进一步挖掘其内在联系，分析结果(见图4(a)，图4(b))显示细胞外基质受体相互作用通路与焦点黏附等信号通路明显富集于高危组，发挥促进肿瘤增殖、迁移、粘附和分化等功能。通过对细胞通路的富集，我们发现高危组患者更多地富集在肿瘤发生发展的通路上，进而导致患者的不良预后。
(a) (b)
(c)
Figure 4. GSEA and KEGG enrichment analysis: (a), (b) GSEA enrichment analysis of low-risk and high-risk groups; (c) KEGG enrichment analysis
图4. KEGG和GSEA富集分析：(a)、(b) 低危组、高危组GSEA富集分析；(c) KEGG富集分析
3.4. 肿瘤微环境、免疫浸润和肿瘤突变负荷分析
通过对免疫环境分析发现，初始B细胞、肥大细胞和II型干扰素反应功能在高危组中显著富集，且具有显著的统计学差异(P < 0.05，见图5(a)、图5(b))；辅助性T细胞2、主要组织相容性复合体I类分子、CD4+记忆T细胞活化功能在两个亚组间存在显著的统计学差异(P < 0.05，见图5(a)、图5(b))。为了进一步验证两个亚组间免疫细胞浸润的差异，进一步探索发现，低危组的TIDE评分显著低于高危组(P < 0.001，见图5(c))。ESTIMATE分析结果显示在基质评分和综合评分中，高危组评分均高于低危组(P < 0.001，见图5(d))。分析两个亚组间TMB的差异发现，低危组的TMB显著高于高危组，且高肿瘤突变负荷的生存期要比低肿瘤突变负荷组高(见图5(f))。为了进一步探索肿瘤突变负荷和风险评分与预后的关系，我们进一步区分亚组后发现，高肿瘤突变负荷和低危组的预后最佳，低肿瘤突变负荷和高危组的预后最差(P < 0.001，见图5(g))。
(a)
(b)
(c) (d)
(e) (f)
(g)
Figure 5. Comparative analysis of tumor microenvironment, immune infiltration, and tumor mutation burden: (a) Differences in immune cell infiltration between the two subgroups; (b) Variations in immune functional activity between the two subgroups; (c) Difference in TIDE scores; (d) Difference in tumor microenvironment scores; (e) Comparison of tumor mutation burden (TMB) between subgroups; (f) Kaplan-Meier survival curves for high and low tumor mutation burden groups; (g) Kaplan-Meier survival curves for high and low tumor mutation burden groups within the two subgroups (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
图5. 肿瘤微环境、免疫浸润和肿瘤突变负荷的差异分析：(a) 两亚组间免疫细胞浸润差异；(b) 两亚组间免疫功能差异；(c) TIDE评分差异；(d) 肿瘤微环境评分差异；(e) 肿瘤突变负荷差异；(f) 高低肿瘤突变负荷组生存曲线；(g) 两亚组的高、低肿瘤突变负荷组生存曲线(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
4. 讨论
研究表明，在SLC7A11高表达的癌细胞中，当处于葡萄糖剥夺条件下时，癌细胞会显著增加对胱氨酸的摄取，并将其还原为半胱氨酸，这一过程会导致细胞内NADPH的大量消耗，进而引起二硫化物的显著积累，最终导致癌细胞的快速死亡。这种细胞死亡的方式被称为双硫死亡[3] [11] [12]。已知程序性细胞死亡方式的抑制剂无法抑制上述的细胞死亡过程。lncRNA在人类疾病，特别是肿瘤中具有重要的关联性，并已在相关研究中得到预测和验证[13]-[15]。已有大量研究表明，多种lncRNA在肿瘤的发生和进展过程中发挥了关键作用，涉及细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学过程和细胞行为[16]。研究表明，lncRNA通过与药物外排系统的改变、凋亡细胞死亡、自噬、EMT和肿瘤干细胞相关的机制，成为肿瘤对化疗不敏感的新兴和重要调节因子[17]。
本研究利用生物信息学方法构建了包含8个双硫死亡相关lncRNA的风险预后模型，其中多个lncRNA在肿瘤中的功能已得到基础实验的验证，进一步证明了模型与胃癌患者的预后有关。TNFRSF10A-AS1 (T-AS1)在胃癌组织中呈现显著过表达特征，其表达水平与邻近非癌组织相比存在明显差异。通过进一步的功能研究表明，T-AS1能够促进胃癌细胞增殖能力的提升，加速细胞周期的进程，并抑制了细胞凋亡的发生。
T-AS1直接与髓磷脂蛋白零样1 (MPZL1)结合，促进胃癌的发展。MPZL1在胃癌中表现出致癌功能，促进细胞增殖、迁移等恶性表型，并能够抑制细胞凋亡。T-AS1在胃癌中发挥着关键的致癌作用，其致癌功能依赖于其直接下游效应子MPZL1 [18]。
除T-AS1外，LINC00511通过与miR-195-5p、miR-124-3p、miR-515-5p等miRNA的相互作用，调节SOX4、PDK4、NFIX等基因的表达，从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭。除此以外，LINC00511通过与miRNA的相互作用，影响下游基因的表达，从而促进乳腺癌、肝癌、肺癌和脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[19]。
通过Kaplan-Meier曲线，我们的研究发现高危组生存期更差。受试者工作特征曲线分析进一步证明了风险评分的预测患者预后方面的能力比其他临床因素有更好的表现。对于胃癌患者来说，诺莫图通过多种临床因素和风险评分的综合分析可以预测患者预后，然后对患者预后进行评估，将患者分层，实施更为积极的治疗干预，从而提升患者的预后效果。
研究发现肿瘤微环境中的基质细胞与其他成分和免疫细胞及其免疫功能存在密切联系[20]。我们对高危组和低危组中免疫细胞浸润及其功能进行了分析，分析结果显示初始B细胞、肥大细胞在高风险组中显著富集，主要组织相容性复合体(MHC) I类分子减少与高危组的不良预后相关。在乳腺癌进程中，B细胞产生的致病性IgG通过靶向结合糖基化膜蛋白HSPA4，特异性地促进淋巴结转移。此过程触发下游蛋白ITGB5的活化，进一步启动Src/NF-κB信号通路的级联反应，调控肿瘤转移的进展[21]。肥大细胞(MC)通过促进血管生成及炎症反应，为癌症的进展提供支持。具体而言，MC释放的蛋白酶，如类胰蛋白酶和糜蛋白酶，能够激活基质金属蛋白酶，分解细胞外基质及肿瘤邻近组织，从而推动肿瘤的生长、血管形成以及转移进程[22]。免疫检查点抑制剂的一种潜在抵抗模式是免疫逃避涉及异常主要组织相容性复合体抗原呈现的T细胞免疫，SUSD6与TMEM127和MHC-I形成三分子复合物，并能够通过募集WWP2促进MHC-I泛素化和溶酶体降解，进而影响肿瘤的免疫逃逸[23]。在免疫细胞及其相关功能的影响下，高危组患者的预后更差。
基质细胞的功能呈现出两面性，在正常组织或肿瘤早期，基质细胞能够抑制肿瘤细胞的生长和发展；在晚期患者中，癌细胞及其释放的其他成分可以对微环境中的基质细胞进行编辑，改变其抑癌的功能，促进肿瘤的发展[24]。本研究发现通过ESTIMATE算法，评估两亚组的肿瘤微环境评分，我们发现高危组的评分明显较高(P < 0.001)，推测在高危组中基质细胞的比例要高于低危组，更加有利于肿瘤细胞的发展和转移，可能是高危组患者预后较差的影响因素。免疫检查点抑制剂开创了肿瘤治疗的新时代。胃癌治疗中，免疫治疗已经成为晚期患者一线治疗的标准方案。TMB是免疫治疗重要的预后标志物，高肿瘤突变负荷的患者，接受免疫治疗后预后更好[25]。本研究中，高风险组的TMB要低于低风险组患者，且高TMB的亚组K-M曲线提示有更佳的预后，生存期更长。我们的研究发现在低危组中高TMB的患者具有最长的生存期，高TMB可以激活机体的免疫功能，进而促进机体杀伤肿瘤细胞。
在本研究中，对于肿瘤免疫效应的评估，主要基于TIDE评分和ESTIMAT算法。TIDE评分可以预测肿瘤的免疫逃逸，但主要基于基因表达量的变化进行预测，没有考虑肿瘤微环境对免疫疗效的影响。ESTIMATE算法中主要关注免疫细胞的相对丰度，可能无法全面反映免疫细胞的功能状态和相互作用。这也就需要通过结合临床实际，进一步进行研究，以提高预测的准确性。
5. 结语
本项研究通过开发一个新的基于lncRNA的风险评分模型，为预测胃癌患者的预后提供了新工具。该模型基于分子特征，为理解胃癌的进展机制和治疗响应提供了新的视角。我们发现免疫细胞浸润表达、肿瘤突变负荷和肿瘤微环境的差异可能是影响胃癌患者预后和治疗效果的关键因素。这一发现可以预测胃癌患者的预后，指导患者的治疗，并为研究胃癌患者预后的相关因素提供了新的思路，通过对胃癌相关基因、lncRNA、肿瘤微环境中的基质细胞和免疫细胞进行综合分析，我们发现双硫死亡相关lncRNA与预后相关，并且在胃癌肿瘤微环境中的作用值得进一步深入研究。
双硫死亡是近年来新发现的一种程序性细胞死亡形式，其具体机制和生物学功能仍需要深入探索。这包括探索双硫死亡相关lncRNA在胃癌发展中的作用，以及它们如何影响免疫微环境，从而为胃癌的治疗提供新的策略和靶点。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。