1. 引言
子宫内膜异位症(Endometriosis，简称“内异症”)是子宫内膜组织在子宫外的部位生长从而引发炎症，盆腔疼痛，不孕，包块或结节等症状的慢性、复杂性妇科疾病，全球约5%至10%的育龄期妇女受此疾病影响[1]。内异症的发生发展涉及激素调控、免疫功能异常、炎症反应及遗传因素等多个方面，但其具体致病机制仍未完全阐明。因此，基于整体观念和辨证论治的中医药在治疗子宫内膜异位症方面展现了独特的优势。系统研究表明，相较于西药治疗，使用中药复方口服治疗内异症，能够在一定程度上提高临床有效率、缓解痛经、提高妊娠率，同时具有较低的不良反应发生率、复发率，并且远期疗效较为稳定[2]。这些优势使中医药治疗成为一种具有潜力的治疗选择。
黄芩、夏枯草和金银花是常用于中医治疗多种炎症和免疫相关疾病的传统草药，现代药理研究表明，这三味中药具有良好的抗炎、抗菌、免疫调节和抗肿瘤等作用[3]-[6]。中医认为内异症的本质为“离经之血”，导致经络阻塞、气机不畅，久郁久瘀易化热，可通过清热类药物清热和防热[7]。黄芩、夏枯草和金银花的配伍依据来源于它们各自的药效和相互协同作用。黄芩具有清热解毒、泻火燥湿的主治作用，是方剂的君药，能够有效清除体内湿热毒素，缓解炎症反应；夏枯草作为臣药，主要通过疏肝解郁、调理气机，缓解因肝气郁结引起的病理变化，减轻疼痛，促进激素水平的调节；金银花同样作为臣药，增强整体免疫力，清热解毒，防止病灶复发。三者配伍相辅相成，协同作用于子宫内膜异位症，清热解毒、疏肝解郁、消炎止痛，从多个方面进行综合调理。
网络药理学能够从中药方剂中识别有效成分，构建中药方剂干预疾病/证候的相关网络，基于疾病/证候相关网络发现中药方剂有效成分的网络靶点，从整体角度理解传统医学，提供新的方法论视角[8]。本研究通过网络药理学方法，探讨黄芩、夏枯草和金银花在治疗子宫内膜异位症中的主要活性成分、靶向作用及相关信号通路，从微观层面分析其可能的作用机制，旨在为临床治疗提供新的视角和思路。
2. 材料与方法
2.1. 黄芩、夏枯草、金银花有效活性成分及对应靶基因收集
运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索黄芩、夏枯草以及金银花的化学成分，同时遵循药物活性成分的筛选条件，优选口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(drug-like, DL) ≥ 0.18的成分拟作为候选有效活性成分。根据得到的有效成分在TCMSP中筛选出药物潜在作用靶点，筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，通过UniProt (https://www.uniprot.org)将对应靶基因转换为标准名称简写。
2.2. 子宫内膜异位症相关靶基因收集
以“Endometriosis”为关键词在基因卡片数据库(GeneCards, https://www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM, https://www.omim.org)和疾病相关的基因与突变位点数据库(DisGeNet, https://www.disgenet.org)中进行检索得到内异症相关的疾病靶点，设定Score值大于中位数的目标靶点为内异症的潜在靶点。
2.3. 药物–有效成分–交集靶点网络构建
通过Venny 2.1在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，筛选出黄芩–夏枯草–金银花有效成分作用靶点与内异症疾病靶点的交集，作为黄芩–夏枯草–金银花治疗内异症的潜在靶点并绘制韦恩图。使用Cytoscape 3.7.1软件对黄芩–夏枯草–金银花有效活性成分和交集基因进行网络可视化构建。
2.4. 蛋白质–蛋白质相互作用PPI网络构建
将获得的药物与疾病的交集靶点信息上传至STRING数据库(https://string-db.org)，蛋白种属设置为“Homo sapiens”，置信度设为>0.4，同时设置隐藏游离点，导入Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络。
2.5. 基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析
通过Metascape在线分析平台(https://metascape.org)对140个交集靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P < 0.01为筛选标准，下载数据，使用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)进行作图，分别列出GO富集分析中排名前10和KEGG通路富集分析中排名前20的结果。
3. 结果
3.1. 黄芩–夏枯草–金银花活性成分及潜在靶点
分别使用关键词“黄芩”“夏枯草”“金银花”在TCMSP数据库中检索，以OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18为筛选条件，同时去掉没有靶点的成分共获得52个有效成分，其中黄芩29个、夏枯草6个、金银花11个，另有6个为交集成分，根据OB降序排列，见表1。将黄芩–夏枯草–金银花的52个有效成分对应靶点合并去重共得到靶点245个。
Table 1. Effective active ingredients of Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos
表1. 黄芩–夏枯草–金银花有效活性成分
序号 |
Mol ID |
编号 |
化合物 |
OB (%) |
DL |
药物来源 |
1 |
MOL002934 |
HQ1 |
NEOBAICALEIN |
104.34 |
0.44 |
黄芩 |
2 |
MOL003006 |
JYH1 |
(-)-(3R,8S,9R,9aS,10aS)-9-ethenyl-8-(beta-D-glucopyranosyloxy)-2,3,9,9a,10,10a-hexahydro-5-oxo-5H,8H-pyrano[4,3-d]oxazolo[3,2-a]pyridine-3-carboxylic acid_qt |
87.47 |
0.23 |
金银花 |
3 |
MOL002932 |
HQ2 |
Panicolin |
76.26 |
0.29 |
黄芩 |
4 |
MOL012246 |
HQ3 |
5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavanone |
74.24 |
0.26 |
黄芩 |
5 |
MOL002927 |
HQ4 |
Skullcapflavone II |
69.51 |
0.44 |
黄芩 |
6 |
MOL002937 |
HQ5 |
DIHYDROOROXYLIN |
66.06 |
0.23 |
黄芩 |
7 |
MOL003117 |
JYH2 |
Ioniceracetalides B_qt |
61.19 |
0.19 |
金银花 |
8 |
MOL006767 |
XKC1 |
Vulgaxanthin-I |
56.14 |
0.26 |
夏枯草 |
9 |
MOL003111 |
JYH3 |
Centauroside_qt |
55.79 |
0.5 |
金银花 |
10 |
MOL000228 |
HQ6 |
(2R)-7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one |
55.23 |
0.2 |
黄芩 |
11 |
MOL003014 |
JYH4 |
secologanic dibutylacetal_qt |
53.65 |
0.29 |
金银花 |
12 |
MOL003095 |
JYH5 |
5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone |
51.96 |
0.41 |
金银花 |
13 |
MOL002915 |
HQ7 |
Salvigenin |
49.07 |
0.33 |
黄芩 |
14 |
MOL000073 |
HQ8 |
ent-Epicatechin |
48.96 |
0.24 |
黄芩 |
15 |
MOL003128 |
JYH6 |
dinethylsecologanoside |
48.46 |
0.48 |
金银花 |
16 |
MOL000098 |
B1 |
quercetin |
46.43 |
0.28 |
夏枯草、金银花 |
17 |
MOL000737 |
XKC2 |
morin |
46.23 |
0.27 |
夏枯草 |
18 |
MOL001495 |
JYH7 |
Ethyl linolenate |
46.1 |
0.2 |
金银花 |
19 |
MOL002917 |
HQ9 |
5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone |
45.05 |
0.33 |
黄芩 |
20 |
MOL008206 |
HQ10 |
Moslosooflavone |
44.09 |
0.25 |
黄芩 |
21 |
MOL000449 |
A1 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
黄芩、
夏枯草、
金银花 |
22 |
MOL006772 |
XKC3 |
poriferasterol monoglucoside_qt |
43.83 |
0.76 |
夏枯草 |
23 |
MOL003036 |
JYH8 |
ZINC03978781 |
43.83 |
0.76 |
金银花 |
24 |
MOL001490 |
HQ11 |
bis[(2S)-2-ethylhexyl] benzene-1,2-dicarboxylate |
43.59 |
0.35 |
黄芩 |
25 |
MOL002879 |
HQ12 |
Diop |
43.59 |
0.39 |
黄芩 |
26 |
MOL002897 |
HQ13 |
epiberberine |
43.09 |
0.78 |
黄芩 |
27 |
MOL004355 |
XKC4 |
Spinasterol |
42.98 |
0.76 |
夏枯草 |
28 |
MOL001494 |
JYH9 |
Mandenol |
42 |
0.19 |
金银花 |
29 |
MOL000422 |
B2 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
夏枯草、
金银花 |
30 |
MOL002928 |
HQ14 |
oroxylin a |
41.37 |
0.23 |
黄芩 |
31 |
MOL002914 |
A2 |
Eriodyctiol (flavanone) |
41.35 |
0.24 |
黄芩、
金银花 |
32 |
MOL002910 |
HQ15 |
Carthamidin |
41.15 |
0.24 |
黄芩 |
33 |
MOL004798 |
XKC5 |
delphinidin |
40.63 |
0.28 |
夏枯草 |
34 |
MOL002913 |
HQ16 |
Dihydrobaicalin_qt |
40.04 |
0.21 |
黄芩 |
35 |
MOL000525 |
HQ17 |
Norwogonin |
39.4 |
0.21 |
黄芩 |
36 |
MOL010415 |
HQ18 |
11,13-Eicosadienoic acid, methyl ester |
39.28 |
0.23 |
黄芩 |
37 |
MOL012266 |
HQ19 |
rivularin |
37.94 |
0.37 |
黄芩 |
38 |
MOL006774 |
XKC6 |
stigmast-7-enol |
37.42 |
0.75 |
夏枯草 |
39 |
MOL002773 |
JYH10 |
beta-carotene |
37.18 |
0.58 |
金银花 |
40 |
MOL002925 |
HQ20 |
5,7,2',6'-Tetrahydroxyflavone |
37.01 |
0.24 |
黄芩 |
41 |
MOL000358 |
A3 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
黄芩、
夏枯草、
金银花 |
42 |
MOL000359 |
HQ21 |
sitosterol |
36.91 |
0.75 |
黄芩 |
43 |
MOL012245 |
HQ22 |
5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone |
36.63 |
0.27 |
黄芩 |
44 |
MOL002933 |
HQ23 |
5,7,4'-Trihydroxy-8-methoxyflavone |
36.56 |
0.27 |
黄芩 |
45 |
MOL000006 |
B3 |
luteolin |
36.16 |
0.25 |
夏枯草、
金银花 |
46 |
MOL003044 |
JYH11 |
Chryseriol |
35.85 |
0.27 |
金银花 |
47 |
MOL001689 |
HQ24 |
acacetin |
34.97 |
0.24 |
黄芩 |
48 |
MOL002909 |
HQ25 |
5,7,2,5-tetrahydroxy-8,6-dimethoxyflavone |
33.82 |
0.45 |
黄芩 |
49 |
MOL002714 |
HQ26 |
baicalein |
33.52 |
0.21 |
黄芩 |
50 |
MOL000552 |
HQ27 |
5,2'-Dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone |
31.71 |
0.35 |
黄芩 |
51 |
MOL000173 |
HQ28 |
wogonin |
30.68 |
0.23 |
黄芩 |
52 |
MOL001458 |
HQ29 |
coptisine |
30.67 |
0.86 |
黄芩 |
3.2. 子宫内膜异位症相关靶点
以“Endometriosis”为关键词在Genecards数据库、OMIM数据库和DisGeNet数据库中共检索到4627个内异症靶点，筛选并去重后共获得1925个内异症相关靶点。
3.3. 黄芩–夏枯草–金银花与子宫内膜异位症交集靶点
利用Venny 2.1.0将获得的245个药物作用靶点与1925个疾病相关靶点取交集，共获得交集靶点140个，绘制韦恩图(见图1)。
Figure 1. Venn diagram of intersection targets between Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos and endometriosis
图1. 黄芩–夏枯草–金银花与子宫内膜异位症交集靶点韦恩图
Figure 2. Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos drug for treating endometriosis-ingredients-intersection target network diagram
图2. 黄芩–夏枯草–金银花治疗子宫内膜异位症药物–成分–交集靶点网络图
3.4. 药物–成分–交集靶点网络图构建
将得到的140个交集靶点导入Cytoscape 3.7.1，构建了包含195个节点、645条边的药物–成分–交集靶点网络图。其中圆形代表药物，菱形代表药物成分，绿色六边形代表药物与疾病交集靶点(见图2)。
3.5. 蛋白质–蛋白质相互作用网络构建
将药物与疾病的140个交集靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，该网络包括140个节点，3462条边，网络节点间平均度值为49.5。将所得PPI网络导入Cytoscape 3.7.1软件，以节点的连通度(Degree)值对所有节点进行复杂网络分析，图中靶点的面积越大，颜色明亮程度越高，代表该靶点的Degree值越大，在其中发挥的作用越大(见图3)。其中Degree值排前10的靶点分别为AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、ESR1、CASP3、PTGS2、BCL2、EGFR，其对应的Degree值分别为116、113、113、109、107、103、102、101、100、99。
Figure 3. Protein-protein interaction network diagram of intersection targets of Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos and endometriosis
图3. 黄芩–夏枯草–金银花与子宫内膜异位症交集靶点蛋白质–蛋白质相互作用网络图
3.6. GO富集分析与KEGG通路富集分析
将140个交集靶点导入Metascape数据库，进行GO和KEGG富集分析，以P < 0.01为差异有统计学意义。GO功能富集分析共得出1878个生物过程(Biological Process, BP)，76个细胞组分(Cellular Component, CC)，196个分子功能(Molecular Function, MF)。按P值升序将排前10的条目信息导入微生信平台绘制柱状图(见图4)。KEGG通路富集分析发现共有相关通路205条，按P值升序将排前20的条目绘制气泡图，包括PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等(见图5)。
4. 讨论
子宫内膜异位症是慢性的和复发的，伴随着一系列临床症状，疼痛和相关的身体功能障碍会影响女性日常生活，对社交、家庭、教育和职业等方面产生显著的负面影响[9]-[11]。既往，临床上治疗子宫内膜异位症主要是通过手术和药物，但手术治疗无法痊愈，高达40%的女性会复发疼痛，且后续需再次手术的概率增加[12] [13]。药物治疗主要为使用非甾体抗炎药等药物来缓解相应症状，但会产生一定程度的不良反
Figure 4. Histogram of GO enrichment analysis of Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos in the treatment of endometriosis
图4. 黄芩–夏枯草–金银花治疗子宫内膜异位症GO富集分析柱状图
Figure 5. Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis of Scutellariae Radix-Spica Prunellae-Lonicerae Japonicae Flos in the treatment of endometriosis
图5. 黄芩–夏枯草–金银花治疗子宫内膜异位症KEGG富集分析气泡图
应。近年来，中医药在临床治疗中的应用逐步推广，其在治疗子宫内膜异位症方面也引起了广泛关注。
有研究发现，铁死亡是内异症的一个重要特征，内异症发生发展过程中会引起铁稳态失衡，导致局部铁过载、炎症反应等病理生理变化[14]。汉黄芩素可能通过激活SIRT1/Nrf2信号通路，调控铁死亡过程，从而对内异症大鼠产生保护作用[15]。夏枯草因其清热解毒、消肿散结的作用而广受关注，其中富含萜类、酚酸类、有机酸类及黄酮类等活性成分，展现出抗炎、抗病毒、抗氧化等多种生物学效应。近年来，中医药广泛使用夏枯草治疗甲状腺疾病[16]。金银花具有显著的抗炎、解热作用，刘丽教授常以金银花配伍连翘，针对湿热瘀滞所致的阴疮、盆腔炎、妇科腹痛、痛经及症瘕等疾病进行治疗，临床疗效较为突出[17]。
本研究通过网络药理学的方法发现，黄芩–夏枯草–金银花的有效活性成分共有52个，包括黄芩素、黄芩黄酮II、二氢黄芩苷、木犀草素、飞燕草素、金圣草素、β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚等。黄芩素可下调ICAM-1和Bcl-2的表达，并抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的释放，从而发挥抗炎作用，对子宫内膜异位症具有良好的治疗效果[18]。槲皮素、山柰酚和木犀草素在抗炎、免疫调控及抗氧化方面具有重要作用，同时还能抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。其中，槲皮素在实验研究中展现出显著的对子宫内膜异位症的抑制效果[19] [20]。PPI网络分析得出，黄芩–夏枯草–金银花治疗内异症的重要靶点包括AKT1、TNF、IL6、ESR1、EGFR等，这些靶点参与多种生物调节过程。研究表明，AKT作为PI3K的下游关键分子，参与调控细胞生长、增殖及代谢等多种信号通路[21]。内膜异位可能引发机体免疫反应，使腹腔液中的白细胞内巨噬细胞数量明显增多，并释放大量TNF-α，进一步促进间质细胞的黏附与增殖，最终促使异位病灶的发生与发展[22]。IL-6与炎症和免疫调节相关，有研究观察到内异症患者腹腔液中IL-6含量升高，提示IL-6在内异症的发生发展中起着一定作用[23]。雌激素受体(ESR)能够与雌二醇(E2)特异性结合，调控子宫内膜的生长，并在子宫内膜异位症的发生过程中发挥一定作用[24]。EGFR是一种调控细胞生长、增殖和分化的糖蛋白受体，在内异症组织中的表达水平高于正常子宫内膜组织[25]。因此，本研究的发现提示黄芩–夏枯草–金银花治疗子宫内膜异位症可能通过抑制AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B及ESR1等与炎症、免疫、激素、细胞增生、侵袭相关的因子的表达来发挥治疗作用。
本研究通过对KEGG通路富集分析得知，黄芩–夏枯草–金银花治疗内异症具有众多潜在通路，其中主要涉及PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路等。研究表明PI3K-Akt信号通路对内异症的发生和发展过程中的细胞增殖、侵袭、转移和血管新生过程具有调控作用[26] [27]。IL-17在内异症患者的血清、腹腔积液及病变组织中表达水平升高，并与其病灶的侵袭、生长和增殖密切相关[28]。在内异症等疾病中，TNF-α能够激活巨噬细胞，促使子宫内膜间质细胞释放大量炎性细胞因子，同时调控血管新生和内皮通透性，增强细胞黏附，从而促进盆腔粘连组织的形成与侵袭[29]。这些信号通路与内异症的细胞增殖、侵袭、转移及血管新生等生物学过程密切相关。因此我们推测黄芩–夏枯草–金银花可能通过调节这些通路来治疗子宫内膜异位症。
5. 结论
综上，黄芩–夏枯草–金银花治疗子宫内膜异位症的机制可能是通过其活性成分(黄芩素、黄芩黄酮II、二氢黄芩苷、木犀草素、飞燕草素、金圣草素、β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚等)对AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、ESR1、CASP3、PTGS2、BCL2、EGFR等重要靶点产生影响，通过PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路等的协同作用于子宫内膜异位症。然而，尽管网络药理学为这一作用机制提供了理论基础，由于本研究未进行动物实验验证，所得到的预测结果仍需通过进一步的实验研究进行确认。未来的研究将结合细胞和动物实验，验证这些预测结果的可靠性与有效性，为中药复方的临床应用提供更加坚实的实验依据。
基金项目
重庆医科大学大学生科学研究与创新实验项目(No. S202410631077)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。