1. 引言
带状疱疹(herpes zoster)是由水痘–带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus, VZV)引起的严重危害人体安全的感染性疾病[1]-[3]，最常见的并发症是带状疱疹后神经痛(post-herpeticneuralgia, phn)，即在疱疹急性期后仍持续存在的疼痛，可持续数月甚至数年，严重影响患者生活质量，主要对年龄超过50岁或免疫系统出现问题的人群带来极大威胁[4] [5]。
目前针对VZV最理想的防治手段是接种疫苗，相较于一般药物，疫苗主要用于预防疾病；正因为疫苗受众的广泛性，因此疫苗必须被证明其安全、有效和质量可控[6] [7]。gE抗原是VZV病毒感染细胞表面表达最丰富的糖蛋白[8]，负责介导病毒在细胞间的传播，是VZV病毒复制和组装的关键蛋白，因此越来越多的疫苗研制机构与生产企业将gE抗原作为制备重组带状疱疹疫苗的重要抗原组分[9] [10]。
等电点检测是重组蛋白药物质量控制的关键项目，反映了蛋白药物电荷与空间构象的均一性[11]。毛细管等电聚焦技术(capillary isoelectric focusing, cIEF)可将带不同电荷的异质体根据其等电点的不同进行聚焦分离，是检测蛋白质等电点的最佳方法之一，其具备分析耗时短、灵敏度及精密度较好的优点，已广泛应用于生物制品的研发和质量控制[12]，其原理是具有涂覆聚合物内壁的毛细管在装载电解液运行时会产生电渗流，电渗流会推动整个毛细管内的液体定向移动，且各溶质在毛细管中在迁移到各自的pI时会变为中性形成聚焦的区带。本研究采用cIEF技术对两性电解质比例、样品稳定剂(尿素浓度)、蛋白浓度[13]-[15]等参数进行优化，建立测定gE抗原等电点的方法并进行验证，为gE抗原等电点的表征提供依据。
2. 材料与方法
2.1. 样品
重组带状疱疹gE抗原(批号：202401、202402、202403)由华兰生物疫苗股份有限公司制备。
2.2. 主要试剂及仪器
尿素和亚氨基二乙酸(IDA)购自美国Sigma公司；Maurice cIEF毛细管卡盒、pI marker (3.21、8.40)、1%和0.5%甲基纤维素(Methylcellulose，MC)、iCE电极液及Maurice cIEF Fluorescence Calibration Standard均购自美国Protein simple公司；两性电解质pharmalyte (3-10和5-8)购自Cytiva公司；PNGase F酶购自New England Biolabs公司；Maurice毛细管等电聚焦电泳仪(ICE280)购自美国Protein simple公司；TG16台式高速冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.3. 等电点检测方法(cIEF法)
样品处理：将重组带状疱疹gE抗原用10 kd超滤管置换除盐，4℃，12,000 × g离心5 min，用水置换3次后紫外法定量，将蛋白稀释成1.0 mg/mL。反应体系配制：取两性电解质pharmalyte 3-10 4 μL，1% MC溶液35 μL，等电点标记物pI 3.21和pI 8.40各1 μL，混匀后加入34 μL样品，补加水至终体积为100 μL。同法制备空白试剂(用等体积缓冲液代替样品)。混匀后，4℃，10,000 × g离心3 min，取上清80 μL置于样品瓶中等待进样。等电点检测参数：预聚焦电压1500 V，聚焦时间1 min；聚焦电压3000 V，聚焦时间8 min。
2.4. cIEF法检测条件优化
检测条件优化体现在：两性电解质比例的优化，配制不同反应体系，使样品中两性电解质pharmalyte 3-10和pharmalyte 5-8的体积比分别为4:0、2:2、1:3，采用2.3项方法进行分析；蛋白浓度的优化，配制不同反应体系，使样品蛋白终浓度分别为1、2、4 mg/mL，采用2.3项方法进行分析；尿素浓度的优化，配置不同反应体系，使尿素终浓度分别为0、2、4 M，采用2.3项方法进行分析。
2.5. 方法验证
重复性：取重组带状疱疹gE抗原，按2.4项优化的条件进行等电点检测，重复测定6次，验证方法的重复性。
专属性：将样品缓冲液作为空白对照，以重组带状疱疹gE抗原作为待测样品，按2.4项优化的条件进行等电点检测，验证方法的专属性。
2.6. 方法的初步应用
重组带状疱疹gE抗原的检测：取3批重组带状疱疹gE抗原，按2.4项优化后的方法进行等电点检测。
重组带状疱疹gE抗原脱糖处理后检测：对重组带状疱疹gE抗原进行脱糖处理后，按2.4项优化后的方法进行检测。脱糖处理方法：取400 μL的重组带状疱疹gE抗原用10 k超滤离心管进行超滤(13,000 rpm，10 min，4℃)，重复2次。收集膜上样品至离心管中，加入625 U脱糖酶PNGase F，总体积为100 μL，混匀后37℃孵育20小时，即为脱糖处理样品。
2.7. 数据分析
采用Compass软件采集并处理数据。
3. 结果
3.1. 方法的建立
在两性电解质比例的选择:在两性电解质pharmalyte 3-10:pharmalyte 5-8体积比分别为4:0、2:2、1:3条件下，等电聚焦图谱峰型基本一致，各峰分离度并未发生明显改变，见图1。因此选择两性电解质pharmalyte 3-10:pharmalyte 5-8体积比4:0作为最终条件，即只使用两性电解质pharmalyte 3-10。
注：1-蓝色谱图，2-绿色谱图，3-灰色谱图，1、2、3表示两性电解质pharmalyte 3-10：pharmalyte 5-8为体积比分别为4:0、2:2、1:3。
Figure 1. cIEF graph of different amphoteric electrolyte ratio
图1. 不同两性电解质比例的cIEF图谱
注：1-蓝色谱图，2-绿色谱图，3-灰色谱图，1、2、3分别为蛋白浓度为1、2、4 mg/mL。
Figure 2. cIEF spectra of samples with different protein concentrations
图2. 不同蛋白浓度样品的cIEF图谱
蛋白浓度的选择：随着蛋白浓度的增加，样品会出现不同程度的凝集；等电点峰也会随蛋白浓度的增加而升高。见图2，通过对比不同浓度的样品等电点图谱，发现当样品浓度为4 mg/mL时，信号会超过毛细管电泳仪的紫外检测阈值(600 mAu)，同时考虑到蛋白在聚焦过程中易出现凝集造成峰分离不彻底，重复性差，综合考虑优先选择蛋白终浓度为1 mg/mL进行试验。
尿素浓度的选择：尿素可以有效地消除蛋白的凝集现象，因此在样品中添加尿素可以使等电点峰型可重复，而随着尿素浓度增加样品等电点峰的分离度降低。通过对比0、2、4 M尿素浓度结果，发现2 M时峰型较好，见图3。因此选择尿素浓度为2 M。
注：1-蓝色谱图，2-绿色谱图，3-灰色谱图，1、2、3分别为尿素浓度为0、2、4 M。
Figure 3. cIEF spectra of different urea concentrations
图3. 不同尿素浓度的cIEF图谱
3.2. 方法验证
注：上图为同一样品进样6次。
Figure 4. cIEF graph for verification of repeatability
图4. 重复性验证的cIEF图谱
重复性：取重组带状疱疹gE抗原(批号：202401)重复检测6次，pI均在4.5~6.2范围内，且等电聚焦电泳图峰形无明显变化，见图4。表明方法重复性良好。
专属性：取重组带状疱疹gE抗原(批号：202401)和样品缓冲液进行专属性验证，样品缓冲液在pI 3.38和pI 8.40之间无紫外吸收峰，而重组带状疱疹gE抗原具备特征峰，表明样品缓冲液对重组带状疱疹gE抗原pI的测定无干扰，表明方法的专属性良好，见图5。
注：1-蓝色谱图，2-绿色谱图，1、2分别为重组带状疱疹gE抗原和空白缓冲液。
Figure 5. cIEF graph for specific attribute verification
图5. 专属性验证的cIEF图谱
3.3. 方法的初步应用
重组带状疱疹gE抗原的检测：取重组带状疱疹gE抗原(批号：202401、202402、202403) 3批样品检测，等电点均在4.5~6.2之间，且等电聚焦图谱一致，见图6。
注：1-蓝色谱图，2-绿色谱图，3-灰色谱图，1、2、3分别为202401、202402、202403批重组带状疱疹gE抗原。
Figure 6. cIEF profile for pI detection of recombinant herpes zoster (gE antigen) samples
图6. 重组带状疱疹(gE抗原)样品pI检测的cIEF图谱
重组带状疱疹gE抗原脱糖处理后检测：考虑到gE抗原是一个糖基化的重组蛋白，糖基化可能会影响蛋白的等电点的检测，因此考虑在现有的方法上增加样品的脱糖处理，与未脱糖处理样品相比，脱糖处理后峰型以及分离度得到改善，可以检测到明显的主峰，其中主峰占比为15.91%，分离度为0.76。因此选用此方法分析有利于对样品进行质量控制，见图7。
Figure 7. cIEF profile of pI detection after deglycosylation treatment of recombinant herpes zoster (gE antigen) samples
图7. 重组带状疱疹(gE抗原)样品脱糖处理后pI检测的cIEF图谱
4. 讨论与结论
本研究通过对蛋白浓度、两性电解质、样品稳定剂(尿素)等条件的探索，获得了cIEF法的主要参数及检测条件，建立了重组带状疱疹gE抗原pI的分析方法。
pI是蛋白质重要的理化性质，对蛋白质药物的研究及开发有着重要意义，每种蛋白均有其特定的pI。毛细管等电聚焦电泳法是一种根据蛋白质pI不同而在毛细管内分离的技术，相较于现有技术具有快速准确、高通量的优势，为国内外生物制药行业在蛋白类药物质量控制提供准确真实、快速高效的新途径[11] [16] [17]。
重组蛋白的糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程[18]，影响免疫细胞和免疫分子的结构与功能，从而影响机体对抗原的应答反应。发酵过程中细胞培养基的成分及含量变化、培养条件等因素的调整均可能引起糖基化修饰的差异，产生具有不同pI的电荷异质体[3] [19]，极大影响重组蛋白的检测。cIEF具有试剂用量小、分析速度快、结果准确等优点，已广泛用于蛋白质的分析，但将cIEF用于糖蛋白的分析较少[20]-[23]，本研究建立一种检测糖蛋白的等电点的方法并经过验证；同时发现对样品进行脱N-糖苷键处理后各等电点峰分离度增加，峰型具有代表性，有利于gE抗原pI的检测，为后续重组类蛋白质量标准的建立提供了参考。
综上所述，本研究建立了一种检测重组带状疱疹gE抗原等电点的方法，可以作为重组带状疱疹gE抗原等电点的检测标准。同时又提出一种新的思路，采用脱糖酶处理重组蛋白后使用cIEF法进行等电点的检测，为其他重组蛋白类制品等电点的检测提供了参考，对于生物技术药物质量控制及质量标准的提升均具有重要意义。