1. 引言
真菌性角膜炎是一种主要由植物性角膜损伤所致的感染性角膜疾病，在发展中国家发病率长期居高不下[1]。患有真菌性角膜炎时，常见的并发症包括角膜溃疡和穿孔，这是最常见的致盲眼病之一[2]。然而，目前临床上治疗真菌性角膜炎的一线药物如那他霉素等不仅有较强的耐药性，还存在生物利用度较低和刺激性过大等问题[3]，所以寻找新的治疗真菌性角膜炎的药物非常有必要。根据中医学说，真菌性角膜炎属于湿翳的一种，这是由于外界湿气和毒素引发的内部热量上升导致双眼受到影响。通常在治疗时，主张使用清热解毒和祛湿降热的方法[4]。
小檗碱是一种广谱性的异喹啉类的中草药成分，它主要存在于一些能够提供清热祛湿及消灭病源毒素效果的有益中药材之中(例如：黄连、黄柏)。经过大量的实验验证表明，这种化学物质不仅具备了诸多的医药特性比如对抗细菌感染的能力、抑制癌症细胞生长能力等等。最新的研究进一步证实了这种药物能提升针对霉菌类特异性治疗剂的效果，并且具备协同抵抗耐药真菌的功能[5]。例如在念珠菌中，小檗碱与氟康唑、咪康唑、特比萘芬等抗真菌药物联合使用都可以产生协同或增强其效力[6]。Wagn等人发现，小檗碱通过调节PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路影响炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达来调控炎症[7]。以上表明，小檗碱具有在真菌性角膜炎的治疗方面具有潜力，然而其治疗作用及具体机制尚无人报道。
在本项研究中，我们运用了生物信息学的数据库与在线分析工具来获取并解析小檗碱、真菌性角膜炎的目标等相关信息，以预判其潜在的效果目标，通过构建“小檗碱–靶点–真菌性角膜炎”的关系网，探究小檗碱对于角膜炎的可能疗效原理。基于这些分析成果，我们使用分子对接技术进行了验证，以此深入了解炎症有效成分针对相关重要靶点的效应，为我们寻找新的抗真菌性角膜炎疗法提供了创新性的视角。
2. 材料和方法
2.1. 小檗碱及真菌性角膜炎相关靶点的筛选收集
以小檗碱在PubChem搜索框中查询。利用查出的Canonical SMILES分别在SwissTagetPredictions数据库进行靶点查询并导出结果。数据库得到的结果需要筛选出可能性大于0的结果。对应的靶点基因。在OMIM、GeneCards数据库中获取真菌性角膜炎对应基因，将数据库数据合并去重。
我们将关键的共聚焦目标信息输入到Cytoscape 3.9.1 (http://www.cytoscape.org)中，创建了一个名为“小檗碱–靶点–真菌性角膜炎”的图形化网络，以此来清晰地展示出小檗碱和病症之间的关联。
2.2. 获取交集靶点并绘制韦恩图
在venny2.1中分别导入疾病和药物对应基因取交集并保存Venny图。选取交集基因作为小檗碱治疗真菌性角膜炎的潜在靶基因。
2.3. PPI网络的构建与分析
我们利用2.2中的相关目标蛋白数据，将其输入至在线工具String的数据库里，并设置“species”选项为“human”，从而构建了蛋白质间的互动网络图。此种类型的蛋白质–蛋白质交互包含了通过String预估出的蛋白质之间既有的及可能存在的关联，同时对每一种蛋白质间的联系进行了评级与计量。得分越高，蛋白质相互作用强度越高。经过从String数据库抽取出节点A、节点B和Combined score的数据之后，我们把这些信息导入到Cytoscape 3.10.0软件里进行了视觉化的研究，从而获得了我们的网络分析的结果。在这个网络图上，我们可以通过调整节点的尺寸、色彩及度数等特性来展示蛋白质之间的互动分数的情况。
2.4. 靶点的GO和KEGG富集度分析
对于基因的细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)和基因功能分别采用GO (Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)进行分析。运用RStudio软件包“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.eg.db”，对治疗真菌性角膜炎的潜在靶点进行GO和KEGG分析。以Padj < 0.05为筛选标准，们确定了最后的富集结果并对其进行了视觉化。
2.5. 药物–靶点–疾病网络构建
我们将关键的交集靶点输入到Cytoscape 3.9.1 (http://www.cytoscape.org)中，创建了“小檗碱–靶点–真菌性角膜炎”的图形化网络，以此来清晰地展示出小檗碱和病症之间的关联。
2.6. 分子对接
依据Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找小檗碱的3D结构，并借用OpenBabel3.1.1 (http://openbabel.org/)保存为mol2格式。我们从PDB数据库存储的文件中提取了关键目标蛋白质的三维构象信息后，使用PyMOL 2.5 (http://www.pymol.org)对这些三维模型进行了剥离溶剂及配体、增添极性氢离子，并生成相应的pdb格式的文档；接着通过AutoDOCK软件来执行后续的对接研究工作。
3. 结果
3.1. 小檗碱与真菌性角膜炎交集靶点的获取结果
通过对SwissTargetPredictions数据库中的小檗碱靶基因搜索，我们发现共有139种目标基因。同时，利用GeneCards和OMIM数据库，我们可以找到关于真菌性角膜炎的相关靶标共计1809项。接下来，我们将这些数据导入Venny2.1软件并生成Venn图(详见图1)，从中发现了28个具有交叉作用的药物–疾病靶向位点。
注：红色代表真菌性角膜炎的疾病靶点，蓝色代表小檗碱的药物靶点，交集区域代表交集靶点。
Figure 1. Venn diagram of the intersection targets between FK and BBR
图1. 真菌性角膜炎与小檗碱的交集靶点韦恩图
3.2. PPI网络构建结果
将小檗碱与真菌性角膜炎的交集靶点引入String中构建PPI网络。将得到的TSV文件导入Cytoscape 3.10.1进行可视化分析(详见图2)。图中有26个节点，100条边。“节点”代表蛋白，“边”代表蛋白间的关联作用；图形越大则代表度值越大。运用 CytoNCA 对网络中所有蛋白进行分析，选择同时满足以下条件的靶点对应的节点作为小檗碱治疗真菌性角膜炎的核心靶点：① 介数中心度(betweenness, BC) > 中位数，② 接近中心度(closeness, CC) > 中位数，③ 平均最短路径长度 > 中位数，④ 平均度值 > 两倍中位数作为小檗碱治疗真菌性角膜炎的核心靶点[8]。图中节点的度值中位数为7，CC中位数为0.52，BC中位数为6.56。我们总共选取了13个重要的靶标，其中SRC、IK3CA、ICAM1、CDC42、MAPK14在度值排名前5位，核心靶点为SRC。
Figure 2. PPI network diagram
图2. PPI网络图
3.3. GO富集分析结果
GO功能富集分析结果显示，在统计学上显著的情况下，总共检索到652个生物过程、30个细胞组分和37个分子功能。根据Count值和P值的排序，对排名前十的功能进行了绘图展示(详见图3)。核心靶点主要涉及到参与细胞运动的促进、炎症反应、板状伪足组织的正向调节、白细胞的迁移、蛋白质向细胞核的定位、收缩性肌动蛋白丝束组装以及其他与肌动蛋白相关的生物过程。这些核心靶点主要分布在膜筏、膜微域、膜的外在成分、陷窝、磷脂酰肌醇3-激酶复合物、质膜筏、免疫突触等细胞结构中。另外，这些核心靶点还表现出多种分子功能，如氨基酸激酶活性、血红素结合、胰岛素受体底物结合等。
3.4. KEGG通路分析结果
使用Metascape数据库对28个关键靶点进行KEGG通路分析，得到102条通路(P < 0.05)，按照Count值及P值进行排序，选择前30条通路进行绘图(详见图4)。根据KEGG通路分析结果，提示小檗碱对真菌性角膜炎起主要治疗作用的通路包括白细胞跨内皮迁移、肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子信号通路、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路等。
3.5. 药物成分–靶点–疾病网络构建结果
为了更加直观地展示小檗碱、疾病靶点和真菌性角膜炎之间的相互关系，综合我们以上的数据导入Cytoscape 3.7.2合并成网络图(详见图5)。
Figure 3. GO enrichment analysis
图3. GO富集分析
Figure 4. KEGG enrichment analysis
图4. KEGG富集分析
Figure 5. Network diagram of drug components-targets-disease
图5. 药物成分–靶点–疾病网络图
3.6. 分子对接结果分析
我们通过对PPI蛋白质相互作用的核心目标进行了拓扑研究，并从中挑选出具有较高度的目标包括SRC、PI3KCA、JAK2、MET和CDC42。接着，根据Pubchem的数据库信息，我们找到了小檗碱的三维结构，然后使用了Autodock Tools软件来执行分子对接操作。实验的结果表明，每个小组的结合活性的数值分别是−6.5、−7.6、−8.6、−7.1和−7.8 (详见图6)。
4. 讨论
真菌性角膜炎是临床上棘手的感染性角膜病变，过度的炎症反应是疾病进展和预后较差的重要原因[9]。在本项研究中，我们运用了网络药理学分析方法，发现了小檗碱在真菌性角膜炎的治疗中的应用潜力。
临床上真菌性角膜炎的感染主要来自于植物源性外伤。之前的研究中表明，小檗碱自身具有一定的抗真菌能力，主要体现在细胞毒作用、抑制生物、抑制粘附作用等方面[5]。阮等人之前测定了盐酸小檗碱对19种植物病原真菌的菌丝生长抑制作用，论证了小檗碱具有广谱抗真菌作用[10]。然而，目前尚无其他研究论证小檗碱在真菌性角膜炎病程中发挥的抗炎作用。
在真菌性角膜炎中，真菌的侵入可以通过模式识别受体(PRrs)被机体所识别，从而引发免疫细胞的聚集和浸润，触发免疫反应和炎症反应[11]。特别值得一提的是，CLRs家族里的Dectin-1正是其中的佼佼者[12]。Dectin-1可以识别真菌细胞壁表面的β-葡聚糖，通过激活各种信号级联反应调节先天免疫反应，通过产生促炎细胞因子和活性氧等过程杀灭真菌[13]。
从分子对接的结果来看，小檗碱治疗真菌性角膜炎涉及5个核心基因，包括SRC、PI3KCA、JAK2、MET、CDC42；GO富集分析结果显示，靶点主要是关于炎症反应等相关生命进程，同时还包含有细胞膜及细胞质等细胞组成成分，以及蛋白质激酶的活化等特定分子功能。KEGG通路富集分析显示，主要富集在TNF、C型凝集素信号通路等。根据Lee等人所做的研究，他们指出Src选择性的抑制会明显降低由Mtb引发的Dectin-1表达水平，这说明Src激酶是Dectin-1依赖性信号传递的重要调控因素之一[14]。
注：(A) 小檗碱与SRC；(B) 小檗碱与PI3KCA；(C) 小檗碱与JAK2；(D) 小檗碱与MET；(E) 小檗碱与CDC42。
Figure 6. Molecular docking
图6. 分子对接
Src可以在Dectin-1识别真菌表面的β-葡聚糖后使其部分磷酸化以促进Dectin-1与Syk结合，进而启动后续的信号通道以增强对抗真菌的能力[15]。Syk和PI3K的激活在促炎细胞因子的生成方面起着关键的作用[16]。最近的研究表明，烟曲霉菌通过Syk/PI3K途径诱导免疫反应，HMGB1通过激活Syk/PI3K信号通路，通过Dectin-1受体参与了烟曲霉菌诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应[17]。IL-6作为经典的炎症因子，广泛参与免疫反应与炎症介导中[18]。过往的研究表明，在真菌性角膜炎中IL-6的表达明显升高[19]。Taylor等学者的研究揭示，IL-6和IL-23激活JAK/STAT可以引发中性粒细胞亚群产生IL-17，进而触发IL-17的自我分泌，从而提升了活性氧的生成，进而增加真菌的杀伤力[20]。中性粒细胞在固有免疫中发挥关键作用，然而，真菌性角膜炎病程中中性粒细胞的过度积聚会导致角膜混浊[21]。Felix等人的研究表明，阻断HGF/MET信号可以诱导中性粒细胞炎症反应消退[22]。有丝分裂原激活蛋白同工酶(MEK)家族，是炎症反应中关键的细胞信号传递级联之一。CDC 42作为是MEK途径的上游调节因子，参与调节JNK的信号传递。最近的研究表明，抑制CDC 42以减少炎症性细胞因子[23]，这些都为减轻炎症反应提供了新的思路。
总而言之，小檗碱对真菌性角膜炎的治疗展现出其多系统、多成分、多靶点的调节效应，基于此，我们利用网络药理学来深入探讨其生物学的原理，揭示了它有可能影响到SRC、PI3KCA、JAK2、MET和CDC42等关键节点，并借助C型凝集素受体及肿瘤坏死因子等多种路径实现抗炎与抑制细菌的作用。然而，关于真菌性角膜炎的复杂成因尚无定论，所以，从网络药理学中呈现出的多种通道为我们提供了实际运用上的理论支持，同时也是未来进一步展开实验室试验的研究基础。
NOTES
*通讯作者。