CD47-SIRPα在食管癌中的研究进展

Research Progress of CD47-SIRPα in Esophageal Cancer

摘要: 食管癌的发生、发展与许多因素有关，其中免疫系统发挥重要作用。CD47-SIRPα是PD-1/PD-L1，CTLA4之后的又一个免疫检查点，已经证明在多种血液系统肿瘤与实体瘤中高表达，通过产生抑制性信号阻止巨噬细胞吞噬癌细胞。本文针对其在食管癌中的表达、与患者预后的关系、免疫治疗进行综述，通过本文的阐述，食管癌中的CD47-SIRPα同样是高表达，高CD47或高SIRPα都是导致食管癌患者预后不良的因素，抗CD47抗体与人源性食管癌细胞、人源性食管癌裸鼠模型有一定的结合活性。

Abstract: The occurrence and development of esophageal cancer are related to many factors, among which the immune system plays an important role. CD47-SIRPα is another immune checkpoint after PD-1/PD-L1 and CTLA4. It has been proved to be highly expressed in various hematological malignancies and solid tumors. It inhibits macrophage phagocytosis of cancer cells by generating inhibitory signals. This article reviews the expression of CD47-SIRPα in esophageal cancer, its relationship with the prognosis of patients, and immunotherapy. Through the elaboration of this article, CD47-SIRPα is also highly expressed in esophageal cancer. High CD47 or high SIRPα are both factors contributing to poor prognosis of patients with esophageal cancer, Anti-CD47 antibodies have certain binding activity with human esophageal cancer cells and human esophageal cancer nude mouse models.

1. 引言

中国是食管癌的高发区，2020年发病率13.8/10万与死亡率12.7/10万高于国际平均水平6.3/10万、5.6/10万，这与种族遗传、居民饮食习惯如饮用高温水，食用腌制饮食，低水果蔬菜摄入及吸烟饮酒、恶劣的生活工作环境有关[1]。食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占中国食管癌所有病例的90%，早期食管癌无明显症状致大多数患者晚期才就诊，局部晚期的首选是手术，新辅助放化疗是搭配的治疗手段[2]。免疫治疗如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗针对PD-1/PD-L1进行了多项食管癌的临床试验，延长了患者的总生存期和无进展生存期，但也存在一些副作用如肌肉疼痛、皮疹、食欲减退、肺炎等[3]，CD47-SIRPα是另一种在多种实体癌和血液癌中表达的免疫检查点信号轴，本文针对其在食管癌中的作用进行综述。

2. CD47和SIRPα

CD47在1990年被发现，50KD大小，是一种免疫球蛋白，5次跨膜蛋白，在血小板和胎盘上与一种可以被抗β3抗体识别的整合素相联系又称为整合素相关蛋白，不仅在癌细胞，还在正常细胞细胞膜都有表达，包括红细胞和血小板等造血细胞[4]。CD47属于细胞膜受体糖蛋白，由三个部分构成：一个糖基化的N端IgV样细胞外结构域、一个跨螺旋束的5次跨膜结构相同的跨膜结构域和一个C 末端结构域。信号调节蛋白α (Signal Regulatory Protein α, SIRPα)、信号调节蛋白γ (Signal Regulatory Protein γ, SIRPγ)、血小板反应蛋白(thrombospondin1, TSP-1)和整合素α2β1、αvβ3是CD47的主要结合配体[5]。CD47与不同的配体结合有不同的功能，与SIRPα结合是抑制吞噬作用，与SIRPγ结合刺激T细胞增殖[6]，与TSP-1结合是调节细胞迁移、细胞黏附、血管生成、细胞凋亡，与整合素作用可以调节平滑肌细胞趋化反应、促炎细胞因子合成、血小板活化[5] [7] [8]。

信号调节蛋白(signal-regulatory protein, SIRP)有SIRPα、SIRPβ1、SIRPβ2、SIRPγ、SIRPδ这几种主要类型，信号调节蛋白α是目前研究最多的一种CD47配体，主要表达于髓系细胞如单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，树突状细胞表面。SIRPα属于Ig超家族跨膜糖蛋白，细胞质区域在鼠和人类之间都很保守，含有与抑制性免疫受体结合的酪氨酸残基协调其与酪氨酸磷酸酶2 (tyrosine phosphatase-2, SHP2)、酪氨酸磷酸酶1 (tyrosine phosphatase-1, SHP1)的联系，其细胞外区域包含三个免疫球蛋白超家族样区域：一个NH2末端V样结构域和两个C1样IgSF结构域，N氨基末端结构域可与CD47相互作用，胞质尾区与激酶类以及衔接蛋白紧密联系，胞内结构域是免疫受体酪氨酸抑制性基序(tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)，该结构域可以被磷酸化，在生物信号转导如参与细胞增殖分化、胚胎发育及神经系统信号传递，免疫稳态维持和肿瘤发生、发展中有重要作用。SIRPβ细胞质有6个非常短的氨基酸，缺乏与磷酸酶结合的信号基序，胞外与DAP12蛋白结合，在SIRPβ的跨膜区具有碱性侧链的氨基酸传递刺激性信号。SIRPγ是另一个与CD47结合的蛋白，亲和力较低，细胞质结构域由4个氨基酸组成，胞外无传递信号的蛋白[6] [9] [10]。

3. CD47与SIRPα相互作用

CD47-SIRPα相结合对免疫系统表现出负性作用，抑制含有SIRPα的髓系细胞吞噬高表达CD47的细胞。CD47在正常细胞中高表达起保护作用，例如防止红细胞、血小板被脾巨噬细胞快速消除；在衰老和受损、凋亡细胞表面CD47表达降低促进吞噬和代谢；在癌细胞中更高表达[11]，是正常细胞的3.3倍以上，阻止肿瘤细胞被清除，逃避免疫监视。这种“不要吃我”的信号是通过CD47的NH2端与SIRPα细胞质尾部的酪氨酸激酶抑制性序列(ITIM)结合，释放生长因子导致ITIM被磷酸化，随后在巨噬细胞内募集并激活SHP-1，SHP-2等磷酸酶，激活的磷酸酶抑制细胞吞噬过程中肌球蛋白IIA和肌动蛋白的结合，使肌动蛋白失去动力，吞噬被抑制[12]-[14]。SHP-1和SHP-2拥有不同的作用，但是都通过近端底物的去磷酸化不断调节细胞内信号通路及下游效应器的效应，调节细胞的生长与凋亡。SHP-1主要表达于造血细胞并负向调控这些细胞的功能，而且是CD47-SIRPα抑制吞噬过程中被激活的主要的磷酸酶；而SHP-2表达范围相对广泛，在大多数细胞中都有表达并调节GTP结合蛋白Ras和Rho，对于细胞生长主要发挥正向调控作用如促进细胞生长和迁移，二者相互协作精细调控体内细胞的生长发育[15]。

CD47-SIRPα的这种结合不仅在巨噬细胞吞噬中发挥作用，也对神经系统，代谢系统，正常免疫具有调节作用，在小鼠中，SIRPα突变及CD47缺乏会导致Th17 细胞或 Th1 细胞相关自身免疫性疾病；CD47缺乏与CD47-SIRPα作用被阻断会显著减少破骨细胞生成、成骨细胞生成障碍；CD47缺乏还刺激小鼠棕色脂肪组织生成、脂肪消耗增加产热增加从而减少了高脂肪饮食小鼠的体重和脂肪含量，同时葡萄糖消耗减少和胰岛素分泌的调控也改善了小鼠的葡萄糖耐量；CD47-SIRPα还参与小鼠神经细胞凋亡，神经突触生长和活动，CD47缺乏或降低减少了脑损伤后的局部梗死和肿胀，CD47增加则加重了脑卒中后血脑屏障的损伤等[15]-[17]。

4. CD47-SIRPα轴在食管癌

4.1. 表达与预后

目前关于CD47-SIRPα信号轴在食管癌中的表达与预后的研究较少。有学者[18]通过多组学分析发现，C1QA/B肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages, TAM)是食管鳞状细胞癌肿瘤微环境的中枢调节因子，CD47等多个免疫检查点均在C1QA/B巨噬细胞中呈阳性表达，CMTM2中性粒细胞与C1QA/B巨噬细胞在内的多种细胞相互联系同时也参与了肿瘤微环境中的免疫抑制作用。这说明在食管鳞癌的免疫微环境中包括巨噬细胞等吞噬细胞参与其中，而且这些细胞的吞噬作用受到了抑制，但他们检测的CD47表达在巨噬细胞等正常细胞上，并未对癌细胞上的表达进行检测。古等[19]通过95个食管鳞癌患者的基因图谱以及131个食管鳞癌患者的免疫组织化学分析出SIRPαmRNA在癌组织中的表达显著高于非癌组织(P < 0.001)，高表达组的总生存期(Overall survival, OS)及无病生存期(Disease-free survival, DFS)明显差于低表达组(P = 0.027, P = 0.035)，且浸润深度更深，通过多变量分析确定了SIRPα表达是食管鳞癌患者总生存期的重要预后因素之一(风险比 = 1.988、95%置信区间0.998~3.959、P = 0.04)。此外，高SIRPα的患者同时表达PD-L1的概率大大增加(多变量分析比值比 =3.766、95%置信区间1.148~12.35 P = 0.024)，生存分析中SIRPα与PD-L1共同表达的患者OS与DFS比单独表达或两者都不表达的患者更短(P = 0.14, P = 0.17)，即使差异并不显著。他们的研究很好的说明了SIPRα在食管鳞癌免疫微环境中高表达，众所周知，SIPRα主要在巨噬细胞等髓系细胞中表达，所以可以认为食管鳞癌免疫微环境中巨噬细胞高表达SIPRα，且表达量越高，患者预后越差。祖等[20]采集12例食管癌患者的肿瘤、瘤旁组织、邻近健康食管组织，检测发现与瘤旁和邻近健康组织相比，肿瘤和肿瘤旁NK细胞和CD8+T细胞都表达高水平的CD47 (P < 0.05)，并且表达CD47的群体比例和对CD47特异性抗体的染色强度明显高于非淋巴细胞组分与邻近健康组织中的对应细胞(P < 0.05)，这与前述学者[18]的研究类似，CD47是在NK细胞与T细胞等正常细胞上高表达，在癌细胞上的表达未知。于等[21]用野生型C57BL/6小鼠建立小鼠食管鳞癌细胞AKR皮下模型，发现小鼠在多次顺铂周期治疗后CD47与NLRP3蛋白表达增多，抑制肿瘤能力逐渐下降，导致化疗药物抵抗，随后注射抗CD47抗体，结果显示顺铂与抗CD47抗体联用小鼠肿瘤体积比单用顺铂小鼠肿瘤体积更小，说明联合瘤内注射抗CD47抗体可逆转顺铂化疗抵抗。这说明在食管鳞癌中CD47-SIRPα信号轴抑制了免疫吞噬功能，与乳腺癌、血液癌等癌种的作用机制是一样的，另外癌组织在化疗后CD47表达增多，笔者认为是食管鳞癌细胞的一种生存策略，因为在化疗通路上被化疗药物“堵住”，它开始尝试在免疫检查点通路上高表达CD47蛋白抑制吞噬作用，以求在免疫通路上生存下来。同样，谭等[22]将CD47-siRNA转染到人食管鳞癌细胞Eca-109，转染组癌细胞CD47蛋白含量明显低于对照组(P < 0.05)，癌细胞增殖率显著低于对照组(P < 0.05)，癌细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平显著高于对照组(P < 0.05)。吴等[23]同样发现了CD47-siRNA转染可以降低食管腺癌细胞SEG-1中CD47蛋白水平并降低了癌细胞活力(P < 0.05)，增加了癌细胞中促凋亡蛋白Bax水平表达(P < 0.05)，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平表达(P < 0.05)，这些都是通过提高癌细胞内ROS水平实现的(P < 0.05)。降低食管鳞癌或腺癌细胞膜CD47的表达抑制了癌细胞增殖和活力，这也反过来证明了CD47-SIRPα确实抑制了免疫，抑制了吞噬功能。

张等[24]通过收集65例食管鳞癌患者的临床及病理资料进行分析，CD47主要在癌细胞膜和细胞质中表达，CD47在癌组织中表达率66.2%，高于癌旁组织的27.7%，有明显差异(P < 0.05)。CD47的表达与肿瘤浸润深度(P = 0.002)、淋巴结转移(P = 0.01)及肿瘤分级分期(P < 0.02)呈正相关，CD47阳性的患者5年生存率16.1%，阴性患者为48.3%，两者之间的差异有统计学意义(P = 0.001)。这说明CD47在食管鳞癌细胞膜高表达抑制免疫功能，高CD47是患者预后不良的因素之一。同样，赵等[25]收集14例食管鳞癌患者的癌组织和相应的非癌组织检测，结果显示CD47在癌组织中的表达更高(P < 0.05)，肿瘤组织与肿瘤细胞外基质高抗CD68染色，而CD68蛋白主要表达于巨噬细胞。他们还检测出人食管鳞癌TE-8细胞系表达高水平的CD47，KYSE-30和KYSE-270细胞系表达有限量的 CD47，TE-1和TE-10细胞系中CD47的水平检测不到，在体外用抗CD47抗体处理TE-8细胞，增加了M2巨噬细胞对TE-8细胞的浸润和活性，而且是以剂量依赖型的方式促进吞噬。谭等[26]筛选出了与食管鳞癌放射敏感性相关的几个miRNA并间接预测出CD47等多个靶基因与肿瘤发生发展、肿瘤细胞凋亡及患者预后紧密相关(P < 0.05)。

有研究者[27]分析了癌症基因组图谱数据库中食管腺癌与正常样本之间免疫相关差异表达基因的表达，CD47基因在低危组的表达高于高危组(P = 0.039)，Spearman相关性分析其与M2巨噬细胞表达呈正相关。我们可以把这里的CD47基因当作CD47蛋白，这就与前面所述CD47蛋白高表达导致预后不良相反，食管腺癌与食管鳞癌中CD47蛋白的作用可能不同？究其原因，他们的分组中低危组与高危组是通过多变量 Cox 回归分析构建的生存分析模型来决定的，相比于真实的实验还有一定的偏差，所以食管腺癌细胞中CD47应该还是高表达的，高表达的CD47大概率会缩短患者的生存期。王等[28]通过收集136例食管鳞癌患者的临床与病理资料发现CD47与CD133在癌细胞中的表达明显高于相邻的非癌组织(P < 0.0001, P = 0.011)，癌细胞分化不良的患者其表达更多，二者的表达量的多少变化一致，CD47/CD133高表达的患者总生存期与无进展生存期都比低表达的患者短(P < 0.02)，二者都可以作为预后不良的预测因子，预测时二者合用效果更准确。同样，铃等[29]收集102例食管鳞癌的癌组织与癌旁组织通过实时荧光定量(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)发现癌组织CD47表达高，CD47表达高的患者5年生存率35.4%明显低于表达少的60.8% (P = 0.007)，用单因素及多因素分析出肿瘤深度、淋巴结转移、CD47表达是其独立预后因素(P < 0.05)。她们随后又筛选出一种与CD47表达呈负相关的抑癌基因miR-133a，其与CD47基因的3'-UTR结合抑制CD47表达，她们将其转染到裸鼠移植瘤模型中显著抑制了食管癌细胞TE-8的致瘤能力及肿瘤体积增长(P < 0.04)，这也表明CD47蛋白是促进食管鳞癌发生发展的因素。

4.2. 免疫治疗

目前，尽管CD47-SIRPα相关的免疫治疗尚未在临床食管癌患者中应用，但已有临床前研究，并且取得了一定的进展。华等[30]构建C57BL/6小鼠鼠源性食管鳞癌模型对其进行抗CD47抗体治疗，观察发现抗CD47治疗正常免疫小鼠肿瘤组织浸润了更多的CD8+ T细胞，更多的TH1细胞，更低的TH2细胞，增加了促炎细胞因子IL-2、IFN-β等表达。对比抗CD47治疗树突状细胞缺陷小鼠与免疫球蛋白治疗正常免疫小鼠则没有这种变化(P < 0.05)，同时他们通过人食管鳞癌组织分析发现肿瘤组织中CD47表达与浸润的CD8T细胞数量也成负相关(P < 0.001)，这说明抗CD47作用依赖于抗原提呈细胞增强炎症反应从而增强抗肿瘤免疫反应，随后他们又发现抗CD47治疗正常免疫小鼠肿瘤组织浸润的CD8+ T细胞表达更多的PD-1和CTLA-4(P < 0.001)，用抗CD47抗体 + 抗PD-1 + 抗CTLA-4抗体联合治疗的小鼠相比单用抗CD47抗体或抗PD-1 + 抗CTLA-4抗体治疗的小鼠肿瘤生长速度最缓慢(P < 0.01)，小鼠的总生存期最长(P = 0.003)，这说明免疫检查点之间是相互影响的，某个检查点被抑制其它的可能表达更多，这也是癌细胞的一种生存策略，提示了联合用药的重要性。李等[31]构建了重组蛋白CD47免疫新疆双峰骆驼，从骆驼血清中通过免疫亲和层析获得一种天然的抗CD47特异性抗体，其相比于全分子的单克隆抗体缺少轻链，尺寸较小、渗透性更好，在20 μg/mL浓度时与人食管鳞癌细胞EC9706有明显的结合活性(P < 0.05)，但还是比阳性对照B6H12鼠单克隆抗体的结合活性低的多，大约是其六分之一。席等[32]用DNA合成法制备了抗CD47单链抗体B6H12-scFv，该抗体能与真核细胞膜表面的CD47-Fc重组蛋白结合，浓度在50 μg/ml时具有与人食管鳞癌细胞EC9706表面CD47的结合活性并且呈浓度依赖性，在体外可以抑制CD47-Fc与SIRP-His的结合且呈剂量依赖性，他们[33]随后用人食管鳞癌细胞EC9706建立皮下裸鼠模型，用B6H12-scFv治疗，最后发现其与注射杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, DPBS)的空白组无显著差异(P > 0.05)，这可能是因为制备的单链抗体与CD47的结合活性还是较弱或抗体没有糖基化位点导致在体内代谢时间过短，后续他们还要继续探索。

Figure 1. The CD47 on the cell membrane of esophageal cancer cells binds to SIRPα on the membrane of macrophages

图1. 食管癌细胞膜上CD47与巨噬细胞膜上SIRPα结合

5. 总结与讨论

综上所述，CD47-SIRPα在食管癌组织中的表达类似于血液系统肿瘤和乳腺癌等实体瘤[34] [35] (图1)，CD47与SIRPα相比正常组织升高，但不同种类食管癌细胞表达CD47的量不同，TE-8细胞表达最高。CD47-SIRPα信号轴在食管癌中的作用机制也是抑制巨噬细胞和中性粒细胞吞噬癌细胞，高CD47或高SIRPα两者都是食管癌患者预后不良的因素，CD47蛋白可作为预后不良的预测标志物之一。此外，抗CD47抗体与顺铂等化疗药物联合使用时可以改善化疗药物抵抗，增加治疗效果；与抗PD-1、抗CTLA-4抗体等免疫治疗药物联合使用效果也更好。最后，可以预见，随着更多试验的开展，食管癌抗CD47-SIRPα轴免疫治疗药物将会出现在临床，供患者选择。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。