1. 引言
结直肠癌是全球范围内发病率和死亡率排名第三和第二的恶性肿瘤[1]。在中国，结直肠癌位居第二大常见癌症，也是癌症相关死亡的第五大原因，且呈现上升趋势，严重威胁居民健康[2]。低分化结直肠癌通常伴随更具侵袭性的病理特征、较差的治疗反应和不良的预后，而高分化结直肠癌则往往预后较好[3]。因此，在临床实践中，准确评估结直肠癌的分化程度对优化治疗方案和改善预后至关重要。
目前的研究表明，结直肠癌的分化受多种因素的影响。例如，DNA错配修复系统(MMR)缺陷导致的微卫星不稳定性(MSI)通常与分化良好的肿瘤相关，预示着较好的预后[4]。高水平的MSI (MSI-H)通常伴随较好的肿瘤分化[5]。此外，KRAS基因的特定突变与结直肠癌的分化水平密切相关，且可能影响肿瘤对某些治疗的反应[6]。BRAF V600E突变在结直肠癌中常见，通常与较差的分化和预后相关[7]。CpG岛的广泛甲基化常常导致肿瘤抑制基因的沉默，可能促使结直肠癌细胞的分化受限[8]。TP53基因突变与结直肠癌的分化程度相关，通常预示较差的预后[9]。此外，APC突变可能对癌细胞的分化产生影响[10]，而PIK3CA突变则可能与结直肠癌的分化水平及治疗反应相关[11]。
除了DNA甲基化之外，组蛋白修饰的变化以及非编码RNA的表达(如微RNA)也与结直肠癌的分化密切相关[12]。m6A甲基化作为真核mRNA中最常见的内部修饰，指的是腺苷残基在氮-6位置的甲基化，这一动态且可逆的过程在RNA代谢中发挥着重要作用，调控RNA的剪接、输出、稳定性及翻译[13]。在结直肠癌中，m6A甲基化已被证实是肿瘤发生和进展的关键因素，但其在结直肠癌分化中的具体作用尚不明确[14]。总的来说，深入理解m6A甲基化在结直肠癌中的复杂作用，不仅为肿瘤生物学提供了新的见解，也为靶向癌症治疗开辟了新的可能性。
2. 材料与方法
2.1. TCGA数据库分析
通过癌症基因组图谱计划(TCGA, https://portal.gdc.cancer.gov/)获取了结直肠癌中13个与m6A相关的基因的表达数据。使用R语言和Perl语言处理这些数据，生成这些基因的差异表达热图。
2.2. 荧光定量PCR分析
主要试剂：Reverse Transcriptase M-MLV (Takara)，2 × SYBR Green pro TaqHS Premix (艾科瑞)，10mM dNTP (TIANGEN)，RNase Inhibitor (Thermo Fisher Scientific)，RNase-free Water (TIANGEN)。
主要仪器：离心机(Thermo Fisher Scientific)，微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)，普通PCR仪(ABI)，荧光定量PCR仪(ABI 7900HT)。
Table 1. Primer design
表1. 引物设计
No. |
Target genes |
Primer |
Sequences |
Annealing temp (℃) |
Size (bp) |
1 |
YTHDF1 |
YTHDF1-F2 |
TCTGAAAAGCGGGCGTGT |
60 |
161 |
YTHDF1-R2 |
TGAAGAGCAGGTAGACGGGC |
2 |
YTHDF2 |
YTHDF2-F2 |
CTCACACTATGAGAAACGCCAAG |
60 |
350 |
YTHDF2-R2 |
CATTATGCTCTGAAATCACAACCA |
3 |
ALKBH5 |
ALKBH5-F2 |
GAGATGGACAAGGAAGAGAACCG |
60 |
223 |
ALKBH5-R2 |
AAAGGAGGGGCAACTACGTAAG |
4 |
WTAP |
WTAP-F1 |
GTAGACCCAGCG ATCAACTTGT3 |
60 |
109 |
WTAP-F2 |
GCGTAAACTTCCAGGCACTC |
5 |
GAPDH |
Homo GAPDH-For |
CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC |
60 |
121 |
Homo GAPDH-Rev |
GCCCAATACGACCAAATCCG |
实验过程，参考[15]。
根据临床病理结果，随机选择高分化、中分化和低分化各20名患者石蜡切片，260/280和260/230都在有效范围内，使用荧光定量PCR技术，测量癌组织和相邻非癌组织中YTHDF1、ALKBH5、YTHDF2和WTAP的mRNA表达水平，引物信息详见表1，各基因溶解曲线和扩增曲线均符合标准，结果计算参考∆∆CT法，∆CT = 目的基因CT值 − 内参基因CT值，内参基因为GAPDH。∆∆CT = (未知样本∆CT) − (对照样本∆CT)，Fold Change = 2(−∆∆CT)，Fold Change大于2显著上调，Fold Change小于0.5显著下调。红色标记为显著上调。以每组样本的癌旁组织为对照组，同组样本的癌组织与之比较；所有样本按高、中、低分为三组，以每组样本的癌旁组织为对照组，同组的癌组织与之比较。
2.3. 多变量Logistics回归分析
使用IBM SPSS Statistics 27软件进行多变量逻辑回归分析，评估正常、高分化、中分化和低分化阶段与四个基因的mRNA表达水平之间的相关性。
2.4. 免疫组化分析
我们选用了Abcam公司的抗体：Anti-WTAP抗体(EPR18744)，Anti-YTDHF2抗体(EPR23544-19)，Anti-WTAP抗体(EPR22349-16)，和Anti-ALKBH5抗体(EPR18958)。详细方法可参考
https://www.abcam.cn/ab195377。检测上述样本的癌组织和癌旁组织中对应蛋白表达。利用Image J和IHC_Toolbox软件计算平均光密度(AOD) (打开免疫组化图后，先将其转为8-bit灰度图，灰度值范围从0 (黑)到255 (白)，通过图中颜色深浅赋值。光密度值(OD值)与图像灰度值呈对数关系，DAB染色越深，OD值越高，蛋白表达量越多。操作步骤为：点击Analyze > Calibrate，选择Uncalibrated OD校准；设置测量参数(Area、Integrated Density等)；调整阈值使红色区域为阳性区域；点击Analyze > Measure导出数据，IntDen即为累积光密度值(IOD)，与蛋白总量成正比。通过AOD值进行统计学分析，比较实验组与对照组蛋白表达差异。ImageJ的下载地址：https:/imagej./ij/download)。
2.5. 多变量Cox回归分析
随机选择60名结直肠癌患者和50名健康个体，年龄、饮酒史、吸烟史和性别作为自变量，结直肠癌的有无作为因变量(无 = 0，有 = 1)。(该病例报道已获得伦理审批及免签知情同意书，伦理号：LLW-FO-401)通过IBM SPSS statistics 27进行多变量Cox回归分析(进入标准0.05，排除标准0.10)，以识别与结直肠癌发生相关的因素，基线数据如表2。
2.6. 结直肠癌分化程度与OS、TTP的关系
我们跟踪了这60名结直肠癌不同分化程度的患者超过三年，统计追踪了总生存率(OS)和疾病进展率(TTP)。
Table 2. Clinical baseline data of colorectal cancer patients and healthy individuals
表2. 结直肠癌患者和健康人临床基线数据
参数 |
高分化 |
中分化 |
低分化 |
健康组 |
年龄 |
61 ± 16.19 |
70.2 ± 16.76 |
77.6 ± 9.44 |
66 ± 15.58 |
性别 |
|
|
|
|
男 |
14 |
13 |
14 |
30 |
女 |
6 |
7 |
6 |
20 |
肿瘤位置 |
|
|
|
|
直肠 |
8 |
10 |
6 |
0 |
乙状结肠 |
4 |
2 |
4 |
0 |
右半结肠 |
8 |
6 |
2 |
0 |
左半结肠 |
0 |
0 |
2 |
0 |
直肠肛管处 |
0 |
2 |
2 |
0 |
回盲部 |
0 |
0 |
2 |
0 |
饮酒史 |
15 |
16 |
15 |
5 |
吸烟史 |
10 |
9 |
11 |
8 |
术后放化疗 |
6 |
10 |
19 |
0 |
3. 结果
3.1. TCGA数据库的结直肠癌癌症中m6A相关基因的表达谱
从TCGA数据库下载数据，并应用R和Perl语言编程来处理m6A相关基因的mRNA差异表达谱，结果如热图(图1)。
Figure 1. Analysis from the TCGA database reveals the differential expression heatmap of 13 m6A-related genes
图1. 来自TCGA数据库的分析揭示了13个m6A相关基因的差异表达热图
3.2. 结直肠癌不同分化阶段候选基因mRNA的表达
本研究采用荧光定量PCR方法，评估了四个候选基因YTHDF1、YTHDF2、ALKBH5和WTAP在以高、中、差分化为特征的组织样本中的mRNA表达水平。据观察，较低程度的分化与这些候选基因的mRNA表达增加相关(图2)。SPSS多变量Logistics分析显示YTHDF1、WTAP相关基因mRNA的表达水平与高、中、低分化进展之间存在相关性(表3)。
Figure 2. Quantitative real-time PCR analysis of YTHDF1, YTHDF2, ALKBH5, and WTAP expression in cancerous and adjacent normal tissues of colorectal cancer patients
图2. 荧光定量PCR分析结直肠癌患者癌症组织及癌旁组织中YTHDF1、YTHDF2、ALKBH5和WTAP的表达
Table 3. Multivariate logistic analysis of the correlation between the expression levels of related genes’ mRNA and the progression of low, medium, and high differentiation
表3. 多元Logistics分析相关基因mRNA的表达水平与低、中、高分化的进展相关性
指标 |
B |
S.E. |
Wald |
D.F. |
Sig. |
95% C.I for EXP(B) |
Lower |
Upper |
高分化 |
−0.754 |
0.552 |
1.865 |
1 |
0.172 |
−1.836 |
0.328 |
中分化 |
0.228 |
0.535 |
0.182 |
1 |
0.67 |
−0.82 |
1.276 |
低分化 |
0.94 |
0.548 |
2.943 |
1 |
0.086 |
−0.134 |
2.014 |
YTHDF1 |
1.174 |
0.153 |
1.279 |
1 |
0.0058 |
−0.127 |
0.474 |
YTHDF2 |
0.007 |
0.139 |
0.002 |
1 |
0.962 |
−0.265 |
0.278 |
ALKBH5 |
0.057 |
0.117 |
0.24 |
1 |
0.624 |
−0.173 |
0.288 |
WTAP |
−0.024 |
0.279 |
0.007 |
1 |
0.033 |
−0.571 |
0.524 |
3.3. YTHDF1和YTHDF2蛋白在癌症大肠癌组织中表达的免疫组织化学分析
随后，我们随机选择具有不同分化程度的结直肠癌癌症组织样本进行免疫组织化学染色，以检测YTHDF1和YTHDF2蛋白在肿瘤周围和癌组织中的表达(图3(A)和图3(B))。定量分析得出结论，YTHDF2蛋白表达水平反而是中分化程度中最高，高分化表达次之，低分化表达最低；随着分化程度由低到高，YTHDF1蛋白表达水平成反向趋势(图3(A)和图3(B))。
Figure 3. Immunohistochemical results of YTHDF1 and YTHDF2. Note: The immunohistochemical results of YTHDF1 are shown in Figure (A). The left side represents adjacent normal tissue, while the right side corresponds to colorectal cancer tissue. From top to bottom, the samples are from patients with highly differentiated, moderately differentiated, and poorly differentiated colorectal cancer. The immunohistochemical results of YTHDF2 are shown in Figure (B). Similarly, the left side represents adjacent normal tissue, and the right side corresponds to colorectal cancer tissue. From top to bottom, patients are classified as highly differentiated, moderately differentiated, and poorly differentiated. (NC: Adjacent normal tissue of colorectal cancer)
图3. YTHDF1和YTHDF2免疫组织化学结果。注：YTHDF1免疫组织化学结果如图(A)所示。左侧表示癌旁组织，右侧对应于结肠癌癌症组织。从上到下依次为高分化、中分化和低分化结肠癌癌症患者。YTHDF2免疫组织化学结果如图(B)所示。左侧表示癌旁组织，右侧对应于结肠癌癌症组织。从上到下，癌症患者分为高分化、中分化和低分化。(NC：结肠癌症癌旁组织)
3.4. 结直肠癌组织中ALKBH5和WTAP蛋白表达的免疫组织化学分析
同时，我们随机选择不同分化水平的人类癌症组织样本进行免疫组织化学染色，以评估ALKBH5和WTAP蛋白在肿瘤周围和癌组织中的表达(图4(A)和图4(B))。定量分析显示，随着分化水平的降低，WTAP蛋白表达水平降低，但ALKBH5蛋白表达在中分化最高，高分化和低分化表达量基本一致(图4(A)和图4(B))。
3.5. 免疫组织化学结果
使用Image J软件分析不同分化程度的病理切片的免疫组织化学结果(癌组织蛋白表达/癌旁组织蛋白表达)，研究发现YTHDF1蛋白表达水平与结直肠癌高、中、低分化等级之间存在显著负相关；WTAP蛋白的表达水平与结直肠癌高、中、低分化等级之间存在显著的正相关(表4和图5)。
Figure 4. Immunohistochemical results of ALKBH5 and WTAP. Note: The immunohistochemical results of ALKBH5 are shown in Figure (A). The left side represents adjacent normal tissue, while the right side corresponds to colorectal cancer tissue. From top to bottom, the samples are from patients with highly differentiated, moderately differentiated, and poorly differentiated colorectal cancer. The immunohistochemical results of WTAP are shown in Figure (B). Similarly, the left side represents adjacent normal tissue, and the right side corresponds to colorectal cancer tissue. From top to bottom, patients are classified as highly differentiated, moderately differentiated, and poorly differentiated. (NC: Adjacent normal tissue of colorectal cancer)
图4. ALKBH5和WTAP免疫组织化学结果。注：ALKBH5免疫组织化学结果如图(A)所示。左侧表示癌旁组织，右侧对应于结肠癌癌症组织。从上到下依次为高分化、中分化和低分化结肠癌癌症患者。WTAP免疫组织化学结果如图(B)所示。左侧表示癌旁组织，右侧对应结肠癌癌症组织。从上到下，癌症患者分为高分化、中分化和低分化。(NC：结肠癌症癌旁组织)
Table 4. Quantitative analysis of immunohistochemical protein results
表4. 定量分析免疫组化蛋白结果
基因 |
高分化(H) |
中分化(M) |
低分化(L) |
YTHDF1 |
1.159 ± 0.161 |
1.209 ± 0.013* |
1.406 ± 0.161* |
YTHDF2 |
0.895 ± 0.010 |
1.036 ± 0.131 |
0.744 ± 0.010 |
ALKBH5 |
1.043 ± 0.159 |
1.413 ± 0.155 |
1.045 ± 0.181 |
WTAP |
1.900 ± 0.184*a |
1.423 ± 0.045*a |
1.135 ± 0.090 |
注：YTHDF1中与高分化组对比，*p < 0.05，WTAP中与高分化对比*ap < 0.05。
3.6. YTHDF1和WTAP Go富集分析
将与结直肠癌分化相关的YTHDF1和WTAP基因输入Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich)，Go富集分析BP (Biological Process)、CC (Cellular Component)、MF (Molecular Function)。查阅文献我们猜测可能原因是参与以下生物信号转导：Regulation of mRNA metabolic process：mRNA的代谢过程，包括转录后的修饰和稳定性调控，直接影响结直肠癌细胞的增殖、分化和转移。异常的mRNA代谢会导致基因表达的不正常调控，进而影响肿瘤细胞的分化。mRNA methylation：mRNA甲基化(如m6A甲基化)在结直肠癌中起着重要作用，影响基因的翻译、稳定性及降解过程。m6A修饰与癌症相关的基因的表达密切相关，并可能影响癌细胞的分化状态。mRNA modification：mRNA的各种修饰(包括甲基化、假尿嘧啶化等)对基因表达有重要影响。这些修饰可能调节癌细胞的分化和肿瘤进展。Positive regulation of translational initiation：翻译起始的正向调节对于肿瘤细胞的增殖和分化非常重要。在结直肠癌中，翻译起始的调节可能影响肿瘤相关蛋白的表达，从而影响癌细胞的分化状态。mRNA destabilization：mRNA的不稳定性(如通过RNA降解途径)可以影响癌细胞内特定基因的表达，进而影响癌症的分化。例如，某些癌基因通过增加mRNA的不稳定性被过度表达，促进癌细胞的去分化。RNA destabilization：RNA的不稳定性同样影响mRNA的半衰期和转录后的调控，这可能导致癌症相关基因的失调，从而影响结直肠癌的分化。Positive regulation of mRNA catabolic process：正向调节mRNA的降解过程可以在特定情况下通过调控癌基因表达来影响细胞分化。过度的mRNA降解可能会干扰正常的基因表达，促使癌细胞去分化。Methyltransferase complex：甲基转移酶复合物(如参与m6A甲基化的复合物)直接影响RNA的修饰，这对于肿瘤细胞的增殖和分化至关重要。其在结直肠癌中的调控作用可能影响癌细胞的分化特征。上述调控主要涉及mRNA修饰、翻译调控及RNA稳定性等方面参与结直肠癌分化。
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Figure 5. GO enrichment analysis of YTHDF1 and WTAP
图5. YTHDF1和WTAP GO富集分析
3.7. 多变量Cox回归分析
随机选择60名结直肠癌患者和50名健康人，以年龄、饮酒史、吸烟史和性别为自变量，以是否患有结直肠癌为因变量(否 = 0，是 = 1)。进行多变量Cox回归分析(进入标准为0.05，排除标准为0.10)，以确定与结直肠癌癌症发生相关的因素。分析表明，年龄和饮酒史可能是影响癌症发病率的重要因素，而性别、吸烟史似乎无关(表5)。
Table 5. Multivariate cox regression analysis of the correlation between age, gender, alcohol consumption, smoking, and colorectal cancer incidence
表5. 年龄、性别、饮酒、吸烟与结直肠癌癌症发病率相关性的多因素Cox回归分析
指标 |
B |
S.E. |
Wald |
D.F. |
Sig. |
Exp(B) |
95% C.I. for EXP(B) |
Lower |
Upper |
年龄 |
0.117 |
0.034 |
11.495 |
1 |
0.001 |
1.124 |
1.051 |
1.202 |
饮酒史 |
20.945 |
10889.329 |
0 |
1 |
0.008 |
1,248,174,098 |
0 |
0 |
吸烟史 |
20.218 |
9867.036 |
0 |
1 |
0.998 |
603607783.3 |
0 |
0 |
性别 |
1.035 |
0.797 |
1.687 |
1 |
0.194 |
2.815 |
0.591 |
13.42 |
3.8. 肠癌分化程度与OS、TTP的关系
回顾性分析60名不同分化程度的结直肠癌患者超过三年时间，追踪了OS和TTP。观察结果显示，低分化结直肠癌患者OS率达到0%，高分化和低分化OS率为100%；高分化组TTP发生率为10%，而中分化癌症患者的TTP为0%，低分化组发生率100% (见表6)。
Table 6. Statistical analysis of OS and TTP incidence based on the differentiation degree of colorectal cancer
表6. 基于结直肠癌症分化程度OS和TTP发生率的统计分析
指标 |
死亡/总数(死亡率%) |
TTP (%) |
高分化 |
0/20 (0) |
2/20 (10) |
中分化 |
0/20 (0) |
0/20 (0) |
低分化 |
20/20 (100) |
20/20 (100) |
4. 讨论
本研究深入探讨了RNA甲基化相关关键基因(YTHDF1、YTHDF2、ALKBH5和WTAP)在不同人群中对结直肠癌(CRC)的作用。结果表明，这些基因在CRC的西方人群中mRNA水平差异化显著，提示RNA甲基化可能是CRC发病和进展中的关键机制，并可能影响患者的生存预后。然而，在中国丽水市人群的研究中，YTHDF1和WTAP的mRNA水平仅与CRC的分化程度呈显著相关性，而YTHDF2和ALKBH5未显示相关性。这种差异可能反映了区域性或种族特异性差异，突出了遗传多样性和环境因素在癌症生物学中的重要性。
进一步分析发现，在丽水队列中，YTHDF1和WTAP蛋白的表达水平与CRC分化程度分别呈负相关和正相关，提示其在转录调控和蛋白翻译调控中的表达水平可能具有一致性。特别是这两个基因在不同分化程度的肿瘤中的差异表达，表明它们可能作为CRC侵袭性和预后的潜在生物标志物。这一发现为CRC患者分化程度的精准评估提供了新的分子依据，并可能为个性化治疗方案的制定提供指导。同时我们GO富集分析表明，YTHDF1和WTAP可能通过参与mRNA修饰[16]、翻译调控[17]和RNA稳定性[18]等机制，进而调控结直肠癌的分化过程。
此外，我们的研究还强调了年龄和饮酒史作为CRC发病的关键风险因素，这与既往研究基本一致。饮酒已被广泛认为是CRC的高风险因素之一[19]，而年龄作为癌症发展的重要风险因素也再次得到验证[20] [21]。相较之下，性别和吸烟习惯在本研究中并未显示显著关联。这些结果促使我们进一步探索CRC中与年龄和饮酒相关的遗传及表观遗传改变。
值得注意的是，我们观察到疫情期间免疫系统损伤和并发症加重可能影响分化差的CRC患者的TTP和OS，其三年内OS发生率0%，TTP发生率100%。这表明疫情的特殊背景可能加剧了疾病进程，强调了在类似情境下关注分化差CRC患者的特殊需求以及量身定制治疗策略的重要性。
尽管本研究为RNA甲基化在CRC分化和预后中的作用提供了重要见解，但仍存在一些局限性。首先，本研究为单中心、小样本研究，可能存在样本偏倚。其次，疫情期间的特殊影响可能对患者的免疫状态和疾病进程产生干扰。因此，未来研究需要联合多中心和更大样本量，以验证这些发现的普适性。此外，还应深入探索YTHDF1和WTAP在CRC分化中的具体分子机制，进一步评估其作为生物标志物在多样化人群中的临床应用潜力。
综上所述，本研究揭示了RNA甲基化基因YTHDF1和WTAP在CRC中的潜在作用，并为不同人群中基于遗传变异的个性化医疗提供了新的视角。这些发现为CRC的早期诊断和治疗策略优化提供了重要线索，同时也为未来的深入研究奠定了基础。
基金项目
丽水市公益性技术应用研究项目(2022GYX25)。
NOTES
*通讯作者。