基于多数据库分析SCN7A在肺腺癌中的表达及意义

Expression and Significance of SCN7A in Lung Adenocarcinoma Based on Multi-Database Analysis

摘要: 目的：通过生物信息学的方法分析电压门控钠通道α亚基7 (Sodium Voltage-Gated Channel Alpha Subunit 7, SCN7A)基因在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)和邻近非癌组织中的差异表达，探讨其与肺腺癌患者临床病理特征和预后的相关性，分析其可能调控的信号通路和在肿瘤免疫微环境中的作用，并通过细胞实验验证SCN7A在肺腺癌细胞中的生物学功能。方法：从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库和基因型组织表达(Genotype-Tissue Expression, GTEx)数据库下载并整理33种肿瘤患者的基因表达数据进行SCN7A泛癌分析。利用TCGA数据库探讨SCN7A基因在肺腺癌及正常肺组织中的表达差异情况，并使用临床样本qRT-PCR对结果进行验证。ROC曲线评估SCN7A的诊断价值。从人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas, HPA)数据库下载LUAD患者及健康人群免疫组织化学数据。Cox回归分析寻找LUAD独立预后因素。临床相关性分析揭示SCN7A与LUAD患者临床病理特征的相关性。采用Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析。通过功能注释工具分析SCN7A及其互作基因的功能。通过肿瘤免疫系统相互作用数据库(Tumor Immune System Interaction Database, TISIDB)分析SCN7A与肺癌肿瘤免疫浸润之间的关系。体外培养人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549、H1395、H1975，qRT-PCR检测以上4株细胞中SCN7A的表达。构建SNC7A过表达质粒，转染至A549细胞中。采用cell counting kit8 (CCK8)、划痕试验、Transwell方法检测SCN7A基因过表达对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果：SCN7A在肺腺癌中的表达显著低于正常肺组织(P < 0.001)，并与T分期、病理分级、总生存期(OS)等临床病理特征呈负相关(P < 0.05)。Cox回归分析发现SCN7A低表达是影响LUAD预后的独立危险因素(P < 0.05)。SCN7A低表达的肺腺癌患者总生存期、首次进展时间显著缩短(P < 0.001)。功能富集分析提示SCN7A主要参与E2f targets、G2m checkpoint等相关通路(P < 0.001)。免疫浸润分析显示SCN7A表达水平与LUAD中肥大细胞(Mast cell)、树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Macrophages)、滤泡辅助性T细胞(TFH)浸润丰度相关(P < 0.001)。SCN7A在A549、H1395、H1975细胞中表达显著低于BEAS-2B细胞。过表达SCN7A后，A549细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低(P < 0.01)。结论：SCN7A低水平表达与LUAD患者的不良预后和免疫细胞浸润状况密切相关，其有望被确立为一种用于LUAD诊断和治疗的新型生物标志物。

Abstract: Objective: This study aimed to analyze the expression differences of Sodium Voltage-Gated Channel Alpha Subunit 7 (SCN7A) in lung adenocarcinoma (LUAD) and adjacent non-tumor tissues, investigating its correlation with the clinical pathological characteristics and outcomes of LUAD patients. It also analyzes the potential signaling pathways regulated by SCN7A and its role in the tumor immune microenvironment. The biological function of SCN7A in lung adenocarcinoma cells was investigated by cell experiments. Methods: Gene expression profiles of 33 tumor types were downloaded from the Human Protein Atlas (TCGA) database and Genotype-Tissue Expression (GTEx) databases for pan-cancer analysis of SCN7A. The expression difference of SCN7A gene in lung adenocarcinoma and adjacent normal tissues was investigated by using TCGA database, and the results were verified by qRT-PCR of clinical samples. ROC curve was employed to evaluate the diagnostic value of SCN7A. The immunohistochemical data of LUAD patients and healthy individuals were obtained from the Human Protein Atlas (HPA) database. Cox regression analysis was conducted to identify the independent prognostic factors. Clinical correlation analysis revealed the correlation between SCN7A and clinicopathological features of LUAD patients. Kaplan-Meier Plotter database was used for survival analysis. The function of SCN7A and its interacting genes was analyzed by functional annotation tools. The relationship between SCN7A and tumor immune infiltration in lung adenocarcinoma was analyzed through the Tumor Immune System Interaction Database (TISIDB). Human normal lung epithelial cells BEAS-2B, lung adenocarcinoma cells A549, H1395, H1975 were cultured in vitro. The expression of SCN7A in the above 4 cell lines was detected by qRT-PCR. SCN7A overexpression plasmid was constructed and transfected into A549 cells. The effects of SCN7A overexpression on the proliferation, migration and invasion of A549 cells were detected by Cell counting kit 8 (CCK8), scratch test and Transwell methods. Results: The expression of SCN7A in lung adenocarcinoma was significantly lower than in adjacent normal lung tissues (P < 0.001), and was negatively correlated with T stage, pathological grade, and overall survival (OS) (P < 0.05). Cox regression analysis revealed that low SCN7A expression was an independent risk factor for the prognosis of LUAD (P < 0.05). Patients with low SCN7A expression had a significantly reduced overall survival (OS) time and first progression (FP) time (P < 0.001). Function enrichment analysis suggested that SCN7A mainly participates in E2f targets, G2m checkpoint, etc. related pathways. Immune infiltration analysis showed that SCN7A expression correlated with mast cell, dendritic cell, macrophage, and follicular helper T cell infiltration in LUAD. The expression of SCN7A in A549, H1395 and H1975 cells was significantly lower than in BEAS-2B cells. After overexpression of SCN7A, proliferation, migration and invasion of A549 cells were significantly decreased (P < 0.01). Conclusion: The low expression level of the SCN7A gene is closely associated with poor prognosis and immune cell infiltration in lung adenocarcinoma patients, suggesting its potential to be established as a novel biomarker for the diagnosis and treatment of lung adenocarcinoma.

1. 背景

肺癌是全球范围内癌症相关死亡的首要原因之一[1]，其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的大多数，非小细胞癌又分为腺癌、鳞癌以及大细胞癌[2]。在这些类型中，肺腺癌约占40%~55%，在许多国家已经超过肺鳞癌成为最常见的肺癌病理类型。目前临床上对于肺癌主要治疗手段包括手术切除、放疗、化疗、分子靶向、免疫治疗[3]。尽管手术治疗仍是早期肺癌的主要治疗策略，但大量患者初诊时即已被诊断为晚期，丧失了手术根治的机会。因此，对肺癌进展的分子机制进行研究尤为关键，将有助于肺癌的早期检测与治疗。

电压门控钠通道(VGSC)家族由一个跨膜糖蛋白家族组成，这些蛋白通过调节Na⁺离子进入细胞膜的通量，从而在可兴奋细胞中产生和传播动作电位来产生电信号[4]。结构分析表明，VGSCs由较大的成孔α亚基和较小的辅助β亚基共同构成。哺乳动物基因组包含编码10个不同α亚基的基因(SCNnA)和5个不同β亚基的基因(SCNnB) [5]。既往研究报道，在胃癌、食管癌、肝细胞癌、直肠癌等多种肿瘤中SCN7A表达水平与肿瘤分期及疾病预后相关[6]-[12]，表明该基因作为肿瘤生物标志物的潜在作用。但是SCN7A在肺腺癌中是否能够作为预后标志物，及其表达水平对肺腺癌生物学功能的影响，值得进一步思考和探究。

2. 材料与方法

2.1. 一般材料

2.1.1. 基因表达数据及临床信息

UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)经Toil流程(Vivian J et al., 2017)统一处理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq数据，进行log2变换，提取33种癌症类型对应的TCGA的数据和GTEx中对应的正常组织数据，其中包括515例肺腺癌样本，347例正常肺组织样本(TCGA癌旁样本59例，GTEx正常样本288例)。肺腺癌患者相关的临床数据来源于TCGA数据库。

2.1.2. 免疫组化数据

肺腺癌和正常肺组织免疫组化数据来自HPA数据库(https://www.proteinatlas.org)。

2.1.3. 临床标本

收集2022年至2024年北京大学深圳医院28例肺术前未接受化疗和放疗的肺腺癌患者的肿瘤组织及邻近正常组织样本，所有标本均经本院病理科证实，所有患者均获得知情同意。

2.1.4. 细胞及主要试剂

BEAS-2B、A549、H1395、H1975细胞株购自武汉多莱秘生物科技公司，RNA抽提试剂盒购自上海飞捷公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录试剂盒购自东洋纺公司，SYBR High-Sensitivity qPCR SupermixqPCR试剂盒购自近岸蛋白公司，DMEM细胞培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，FBS胎牛血清购自内蒙古奥普赛生物科技有限公司，CCK-8试剂盒(细胞增殖及毒性检测试剂盒)购自北京索莱宝科技有限公司，4% PFA组织细胞固定液购自中国医药集团有限公司，结晶紫染色液购自碧云天生物，PBS缓冲液购自Biosharp。

2.2. 方法

2.2.1. 基因表达分析

采用Mann-Whitney U检验进行分组比较，采用配对样本T检验进行配对样本分析，用ggplot2包对数据进行可视化。

2.2.2. 临床病理特征相关性分析

从TCGA数据库下载539例LUAD患者的临床病理信息和基因表达数据。按性别、年龄、吸烟、TNM分期、病理分级、总生存期(OS)、疾病特异生存期(DSS)进行分组。将539例样本按SCN7A表达中位数分为高低表达组，用stats包分析SCN7A表达与LUAD患者临床病理特征之间的相关性，用ggplot2包对数据进行可视化。

2.2.3. 基因表达与肺腺癌诊断及预后的关系

使用pROC包进行对配对样本进行受试者操作特征(ROC)曲线分析，结果用ggplot2进行可视化，评估SCN7A表达对区分肿瘤和正常样本的有效性。使用Kaplan-Meier Plotter数据库(https://kmplot.com)分析SCN7A在LUAD患者中的预后价值。根据中位表达水平将患者分为高低表达两组，分析SCN7A对LUAD患者总生存期(OS)和首次进展时间(FP)的影响。使用survival和rms包，通过单因素和多因素Cox回归分析评估SCN7A表达是否作为LUAD的独立预后因素。

2.2.4. 目标基因的差异分析和差异基因的富集分析

根据SCN7A表达中位数，将样本分为SCN7A高和低表达组，利用差异分析找到SCN7A高低表达组之间具有差异的基因。过滤条件为$\left|\text{log}2\text{FC}\right|>1.5$ 且P < 0.001，得到显著差异基因，ggplot2包对结果进行可视化。通过基因本体(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)分析共表达基因在通路上的表达情况。富集结果的FDR阈值设置为0.05，ClusterProfiler包执行，ggplot2R包进行可视化。

2.2.5. 免疫相关细胞浸润评估

利用GSVA包中提供的ssGSEA算法比较SCN7A高低表达组之间免疫细胞浸润水平的差别，利用Spearman法分析SCN7A表达水平与不同免疫细胞的相关性，用ggplot2包对结果进行可视化。

2.2.6. 细胞培养与转染

A549细胞使用含10% FBS的DMEM培养基(Procell, PM150210B)，1% PS (青霉素，链霉素，merck，TMS-AB2)进行培养。A549细胞铺到细胞培养板，当细胞密度达到70%时使用lipo2000 (Invitrogen, 11668027)转染SCN7A过表达质粒。取1ug质粒加入到50 ul opti-MEM medium，混匀静置5 min，取2 ul lipo2000加入到50 ul opti-MEM medium，混匀静置5 min。随后将混匀的质粒和lipo2000混合，室温静置10 min。混匀后的质粒-lipo2000混合物加入到细胞培养板，转染4 h后换含10% FBS的DMEM培养基培养细胞。

2.2.7. 总RNA提取及qRT-PCR

使用离心柱式提取总RNA，反转录获得互补DNA (cDNA)，并通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)获得表达数据。GAPDH为内参基因。引物：H-SCN7A-F：agttttggctgggccttatt，H-SCN7A-R：ataggccatggcaagtatgc。

2.2.8. CCK8实验

分别取2组细胞，胰酶消化后计数铺96孔板，每孔1000个，放入37℃ CO₂培养箱中培养；待细胞贴壁后，按细胞分组分别处理细胞0 h、24 h、48 h、72 h；每孔加入10 μl CCK8溶液，将培养板放入培养箱中孵育1~2 h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2.2.9. Transwell迁移实验

分别取2组细胞，用无血清的DMEM重悬制备成细胞悬液，血球计数板计数；取上述1 × 10⁴个细胞接种至上室，下室接种含有10% FBS的DMEM培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中进行培养；24小时后弃掉培养基，PBS清洗一次；用4%的多聚甲醛固定15 min；结晶紫染色20 min，用PBS清洗，在显微镜下拍照。

2.2.10. 划痕实验

分别取2组细胞，接种约5 × 10⁵个细胞至6孔板；次日贴壁后用枪头比着直尺在孔中划线；用PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，加入新鲜的基础培养基；放在37℃、5% CO₂培养箱中培养；0 h、24 h在显微镜下拍照记录。

3. 结果

3.1. SCN7A在泛癌和肺腺癌中的表达水平

我们借助TCGA和GTEx数据库评估SCN7A在33种常见类型肿瘤和对应正常组织中的表达水平，结果如图1(A)所示。SCN7A在26种肿瘤中呈显著性差异表达。其中，SCN7A在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD、ESCA及UCS等23种肿瘤中呈显低表达；而在UCEC、GBM、LGG、THYM 3种肿瘤中呈显著高表达。收集来自GTEx和TCGA数据库的总计347例正常肺组织样本(GTEx288例、TCGA59例)，以及来自TCGA数据库的515例肺腺癌样本。通过比较可以发现，肺腺癌组织中SCN7A表达量明显低于正常肺组织(P < 0.001) (图1(B))。同样，比较来自TCGA数据库中肺腺癌与其配对的癌旁正常肺组织中SCN7A的表达水平，结果与非配对样本结果一致，SCN7A在肿瘤样本中的表达显著下降(P < 0.001) (图1(C))。随后绘制受试者工作特征曲线，结果显示曲线下面积为0.976 (图1(D))，这提示SCN7A表达水平对于LUAD患者的诊断有一定的准确性，可能是LUAD的一个诊断标志物。

为了验证上述结果，我们收集了从2022年9月至2024年4月在北京大学深圳医院胸外科手术切除的28对肺腺癌肿瘤组织及其相匹配的癌旁组织，结果显示，肺腺癌组织中SCN7A的表达显著降低(图1(E))。在细胞水平上，qRT-PCR检测SCN7A在A549、H1395、H1975细胞中的表达明显低于BEAS-2B细胞(图1(F))。同时，我们使用HPA数据库提供的免疫组化结果进一步确认了肺腺癌中SCN7A的低表达(图1(G))。

3.2. 肺腺癌患者SCN7A表达与临床病理特征的关系

如表1所示，从TCGA数据库获取539例肺腺癌患者的临床信息和基因表达数据，根据SCN7A的中位表达水平作为临界值，将肺腺癌患者分为SCN7A低表达组(n = 269)和高表达组(n = 270)。结果显示，SCN7A表达与性别、T分期、总生存期有关(P < 0.05)，与年龄、吸烟、N分期、M分期、总分期、疾病特异生存期无显著相关性(P > 0.05) (表1)。男性肺腺癌患者的SCN7A表达量较女性患者低(P < 0.01)，T2期肺腺癌SCN7A表达量较T1期低(P < 0.001)，III期和IV期肺腺癌SCN7A表达量较I期和II期低(P < 0.05)，但不同年龄、N分期、M分期分组间SCN7A的表达量无统计学差异(P > 0.05) (图2(A)~(F))。同时，单变量逻辑回归分析的结果如表2所示，SCN7A在肺腺癌中低表达与性别(男vs女，OR = 0.653)、肿瘤T分期(T2 vs T1, OR = 0.535)、病理分期(III, IV vs I, II, OR = 0.609)显著相关(P < 0.05)。这些结果提示，SCN7A低表达的肺腺癌更容易进展到晚期。

(A) TCGA和GTEx数据库中SCN7A在常见类型肿瘤和正常组织中的表达水平。(B) SCN7A在肺腺癌和正常组织中的表达水平。(C) SCN7A在肺腺癌和配对的邻近正常组织中的表达水平。(D) SCN7A在肺腺癌中的诊断价值。(E) qRT-PCR检测28对肺腺癌组织及相应正常组织中SCN7A的表达。(F) qRT-PCR检测BEAS-2B、A549、H1395、H1975中SCN7A的表达水平。(G) HPA数据库中肺腺癌和正常组织中SCN7A免疫组化染色图。

Figure 1. Expression of SCN7A in tumor and normal tissues

图1. SCN7A在肿瘤和正常组织中的表达水平

Table 1. The relationship between SCN7A expression and the clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

表1. SCN7A表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系

Characteristics	Low expression of SCN7A	High expression of SCN7A	P value
n	269	270
Gender, n (%)			0.014
Female	130 (24.1%)	159 (29.5%)
Male	139 (25.8%)	111 (20.6%)
Age, n (%)			0.220
≤65	135 (26%)	122 (23.5%)
>65	124 (23.8%)	139 (26.7%)
Race, n (%)			0.131
Asian	5 (1.1%)	3 (0.6%)
Black or African American	33 (7%)	22 (4.7%)
White	191 (40.5%)	218 (46.2%)
Pathologic T stage, n (%)			0.014
T1	71 (13.2%)	105 (19.6%)
T2	163 (30.4%)	129 (24.1%)
T3	24 (4.5%)	25 (4.7%)
T4	9 (1.7%)	10 (1.9%)
Pathologic N stage, n (%)			0.141
N0	167 (31.9%)	183 (35%)
N1	52 (9.9%)	45 (8.6%)
N2	46 (8.8%)	28 (5.4%)
N3	1 (0.2%)	1 (0.2%)
Pathologic M stage, n (%)			0.340
M0	183 (46.9%)	182 (46.7%)
M1	15 (3.8%)	10 (2.6%)
Pathologic stage, n (%)			0.087
Stage I	136 (25.6%)	160 (30.1%)
Stage II	65 (12.2%)	60 (11.3%)
Stage III	50 (9.4%)	34 (6.4%)
Stage IV	16 (3%)	10 (1.9%)

Table 2. Logistic regression analysis of SCN7A expression and related clinical pathological features

表2. SCN7A表达与相关临床病理特征的逻辑回归分析

Characteristics	Total (N)	OR (95% CI)	P value
Age (>65 vs. ≤65)	520	1.240 (0.879~1.750)	0.220
Gender (Male vs. Female)	539	0.653 (0.464~0.918)	0.014
Pathologic T stage (T2 vs. T1)	468	0.535 (0.366~0.782)	0.001
Pathologic N stage (N1 vs. N0)	447	0.790 (0.503~1.240)	0.305
Pathologic M stage (M1 vs. M0)	390	0.670 (0.293~1.531)	0.343
Pathologic stage (Stage III & Stage IV vs. Stage I & Stage II)	531	0.609 (0.398~0.933)	0.023

(A) SCN7A表达水平和性别之间的关系；(B) SCN7A表达水平和年龄之间的关系；(C) SCN7A表达水平和T分期之间的关系；(D) SCN7A表达水平和N分期之间的关系；(E) SCN7A表达水平和M分期之间的关系；(F) SCN7A表达水平和病理分期之间的关系。

Figure 2. Relationship between SCN7A expression and clinical features in LUAD patients

图2. 肺腺癌患者SCN7A的表达水平与临床特征之间的关系

3.3. SCN7A在肺腺癌中低表达提示预后不良

为了探讨SCN7A表达与肺腺癌患者预后的相关性，我们根据SCN7A表达水平将肺腺癌患者分为高表达组和低表达组。如图3所示，肺腺癌患者中SCN7A低水平表达与较差的FP、和OS。Cox回归单因素分析结果显示，T分期、N分期、M分期、总分期、SCN7A的表达水平与肺腺癌患者的不良预后显著相关(P < 0.05，表3)；而多因素分析表明，在这些影响因素中，SCN7A的表达水平是导致肺腺癌患者不良预后的独立影响因素(P < 0.05，表3)。以上结果表明，SCN7A的表达水平是LUAD一个独立的预后标志物，其低表达与LUAD的预后不良有关。

(A) OS总生存期；(B) FP首次进展时间。

Figure 3. Kaplan-Meier curve of SCN7A high and low expression groups in LUAD patients

图3. 肺腺癌患者SCN7A高低表达组的KM生存曲线

Table 3. Cox regression analysis of the relationship between overall survival and clinical pathological characteristics in patients with lung adenocarcinoma

表3. Cox回归分析肺腺癌患者总生存期与临床病理特征的关系

Characteristics	Total (N)	Univariate analysis		Multivariate analysis
		Hazard ratio (95% CI)	P value	Hazard ratio (95% CI)	P value
Age	520
≤65	257	Reference
>65	263	1.216 (0.910~1.625)	0.186
Gender	530
Female	283	Reference
Male	247	1.087 (0.816~1.448)	0.569
Pathologic T stage	527
T1 & T2	461	Reference		Reference
T3 & T4	66	2.352 (1.614~3.426)	<0.001	1.884 (1.174~3.024)	0.009
Pathologic N stage	514
N0	345	Reference		Reference
N1 & N2 & N3	169	2.547 (1.904~3.407)	<0.001	1.966 (1.338~2.888)	<0.001
Pathologic M stage	381
M0	356	Reference		Reference
M1	25	2.176 (1.272~3.722)	0.005	1.270 (0.665~2.425)	0.469
Pathologic stage	522
Stage I & Stage II	415	Reference		Reference
Stage III & Stage IV	107	2.710 (1.994~3.685)	<0.001	1.533 (0.938~2.503)	0.088
SCN7A	530
High	266	Reference		Reference
Low	264	1.371 (1.027~1.829)	0.032	1.446 (1.030~2.029)	0.033

3.4. SCN7A的差异基因分析与富集分析

根据SCN7A高低表达组进行差异基因分析，以P值<0.001，$\left|\text{log}2\text{FC}\right|>1.5$ 筛选差异表达基因(图4(A))，并显示与SCN7A呈正负相关的前70个差异基因(图4(B))。GO富集分析发现，SCN7A表达相关基因主要功能富集在“微管束的形成”、“含胶原蛋白的细胞外基质”、“信号受体激活剂活性”等生物学过程(图4(C))。KEGG通路分析显示，SCN7A表达相关基因主要参与了“神经活性配体-受体相互作用”、“补体和凝血级联”、“细胞周期”等信号通路(图4(D))。GSEA富集分析显示SCN7A低表达组主要富集在“E2f Targets”、“G2m Checkpoint”、“Mtorc1 Signaling”、“MYC Targets”信号通路(图5(A)~(D))。表明这些途径可能与SCN7A相关的基因调节有关。

3.5. SCN7A表达与免疫细胞浸润之间的关系

首先将TCGA数据集中的LUAD患者根据SCN7A表达量分为高表达和低表达两组。随后，对两组中24种免疫细胞亚型的表达水平差异进行了评估。与SCN7A低表达组相比，SCN7A高表达组的肥大细胞(Mast cell)、树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Macrophages)、滤泡辅助性T细胞(TFH)和其他免疫细胞浸润水平明显更高(图6(A))。同时，我们观察到上述24种免疫细胞有18种与SCN7A表达呈正相关(图6(B))。针对与SCN7A的表达显著相关的免疫细胞绘制相关性的散点图，进一步证明肥大细胞、树突状细胞、巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞的浸润丰度与SCN7A表达水平呈正相关(图6(C)~(F))。

3.6. 过表达SCN7A抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

对不同肺腺癌细胞系中SCN7A表达量的检测结果显示，与细胞系H1395、H1975相比，SCN7A在肺腺癌细胞系A549中的表达量相对最低(图1(F))。在肺腺癌细胞A549中过表达SCN7A，RT-qPCR结果显示，与对照组(OE-NC)相比，实验组(OE-SCN7A) SCN7A的表达水平显著增高(图7(A))。细胞功能检测结果显示：与OE-NC组相比，过表达SCN7A不仅降低了肺腺癌细胞A549的细胞活力(图7(B))，还使肺腺癌细胞SCN7A的细胞迁移数量和伤口愈合速度降低(图7(C)，图7(D))。即过表达SCN7A可以抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

(A) 差异基因的火山图；(B) 相关性前70的差异基因热图；(C) 差异基因GO富集分析；(D) 差异基因KEGG富集分析。

Figure 4. SCN7A-related differentially expressed genes (DEGs) and functional enrichment analysis of SCN7A in LUAD using GO and KEGG

图4. 肺腺癌患者SCN7A高低表达组之间的差异基因及GO/KEGG富集分析柱状图

(A) E2f靶点通路；(B) G2m检查点通路；(C) Mtorc1信号通路；(D) MYC信号通路。

Figure 5. Gene set enrichment analysis (GSEA) of DEGs

图5. 差异基因GSEA富集分析

(A) 24种不同类型免疫细胞在SCN7A高低表达的肺腺癌肿瘤样本中的浸润水平；(B) SCN7A表达水平和不同类型免疫细胞之间的相关性；(C)~(F) SCN7A表达与滤泡辅助性T细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润丰度的相关性图。

Figure 6. Relationship between SCN7A expression and immune infiltration of LUAD

图6. SCN7A表达水平与LUAD免疫浸润之间的关系

(A) 实验组OE-SCN7A与对照组OE-NC中SCN7A的表达水平；(B) 通过CCK-8实验测定2组细胞的增殖能力；(C) 通过Transwell实验测定2组细胞的侵袭能力；(D) 通过划痕实验测定2组细胞的迁移能力。

Figure 7. Overexpression of SCN7A inhibits the proliferation, invasion, and migration ability of LUAD tumor cells

图7. SCN7A过表达会抑制LUAD肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力

4. 讨论

肺腺癌是肺癌中最常见的类型，且近年来发病率越来越高，具有复发率高、预后差的特点。由于早期的肿瘤并没有明显的临床症状，许多肺腺癌患者在早期很难被发现，这给肺腺癌患者的早期诊断和制定最佳治疗方案带来了挑战。LUAD目前的治疗手段包括手术、放疗、化疗及分子靶向治疗，但许多LUAD患者就诊时已为晚期，失去了手术治疗的机会[13]。分子靶向治疗为这部分晚期患者提供了较好的治疗方案，明显提高了患者的生存率[14]。但近年来，分子靶向药物耐药性逐渐升高，因此寻找新的针对LUAD诊断、预后、治疗的生物标志物尤为重要。

对大样本的肿瘤和正常组织进行差异基因的表达分析，有助于发现新的肿瘤生物标志物。因此，本研究通过TCGA数据库分析了LUAD组织和癌旁组织存在差异表达的基因，发现SCN7A在LUAD组织中的表达量显著低于正常肺组织。且SCN7A在乳腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌等恶性肿瘤中的表达均下调[6]-[12]。SCN7A是电压门控钠通道家族成员，编码的电压门控钠通道为Nax。在可兴奋细胞中，电压门控钠通道对于细胞膜去极化后动作电位的产生和传播至关重要。但与其他电压门控钠通道不同的是，Nax不具备电压门控的特性，而是一种特异性的钠离子传感器[15]。Li等发现，SCN7A在胃癌中的表达下调，但SCN7A低表达与胃癌的肿瘤突变复合增高有关，较高的肿瘤突变负荷意味着暴露更多的新抗原，更容易触发T细胞依赖性免疫反应以抑制肿瘤发展，从而改善患者的生存预后[6]。但Yan等发现，在肝细胞癌中，SCN7A的高表达与患者更好的预后有关，且通过富集分析发现SCN7A可能通过激活PI3K-Akt通路来促进肿瘤的进展[9]。

本研究借助TCGA数据库资源，运用生物信息学手段分析了SCN7A在包括LUAD在内的多种癌症类型中的表达情况，发现SCN7A在大部分肿瘤中存在表达的下调，这与已有的研究一致。此外，在基因和蛋白水平上探究了LUAD和其毗邻正常组织间SCN7A表达量的差异，并通过qRT-PCR方法进行实验验证。通过绘制ROC曲线显示曲线下面积高达0.976，说明SCN7A表达量的高低能够很好地区分肿瘤和正常组织。进一步对肺腺癌患者临床特征和表达情况进行分析发现SCN7A表达与性别、Ｔ分期、病理分级、OS相关。深入的生存分析和预后评估显示，低表达SCN7A的LUAD患者总生存率低于高表达者。这些结果表明SCN7A可能是肺腺癌的一个潜在生物标志物。

为了进一步探究SCN7A在肺腺癌发生发展中可能存在的分子机制，我们对SCN7A高低表达组间的差异表达基因进行GO、KEGG、GSEA富集分析。GSEA富集分析显示，SCN7A低表达组显著富集的通路包括E2f targets、G2m checkpoint、Mtorc1 signaling、MYC targets。E2F转录因子(E2F)是一大类转录因子，是真核细胞周期、细胞凋亡和分化的关键调节因子。Zhang等报道，减数分裂核1 (MN1)通过与Kruppel样因子6 (KLF6)的竞争性结合，调节细胞周期进程，从而上调E2F1的转录，这一机制与肺腺癌(LUAD)的发展以及不良的临床预后密切相关[16]。G2M检查点通过监测DNA完整性和防止DNA受损细胞进展为有丝分裂，在保护基因组稳定性方面发挥着重要作用。G2M检查点通路的失调或中断可能对癌症的发展产生影响[17]。mTOR通路在细胞生长、代谢和蛋白质合成的调节中起着重要作用，尤其是在癌症中，mTOR通路过度激活后会促进细胞增殖和代谢，从而促进肿瘤的发生和进展。MYC是一个转录因子家族，可控制多种细胞过程，包括增殖、生长、DNA损伤修复、组蛋白修饰和代谢[18]。MYC是一种原癌基因，在调节细胞周期、DNA合成等方面发挥着重要作用，其扩增后会促进肿瘤细胞的生长和增殖[19]。综合上述结果，可以推断SCN7A可能作为一个抑癌基因，其表达水平下调可能通过调控细胞周期及DNA损伤修复等相关信号通路促进LUAD的发生发展。

近年来，越来越多的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞参与了肿瘤的发生发展，针对肿瘤免疫机制开发的治疗策略，即免疫治疗，已成肿瘤治疗的新兴支柱。肿瘤细胞的恶性生物学行为受到多方面的影响，包括肿瘤细胞内部的分子事件以及肿瘤微环境的生物学特性。TME的特征包括缺氧、代谢失调和免疫抑制，它能够通过多种复杂的机制打破机体对肿瘤免疫监视和免疫耐受之间的平衡，进而为肿瘤的生长提供有利条件[20]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)是TME的重要组成部分，被认为是评价肿瘤免疫治疗有效性的独立预测因子[21]。目前尚无SCN7A与肿瘤免疫微环境的研究，本文通过分析SCN7A表达与LUAD中免疫细胞浸润水平之间的关系，发现SCN7A表达水平与肥大细胞(Mast cell)、树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Macrophages)、滤泡辅助性T细胞(TFH)浸润水平正相关。肥大细胞通过释放IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、TGF-β、MCP-3、MCP-4、白三烯B4 (LTB4)和胰凝乳蛋白酶来促进炎症、抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡。树突状细胞是一种抗原呈递细胞(APC)，可以分别通过MHCI和MHCII分子呈递抗原来激活CD8+和CD4+ T细胞，从而激活抗肿瘤T细胞反应。此外，DC细胞通过产生CXCL9/10趋化因子来使效应T细胞迁移到肿瘤部位，DC细胞的缺失有助于肿瘤的免疫逃逸以及对免疫检查点阻断(ICB)的反应有限，这与本文的研究结果具有一致性[22]。既往研究证实，通过基因干预手段敲低巨噬细胞中Nav1.6的表达可显著抑制其足小体(podosomes)结构的形成，进而削弱巨噬细胞的定向迁移能力[23]。肺腺癌(LUAD)中SCN7A的低表达是否通过抑制相关免疫细胞的迁移功能，进而介导肿瘤免疫逃逸机制，仍有待通过深入的分子机制研究和细胞实验予以阐明。

尽管已经初步探索了免疫细胞在LUAD中与SCN7A表达量之间的关系，但未来仍需进一步研究不同类型免疫细胞在胃癌发病及预后中作用的机制。

此外，本研究通过试验进一步探讨了SCN7A的表达对LUAD肿瘤细胞生物学的影响。实验结果证实，肺腺癌细胞系中SCN7A的表达较正常细胞低，当肺腺癌细胞系中SCN7A过表达后，肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭水平较对照组降低。

综上所述，本研究利用生物信息学和临床样本证明SCN7A不仅在肺腺癌的诊断及预后评估中发挥着关键作用，而且还参与了肺腺癌的免疫调节。此外，本研究发现在肺腺癌细胞中过表达SCN7A后能使肿瘤的增殖、迁移、侵袭能力降低。因此，SCN7A有潜力成为肺腺癌的生物标志物和治疗靶点。但仍需对SCN7A功能做进一步探索，深入理解其在肺腺癌中参与的发病机制以及其在免疫和靶向治疗中的作用。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。