1. 引言
金线莲为兰科开唇兰属地生型多年生草本植物，是民间常用的珍稀草药，享有“药王”、“金草”等美称。金线莲以全草入药，性平、味甘，具有清热、凉血、解毒、祛风除湿的功效[1]。现代研究发现金线莲具有降低低密度脂蛋白的氧化易感性、清除活性氧等抗氧化活性[2] [3]。金线莲叶部中氨基酸含量较高，用于主治高血压、糖尿病、肾炎、急慢性肝炎、心脏病、肺炎等症。金线莲杆部中牛磺酸含量较高，对促进中枢神经系统生长发育功能、提高学习记忆能力及延缓衰老过程大脑发育等方面具有重要的调节作用[4]，并具有调节渗透压、稳定细胞膜、增强机体免疫和视力等生理功能[5]。金线莲的种子发芽率低，生长繁殖也较为缓慢，近年来掠夺式的开采使金线莲生长的栖息地减少，野生资源锐减，处于濒危状态[6]，被《国家重点保护野生植物名录》(第二批)列为二级保护植物[7]。为解决金线莲资源紧张问题，设施栽培、林下种植和盆栽等人工栽培模式被应用于金线莲的种植。本实验通过测定不同栽培方式下的金线莲体内外抗氧化能力并进行比较，筛选出最优栽培方式，为金线莲大规模栽培提供理论依据。
2. 材料与仪器
2.1. 实验材料
“匠康1号”金线莲：瓶苗栽培、林下栽培、设施栽培；N2野生型秀丽隐杆线虫；大肠杆菌OP 50。
2.2. 实验试剂与仪器
氯化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、水杨酸、硫酸亚铁等试剂(上海生工)；
SOD、GSH-PX、CAT等试剂盒(南京建成)；
BMB 124电子分析天平(上海析平科学仪器有限公司)，T 6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，HH-601超级恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，Centrifuge 5430离心机(Eppendorf)，LGJ-10 FD真空冷冻干燥机(上海叶拓科技有限公司)等仪器。
3. 实验方法
3.1. 体外抗氧化能力测定
3.1.1. DPPH自由基清除能力测定
称取一定质量的不同栽培方式不同部位金线莲水提物干燥粉末，配制成1 mg/mL的样品液，参考XICAN LI. [8]的实验方法。
(1)
式中A0为空白对照吸光值，Ai为阴性对照组吸光值，Aj为样品组吸光值。
3.1.2. 羟自由基清除能力测定
参照童晨晓等[9]的方法并进行测定。
(2)
式中A0为空白对照吸光值，Ai为阴性对照组吸光值，Aj为样品组吸光值。
3.1.3. 还原能力测定
测定参照TERPINC等[10]的方法。
(3)
式中A0为空白对照吸光值，Ai为阴性对照组吸光值，Aj为样品组吸光值。
3.2. 体内抗氧化能力测定
3.2.1. 基于秀丽隐杆线虫的体内抗氧化能力测定[11] [12]
水提取物对秀丽隐杆线虫三种抗氧化酶活力水平的影响
参照张孟丽[13]的方法，将N2野生型秀丽隐杆线虫同步化后，暴露于1 mg/mL的不同栽培方式不同部位金线莲水提物中，24 h后测定秀丽隐杆线虫超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性[14] [15]。测定方法分别按照南京建成生物工程研究所生产试剂盒说明书要求严格进行。
3.2.2. 基于秀丽隐杆线虫寿命实验测定
水提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响
参照王晗等[16]方法，对秀丽隐杆线虫寿命进行测定。
水提取物对秀丽隐杆线虫咽部吞咽次数的影响
参照张晓寒等[17]方法对秀丽隐杆线虫咽部吞咽次数进行测定。
4. 实验结果与分析
4.1. 体外抗氧化能力测定
4.1.1. 不同栽培方式对金线莲清除DPPH自由基能力的影响
由图1可知，各组金线莲的DPPH自由基清除能力均小于Vc，其中林下叶部与设施叶部具有良好的DPPH自由基清除能力。采用SPSS软件进行分析，发现金线莲不同栽培方式下的叶部与杆部的DPPH清除率均存在显著差异(P < 0.05)，结果说明金线莲叶部的清除能力大于杆部。
4.1.2. 不同栽培方式对金线莲清除羟自由基能力的影响
清除羟自由基法可有效地测定反应体系中是否有羟自由基(·OH)清除剂[18]。由图2可知，各组金线莲的羟自由基清除能力均小于Vc。不同栽培方式下的金线莲叶和杆之间的羟自由基清除率具有较大的差异(P < 0.05)，结果说明相同栽培方式下的金线莲不同的部位清除羟自由基的能力也具有较大的差异。其中瓶苗叶部与设施杆部具有良好的羟自由基清除能力。
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 1. Comparison of DPPH·free radical scavenging ability
图1. DPPH自由基清除能力比较
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 2. Comparison of hydroxyl radical scavenging ability
图2. 羟自由基清除能力比较
4.1.3. 不同栽培方式对金线莲的还原能力的影响
由图3可知，不同栽培方式下的金线莲叶部与杆部不存在显著性差异(P > 0.05)。Vc的还原能力远大于各组金线莲的还原能力，但瓶苗杆部和林下叶部在还原能力比较中具有良好的表现。
4.2. 体内抗氧化能力测定
4.2.1. 不同栽培方式下的金线莲水提物对秀丽隐杆线虫三种抗氧化酶活力水平的影响
由图4~6可知，在SOD活力测定中，金线莲的叶部与杆部的SOD活力不存在显著性差异(P > 0.05)，其各组金线莲的SOD活力均小于对照组，但瓶苗杆部较其他各组而言SOD活力较弱；在GSH-PX活力测定中，不同栽培方式下的金线莲的叶部与不同栽培方式下的杆部的GSH-PX活力存在显著差异(P < 0.05)，只有设施叶部和设施杆部的GSH-PX活力大于对照组，说明其具有较强的GSH-PX活力；在CAT活力测定中，设施叶部与设施杆部、林下叶部与林下杆部的总CAT活力不存在显著差异(P > 0.05)，瓶苗叶部与瓶苗杆部的总CAT活力存在显著性差异(P < 0.05)。只有瓶苗杆部的CAT活力小于对照组，而设施叶部、杆部与林下叶部、杆部均具有较高的CAT活力。本次三个实验结果表明了，设施栽培方式下的金线莲的体内抗氧化能力最强，其次是林下栽培方式，最后是瓶苗栽培方式。
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 3. Comparison of restoration ability
图3. 还原能力比较
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 4. Comparison of SOD activity among different groups
图4. 各组SOD活力比较
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 5. Comparison of GSH-PX activity among different groups
图5. 各组GSH-PX活力比较
注：不同字母表示不同组别的抗氧化性差异(P < 0.05)。
Figure 6. Comparison of CAT activity among different groups
图6. 各组CAT活力比较
4.2.2. 不同栽培方式下的金线莲水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响
寿命是判断秀丽隐杆线虫抗衰老最直接的指标，由图7可知，通过比较给药后的线虫与空白对照组线虫的寿命证明了金线莲提取物具有一定的延长寿命的作用。在同一浓度下，设施栽培方式和林下栽培方式下的体内抗氧化能力均优于瓶苗栽培方式，设施栽培方式和林下栽培方式对线虫寿命的影响相近。
Figure 7. The effect on the lifespan of Caenorhabditis elegans
图7. 对秀丽隐杆线虫寿命的影响
4.2.3. 不同栽培方式下的金线莲水提物对秀丽隐杆线虫咽部吞咽次数的影响
由图8可知，通过观察线虫的吞咽频率证明了金线莲提取物具有一定延缓衰老的作用。在同一浓度下，设施栽培下的金线莲水提物所培养的秀丽隐杆线虫的吞咽频率明显大于其他几组，因此设施栽培方式下的体内抗氧化能力优于其他两组。而瓶苗栽培方式对其线虫吞咽频率的影响最小，其体内抗氧化能力最弱。
Figure 8. The effect on the swallowing of Caenorhabditis elegans
图8. 对秀丽隐杆线虫吞咽的影响
5. 结论
根据本次实验综合得出，金线莲在不同栽培方式下的抗氧化能力不同，其总体为金线莲叶部的抗氧化能力大于金线莲杆部，且设施栽培方式下的金线莲的抗氧化能力最优。对秀丽隐杆线虫而言，金线莲也表现出较好的抗衰老、延长寿命的作用。本次实验为金线莲栽培产业结构优化提供了实验基础，提升对金线莲药用价值的利用，促进金线莲产业发展，同时也为其他植株的相关探究提供参考。随着野生金线莲资源的减少，人工种植既能满足市场需求，又能保护野生资源，且种植者可以通过科学化、规模化的种植获得可观的经济收益，前景可观。随着科研技术的不断发展，金线莲的抗衰老能力逐渐成为研究热点，在抗衰老领域的发展前景十分广阔，有望为人类健康长寿带来新的希望。
基金项目
金华市科技计划自主设计项目2021-2-001b。
NOTES
*通讯作者。