基于网络药理学和分子对接探讨青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的作用机制

To Investigate the Mechanism of Action of Artesunate in the Treatment of Fungal Keratitis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

摘要: 目的：应用网络药理学方法探究青蒿琥酯(Artesunate, ART)治疗真菌性角膜炎(Fungal keratitis, FK)的作用机制。方法：通过SwissTagetPredictions数据库筛选青蒿琥酯的潜在作用靶点。采用GeneCards和OMIM数据库搜索与真菌性角膜炎相关的靶点。将数据合并去重后取药物靶点和疾病靶点的交集，获取青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的潜在作用靶点，应用Venny2.1平台绘制韦恩图。采用Cytoscape软件构建“青蒿琥酯–真菌性角膜炎–靶点”网络图。将交集靶点导入STRING数据库构建PPI蛋白互作网络并结合拓扑学分析筛选关键靶点。随后通过基因本体(GO)功能富集、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析对交集靶点进一步细化研究，最后使用Autodock软件对关键靶点与作用的活性化合物进行分子对接。结果：网络药理学，筛选青蒿琥酯作用靶点110个；筛选真菌性角膜炎靶点1809个；预测得到青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的潜在作用靶点共34个；蛋白互作网络分析发现，EGFR、STAT3、MMP9、SRC和STAT3可能是青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的核心靶点；经GO富集分析得到673个细胞生物学过程，主要涉及细胞对化学刺激的反应、细胞对氧化应激以及对非生物刺激的反应等生物学过程；KEGG通路富集分析获得79条相关信号通路，主要包括Relaxin、FoxO、TNF、HIF-1、Notch、Rap1等信号通路；分子对接结果显示，青蒿琥酯与EGFR的结合稳定性最好，与STAT3、MMP9、SRC和STAT3的结合比较稳定。结论：青蒿琥酯可能作用于EGFR、STAT3、MMP9、SRC和STAT3等靶点，通过Relaxin、FoxO、TNF、HIF-1、Notch、Rap1信号通路等发挥治疗真菌性角膜炎的作用。

Abstract: Objective: To investigate the mechanism of Fungal keratitis (FK) treated with artesunate (ART) by network pharmacology. Methods: Screening potential targets of ART using SwissTagetPredictions database. GeneCards and OMIM databases were used to search for targets associated with fungal keratitis. The intersection of drug targets and disease targets was obtained by combining the data and removing the data, and the potential targets of ART in the treatment of fungal keratitis were obtained. The Venny 2.1 platform was used to draw the Wayne map. The network diagram of “Artesunate-fungal keratitis-Target” was constructed by Cytoscape software. The intersection targets were imported into STRING database to construct PPI protein interaction network, and the key targets were screened by topological analysis. The intersection targets were further studied by gene ontology (GO) functional enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis. Finally, Autodock software was used to perform molecular docking between key targets and active compounds. Results: 110 targets of ART were screened by network pharmacology. A total of 1809 targets of fungal keratitis were selected. A total of 34 potential targets of ART were predicted for the treatment of fungal keratitis. Protein interaction network analysis showed that EGFR, STAT3, MMP9, SRC and STAT3 may be the core targets of ART in the treatment of fungal keratitis. By GO enrichment analysis, 673 cell biological processes were obtained, which mainly involved cell response to chemical stimulation, cell response to oxidative stress and cell response to abiotic stimulation. KEGG pathway enrichment analysis obtained 79 related signaling pathways, including Relaxin, FoxO, TNF, HIF-1, Notch, Rap1 and other signaling pathways. Molecular docking results showed that ART had the best binding stability with EGFR, and was stable with STAT3, MMP9, SRC and STAT3. Conclusion: ART may act on EGFR, STAT3, MMP9, SRC and STAT3, and has therapeutic effects on fungal keratitis through Relaxin, FoxO, TNF, HIF-1, Notch and Rap1 signaling pathways.

1. 引言

真菌性角膜炎(Fungal keratitis, FK)是一种严重的感染性角膜病，会引起角膜损伤和眼内炎，严重导致视力丧失[1]。真菌性角膜炎的发病率呈逐年上升趋势。真菌性角膜炎的主要病原体是镰刀菌和曲霉菌。创伤、免疫功能减弱、眼表疾病和佩戴隐形眼镜是导致真菌性角膜炎的主要原因[2]。真菌性角膜炎药物治疗的难点在于药物渗透性有限、生物利用度低、药代动力学特性差和角膜毒性，以及仅能杀灭病原体并不能有效地抑制过度的炎症反应[3]。因此，寻找具有新的药物对临床治疗至关重要。

青蒿琥酯是一种常用的抗寄生虫药，系具有倍半萜内酯结构的青蒿素的衍生物。近年来，研究发现青蒿琥酯在多脏器系统、病毒感染等方面都有良好的抗炎效果，主要通过作用于NF-κB、Nrf2、PI3K/Akt/mTOR、TLR4/MyD88等信号通路，涉及凋亡信号转导、介导免疫调节、改善氧化应激等作用[4]。Wang等人的研究发现，青蒿琥酯可通过剂量依赖性地抑制炎症因子的产生来抑制葡萄膜炎炎症反应[5]。Zhao等人的研究发现，青蒿琥酯激活CD71途径被内化到细胞中，降低细胞膜CD71的水平，阻止铁的吸收，发挥抗视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)的作用[6]。青蒿琥酯被证实可以抑制烟曲霉的活性对抗烟曲霉感染[7]。综合上述，我们推测青蒿琥酯在真菌性角膜炎的治疗方面具有潜力。然而，尚未有研究证实青蒿琥酯能够在真菌性角膜炎中发挥治疗作用。

在本项研究中，我们运用了生物信息学的数据库与在线分析工具来获取并解析青蒿琥酯、真菌性角膜炎的靶点等相关信息，以预测其潜在的关联，从而预测药物的治疗效果，通过构建“青蒿琥酯–真菌性角膜炎–靶点”的网络图，探究青蒿琥酯对于真菌性角膜炎的潜在的治疗机制。本研究运用生物信息学的数据库与在线分析工具初步探索青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的核心靶点和作用机制，通过GO和KEGG分析寻找青蒿琥酯潜在作用靶点的关键通路，使用分子对接技术进行验证，以此深入了解重要靶点与抗真菌和抗炎作用的关联。研究结果为进一步理解真菌性角膜炎的发病机制和制定新的治疗策略提供理论支持。

2. 材料与方法

2.1. 青蒿琥酯及真菌性角膜炎相关靶点筛选

以青蒿琥酯为关键字使用PubChem查询。将查出的Canonical SMILES在SwissTagetPredictions数据库进行靶点查询并导出结果。筛选出数据库中得到的结果可能性大于0的结果。在GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://omim.org/)数据库中获取真菌性角膜炎对应基因，将数据库数据合并去重。

2.2. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎潜在作用靶点Venn分析

药物靶点与疾病靶点的交集靶点，即为青蒿琥酯治疗在真菌性角膜炎的潜在作用靶点。在venny2.1中分别导入真菌性角膜炎和青蒿琥酯对应基因取交集并保存Venny图，对青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎靶点进行可视化处理。

2.3. 青蒿琥酯调控网络的构建

收集核心交集靶点数据导入Cytoscape3.9.1 (https://cytoscape.org/)，构建“青蒿琥酯–真菌性角膜炎–靶点”网络。

2.4. PPI蛋白互作网络的构建及核心靶点筛选

将2.2中获得的潜在的相关靶蛋白上传到网上软件String数据库中，将“species”选择为“Human”，构建蛋白质–蛋白质相互作用网络图。蛋白质–蛋白质相互作用包括由String预测的蛋白质之间的直接和间接相互作用，并对每个蛋白质相互作用信息进行评分和计算。得分越高，蛋白质相互作用强度越高。从String数据库中导出节点A、节点B、Combined score，将结果导入Cytoscape 3.10.0软件进行可视化分析，得到网络分析结果。设置网络中节点大小，颜色、度值、大小等反映综合得分，建立蛋白质相互作用网络图。

2.5. GO富集分析和KEGG通路富集分析

对于基因的细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)和基因功能分别采用GO (Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)进行分析。运用RStudio软件包“ggplot2”、“clusterProfiler”、“enrichplot”、“org.Hs.eg.db”，对治疗真菌性角膜炎的潜在靶点进行基因本位(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyto Encyclopediaof Genes and Genomes, KEGG)分析。以P.adj < 0.05为过滤条件得到最终富集结果，并对结果进行可视化。

2.6. 青蒿琥酯与主要靶点的分子对接

依据Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找青蒿琥酯的3D结构，并借用OpenBabel3.1.1 (http://openbabel.org/)保存为mol2格式。基于RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)查找核心靶点的蛋白晶体结构，利用PyMOL2.5 (https://pymol.org/)软件对其进行剥离溶剂及配体、增添极性氢离子等处理，导出为pdb格式。最后利用AutoDock软件(https://autodock.scripps.edu/)软件进行分子对接分析。计算出配体和受体之间的结合能力，并用Pymol软件进行可视化分子对接结果。

3. 结果与分析

3.1. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的靶点预测

通过R语言中venn包，将青蒿琥酯的预测靶点与在真菌性角膜炎靶点相匹配获取交集靶点，绘制韦恩图，结果药物与疾病之间共有34个核心靶点(图1)。

Figure 1. Venn diagram of ART and FK targets

图1. 青蒿琥酯和真菌性角膜炎靶点的Venn图

3.2. 青蒿琥酯调控网络的构建

将青蒿琥酯与真菌性角膜炎预测到共有的34个核心靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建“Artesunate-Fungal keratitis-靶点”网络(图2)。

3.3. 蛋白互作(Protein-Protein Interaction, PPI)网络的构建及核心靶点筛选

将筛选出的34个青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的潜在靶点导入String数据库，限定物种为Human，生成蛋白互作网络(图3)。应用Cytoscape软件进行可视化分析，并根据节点度值筛选出潜在的核心作用基因(表1)。此过程旨在逐步筛选关键靶点，即青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的关键靶点。

Figure 2. “Drug-Disease-Target” network of ART in the treatment of FK

图2. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的“药物–疾病–靶点”网络图

Figure 3. PPI networks of potential targets of artesunate for the treatment of fungal keratitis

图3. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎潜在靶点的PPI网络

Table 1. Target genes of artesunate in treatment of Fungal keratitis

表1. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的靶点基因

靶基因蛋白	介数中心性	接近中心性	度值
EGFR	189.461	0.750	23
STAT3	77.247	0.702	20
MMP9	65.468	0.673	18
SRC	119.260	0.635	18
CASP8	29.432	0.611	16
PARP1	16.939	0.600	15
CASP1	98.446	0.600	15
MMP2	41.589	0.611	14
MAPK14	21.143	0.559	13
EP300	18.246	0.559	12
CTSB	81.556	0.569	12
PIK3CA	19.390	0.541	12
GZMB	13.104	0.541	11
CREBBP	15.011	0.550	11
MET	115.844	0.559	10
CXCR2	8.253	0.532	10
ITGB1	12.068	0.550	10
ACE	64.319	0.541	9
MMP3	3.257	0.500	8
ELANE	3.531	0.485	8
PPARD	65.998	0.508	7
CTSG	3.892	0.485	7
DDR2	1.309	0.471	5
BTK	0.548	0.471	4
CSNK2A1	0.000	0.429	4
PLEC	0.000	0.458	3
DHFR	0.000	0.434	3
PTGDR2	0.000	0.393	2
PSEN2	3.560	0.388	2
PSEN1	2.610	0.375	2
CYP1A2	67.543	0.384	1
CYP2C9	6.976	0.375	1
DGAT1	0.000	0.340	1
STS	0.000	0.280	1

3.4. 青蒿琥酯与关键靶点的分子对接结果

将青蒿琥酯与排名前5位关键靶点进行分子对接，分子对接结果见图4，所对应的结合能见表2。结果显示，青蒿琥酯与EGFR的结合稳定性最好，结合能为−9 kJ·mol⁻¹；青蒿琥酯与STAT3、MMP9、SRC和CASP8的结合比较稳定，其结合能均小于−9 kJ·mol⁻¹。

Figure 4. Schematic diagram of molecular docking

图4. 分子对接示意图

Table 2. Binding energy between artesunate and key target proteins

表2. 青蒿琥酯与关键靶蛋白之间的结合能

化合物	靶点	结合能(kJ·mol^−1)
Compound	Target	Binding energy
青蒿琥酯	EGFR	−9.1
	STAT3	−7.0
	MMP9	−7.4
	SRC	−7.1
	CASP8	−8.0

3.5. GO富集分析

利用R4.1.1软件将筛选出的34个青蒿琥酯治疗在真菌性角膜炎的靶点进行GO富集分析，共获得673个细胞生物学过程。其中生物过程(Biological process) 577个，细胞组分(Cellular component) 43个，分子功能(Molecular function)53个。在图5中，GO功能分析的生物过程、细胞组分和分子功能的前10项过程以柱状图形式呈现(P < 0.05)。生物过程中，包含细胞对化学压力的反应、对紫外线的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对非生物刺激的反应、细胞对环境刺激的反应、细胞对氧化应激的反应、对氧化应激的反应、对活性氧的反应、对光刺激的反应、细胞对紫外线的反应。细胞组分涉及膜阀、膜微区、肽酶抑制剂复合物、纤毛细根、神经肌肉节点、肌节、褶皱膜、肌原纤维、焦点粘附、含胶原蛋白的细胞外基质。分子功能涵盖肽链内切酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白络氨酸激酶活性、胶原蛋白结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、金属内肽酶活性、转录辅助因子结合。

Figure 5. GO enrichment analysis results of ART in the treatment of FK (Top 10)

图5. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎靶点GO富集分析结果(排名前10)

3.6. KEGG通路分析

利用R4.1.1软件应用R语言包对筛选出的34个青蒿琥酯治疗在真菌性角膜炎的关键靶点进行了KEGG富集分析，共识别出79条通路。通过Bioconductor中的R包，绘制了排列前30的KEGG Pathway的气泡图(图6) (P < 0.05)。这些通路涵盖了Relaxin、FoxO、TNF、HIF-1、Notch、Rap1信号通路和细胞凋亡在内的关键生物学过程。

Figure 6. KEGG analysis results of ART targets for FK (Top 30)

图6. 青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎靶点的KEGG分析结果(排名前30)

4. 讨论

研究发现，青蒿琥酯可以增强糖尿病大鼠视网膜的自噬，Beclin-1表达和LC3II/I比值上调，p62下调以及激活AMPK/SIRT1信号通路，发挥抗炎、抗新生血管作用，在大鼠模型中发挥治疗糖尿病视网膜病变(DR)的作用[8]；此外，戴京京等人发现在鼠肺烟曲霉病模型中，青蒿琥酯可以抑制烟曲霉的活性并促进巨噬细胞清除烟曲霉菌[9]，骆万婷等人也发现，青蒿琥酯在具有较好的抗真菌活性[10]。综合上述研究结果，我们猜测青蒿琥酯通过抗真菌和抑制过度炎症在治疗真菌性角膜炎的发挥作用。疾病数据库中收集了真菌性角膜炎疾病目标，发现在真菌性角膜炎和去青蒿琥酯有34个共同靶点，被认为是青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的潜在靶点。利用STRING数据库构建蛋白互作网络并进行网络拓扑学分析，研究发现EGFR、STAT3、MMP9、SRC和CASP8可能是青蒿琥酯发挥治疗真菌性角膜炎作用的核心靶点。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，参与细胞增殖和信号传导。Liu等人的研究[11]发现，烟曲霉菌感染可以激活EGFR，刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生，增强HSAE细胞对烟曲霉菌的体外内吞作用。有研究[12]显示白色念珠菌侵袭宿主细胞，诱导活化EGFR-ERK1/2-c-Fos途径，介导GM-CSF和G-CSF的释放。STAT3作为炎症因子和生长因子的下游细胞内效应因子，调控细胞增殖、迁移、凋亡等基本过程[13]。研究显示，STAT3参与调节慢性炎症，阻断STAT3信号可显著降低NLRP3炎性体激活和NLRP3相关炎症[14]。IL-17的产生被认为是抗真菌免疫的重要机制，STAT3参与调节Th17细胞分化和功能[15]。值得关注的是，多种类型的免疫细胞中缺乏STAT3可能会增加对烟曲霉的易感性，如在B细胞中，STAT3缺乏会损害T细胞依赖性IgG应答，在巨噬细胞中缺乏STAT3会影响IL-10的产生[16]。MMP-9能促进角膜感染中新生血管的形成，抑制MMP-9的表达可减轻感染性角膜炎引起的角膜破坏和血管生成[17]。真菌感染过程中，Dectin-1识别真菌表面的β-葡聚糖，介导SYK和SRC信号转导通路，调节下游细胞因子的释放发挥对抗真菌的能力[18]。SRC酪氨酸激酶也参与调控曲霉孢子的吞噬过程[19]。Caspase-8被认为是凋亡信号的启动者，通过激活细胞凋亡途径和抑制抑制NLRP3炎性小体的激活发挥抗炎作用[20]。阻断caspase-8，可以降低MIP-1和MCP-1的表达，减少巨噬细胞的募集，抑制VEGF-A、TNF-α和IL-1β的表达，抑制角膜炎症表达以及新生血管生成[21]。结合上述关键靶点基因的作用，我们大胆推测青蒿琥酯能够发挥治疗真菌性角膜炎的作用。

GO富集分析结果表明，靶基因主要具有对刺激反应的调节、细胞外空间和酶活性等生物学功能。KEGG通路分析结果表明，青蒿琥酯在治疗真菌性角膜炎过程中涉及多条信号通路，主要包括Relaxin、FoxO、TNF、HIF-1、Notch、Rap1信号通路等。Relaxin介导许多生物作用，包括抗纤维化、血管扩张、血管生成、抗炎、抗凋亡和器官保护作用[22]。FoxO因子是胰岛素通路中的下游调节因子[23]，能与多种靶基因启动子结合，参与细胞能量的产生，恢复抗氧化应激的能力，以及调节细胞活力和增殖[24]。Li等人的研究[25]发现，在白色念珠菌感染小鼠模型中，HIF-1介导促炎巨噬细胞极化抵抗白色念珠菌的感染。Yao Ye等人研究[26]也发现，HIF-1因子通过抑制NLRP3/IL-1β信号通路，从而平衡Th和Treg细胞的分化偏向性，发挥控制和清除烟曲霉菌以及抑制过度的炎症反应的作用。有研究表明，抑制Notch信号通路，可以增强巨噬细胞对酵母菌的吞噬和清除作用[27]。Wang等人发现[28]，Rap1基因缺失改变了白色念珠菌细胞壁的组分完整性，影响了白色念珠菌生物膜的形成，抑制了巨噬细胞对孢子的识别和吞噬，降低相关炎症因子的表达，降低了白色念珠菌的毒力。

由此推测青蒿琥酯可能通过作用于上述通路，降低真菌负荷，抑制过度炎症反应，从而达到治疗真菌性角膜炎的效果。本研究仅使用现代生物信息学方法，通过使用网络药理学和分子对接方法探索青蒿琥酯在治疗真菌性角膜炎中的作用机制，但存在一定的局限性。一方面当前的网络信息技术还有待进一步完善，数据库数据的准确性和时效性还有待科学验证。另一方面研究还需要细胞实验以及动物实验进行验证。因此，本研究为青蒿琥酯的进一步开发和临床应用提供了重要的理论支持，也是进一步实验的研究基础。

5. 结论

本研究通过网络药理学和分子对接技术，初步探究了青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的潜在作用机制。该药物可能通过多组分、多靶点和多途径的方式发挥其药理作用。结果表明，青蒿琥酯主要作用于EGFR、STAT3、MMP9、SRC和CASP8等靶点，并调节Relaxin、FoxO、TNF、HIF-1、Notch、Rap1等信号通路等来治疗真菌性角膜炎。研究结果为进一步探索青蒿琥酯治疗真菌性角膜炎的作用机制提供了理论基础。然而，本研究也存在一些局限性，笔者仅通过数据库筛查和计算机模拟分析确定了作用靶点，尚未进行体内验证，因此，在后期研究中，需进一步通过细胞实验以及动物实验来证实其作用机制和效果。

NOTES

^*通讯作者。